查星琴 楊明華 李永能 趙素梅 黃英

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)黨委宣傳部，昆明 650201）

Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子（Signal transducer and activator of transcription，STAT）信號(hào)通路是一種細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，在細(xì)胞外信號(hào)從細(xì)胞膜向細(xì)胞核的下游傳遞過程中起著關(guān)鍵作用，包括炎癥、先天和后天免疫反應(yīng)，以及細(xì)胞生長等生物學(xué)過程能通過該信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)［1］。研究表明，Leptin 介導(dǎo)的JAK/STAT 信號(hào)通路的激活對(duì)促進(jìn)脂肪酸的分解有重要的調(diào)節(jié)作用［2］，但對(duì)其信號(hào)通路的研究目前主要集中在細(xì)胞、腫瘤和癌癥等方面的研究［3-4］，對(duì)脂類代謝調(diào)節(jié)的研究較少。Leptin 主要由脂肪組織合成和分泌，與其受體結(jié)合后，可激活多條信號(hào)通路，調(diào)節(jié)脂類代謝，其介導(dǎo)的JAK/STAT 信號(hào)通路是其中之一。本研究以100 ng/mL Leptin 處理豬皮下前脂肪細(xì)胞48 h，通過油紅O 染色，鑒定細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。采用Realtime PCR 方法檢測Leptin 對(duì)JAK/STAT 通路中各基因表達(dá)水平，并與細(xì)胞中甘油三酯和游離脂肪酸含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在闡明Leptin 介導(dǎo)JAK/STAT信號(hào)途徑調(diào)控脂肪代謝的分子機(jī)制，為深入開展調(diào)節(jié)脂類代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤購自Sigma 公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自hyclone 公司，Trizol 購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金公司；Real-time PCR 熒光定量試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；游離脂肪酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所；甘油三酯試劑盒購自北京北化康泰臨床試劑有限公司。一頭15 kg 仔豬由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)豬場提供。

1.2 方法

1.2.1 豬前體脂肪細(xì)胞分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 參照黃英等［5］操作方法分離豬前體脂肪細(xì)胞。細(xì)胞生長至80%左右匯合時(shí)，37℃使用0.25%的胰蛋白酶消化后進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞生長到60%融合后分為兩組，對(duì)照組加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液（誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液為：地塞米松0.25 μmol/L、胰島素10 mg/L 和1-甲基3-異丁基黃嘌呤 0.5 mmol/L），實(shí)驗(yàn)組加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液+100 ng/mL Leptin 處理48 h 后收集細(xì)胞，一部分細(xì)胞用于油紅O 染色鑒定和總RNA 提取，其余部分用于測定細(xì)胞中的甘油三酯和游離脂肪酸含量。

1.2.2 油紅O 染色 前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化48 h 后，用10%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS 清洗后晾干，加入0.5%油紅O 染液染色30 min，用PBS 漂洗殘留的油紅O 溶液，37℃干燥細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.3 甘油三酯和脂肪酸含量測定 用甘油三酯試劑盒和游離脂肪酸測試盒（NEFA）分別測定細(xì)胞中甘油三酯濃度和游離脂肪酸含量，操作步驟按照說明書進(jìn)行。

1.2.4 提取總RNA 用Trizol-A+Reagent 分別提取誘導(dǎo)48 h 后脂肪細(xì)胞的總RNA，用核酸蛋白定量儀測定RNA 的濃度及純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。

1.2.5 Real-Time PCR 反應(yīng)及條件 使用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，各取2 μg 總RNA，反應(yīng)體系為20 μL：1 μL EasyScript RT/RI Enzyme Mix、10 μL 2×ES Reaction Mix、1 μL Anchored Oligo（dT），DEPC 水補(bǔ)至20 μL。42℃孵育30 min 之后85℃加熱5 min，獲得的cDNA 產(chǎn)物保存于-20℃中備用。

從GenBank 數(shù)據(jù)庫中檢索豬瘦素受體（Leptin receptor，LepR），Janus 激酶2（Janus kinase-2，JAK2），信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（Signal transducer and activator of transcription-3，STAT3），肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（Carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1），脂酰基輔酶A 氧化酶1（Acyl-coenzyme A oxidase，ACOX1），過氧化體增殖活化受體γ 輔助活化因子（Peroxisome proliferators activated receptor gamma coactivator-1，PGC-1α）和看家基因18S rRNA mRNA 序列，利用Primer Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，以18S rRNA 為內(nèi)參基因檢測基因的表達(dá)水平，引物序列見表1。

Real-time PCR 反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，10 mmol/L 上下游引物各0.4 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.5 μL 和ddH2O 7.7 μL。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包和Graphpad Prism 進(jìn)行分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并對(duì)平均值進(jìn)行方差分析，均值的多重比較采用Duncan 法進(jìn)行，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 內(nèi)參基因與目的基因的引物序列、產(chǎn)物長度和登陸號(hào)

2 結(jié)果

2.1 Leptin對(duì)前脂肪細(xì)胞形態(tài)變化的影響

觀察豬皮下前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化結(jié)果（圖1），發(fā)現(xiàn)不同濃度的Leptin 對(duì)前脂肪細(xì)胞形態(tài)變化無明顯影響。處理48 h 后，可見部分細(xì)胞開始分化，細(xì)胞內(nèi)可見少量球形脂滴。油紅O 染色結(jié)果顯示，Leptin 組比對(duì)照組著色細(xì)胞數(shù)多。

圖1 皮下前脂肪細(xì)胞油紅O 染色（×200）

2.2 Leptin對(duì)甘油三酯和游離脂肪酸合成的影響

Leptin 組中甘油三酯含量低于對(duì)照組并達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；Leptin 組中游離脂肪酸含量低于對(duì)照組（表2）。

2.3 JAK/STAT信號(hào)通路中基因的mRNA表達(dá)水平

Leptin 介導(dǎo)的JAK/STAT 信號(hào)通路中各基因mRNA 表達(dá)水平（圖2），Leptin 組LepR基因相對(duì)表達(dá)量增加了2.36 倍并達(dá)到顯著水平（圖2-A，P＜0.05），JAK2基因相對(duì)表達(dá)量增加了1.19 倍并達(dá)到顯著水平（圖2-B，P＜0.05），STAT3基因相對(duì)表達(dá)量增加了1.79 倍并達(dá)到顯著水平（圖2-C，P＜0.05），CPT-1基因相對(duì)表達(dá)量增加了2.73 倍并達(dá)到顯著水平（圖2-D，P＜0.05），ACOX1基因相對(duì)表達(dá)量增加了2.03 倍并達(dá)到顯著水平（圖2-E，P＜0.05），PGC-1α基因相對(duì)表達(dá)量增加了1.73 倍并達(dá)到顯著水平（圖2-F，P＜0.05）。

表2 甘油三酯和游離脂肪酸含量

2.4 JAK/STAT信號(hào)通路中基因mRNA表達(dá)水平與甘油三酯含量相關(guān)性分析

通路中各基因mRNA 表達(dá)水平與細(xì)胞中甘油三酯含量之間相關(guān)性分析結(jié)果（圖3）表明，LepR（圖3-A）、JAK2（圖3-B）、STAT3（圖3-C）、CPT-1（圖3-D）、ACOX1（圖3-E）和PGC-1α（圖3-F）基因的mRNA 表達(dá)水平與甘油三酯含量之間均存在顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

2.5 JAK/STAT信號(hào)通路中基因mRNA表達(dá)水平與游離脂肪酸含量相關(guān)性分析

通路中各基因mRNA 表達(dá)水平與細(xì)胞中游離脂肪酸含量之間的相關(guān)性分析結(jié)果（圖4）表明，LepR（圖4-A）、JAK2（圖4-B）、STAT3（圖4-C）、CPT-1（圖4-D），ACOX1（圖4-E）和PGC-1α（圖4-F）基因的mRNA 表達(dá)水平與游離脂肪酸含量之間均存在顯著負(fù)相關(guān)并達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

圖2 Leptin 介導(dǎo)JAK/STAT 信號(hào)通路中基因的mRNA 表達(dá)水平

3 討論

動(dòng)物脂肪沉積主要受脂類代謝和脂肪細(xì)胞分化兩方面的調(diào)節(jié)。脂肪組織中的脂肪沉積，主要由脂肪的攝取速度，脂肪酸的從頭合成，甘油三酯的合成，脂類降解和脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)等過程決定。脂類代謝包括甘油三酯代謝、膽固醇代謝、磷脂代謝以及脂類的運(yùn)輸，其中甘油三酯代謝尤為重要。動(dòng)物脂肪沉積的過程其實(shí)是脂肪前體細(xì)胞的增殖、分化并且生長肥大的過程。脂肪細(xì)胞在其分化的過程中根據(jù)脂滴的變化可將脂肪細(xì)胞大致分為脂肪前體細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞和成熟的脂肪細(xì)胞。脂肪前體細(xì)胞的形狀與成纖維細(xì)胞類似，為梭形，脂滴尚未出現(xiàn)，而前脂肪細(xì)胞則是脂滴剛剛出現(xiàn)，兩者之間并沒有嚴(yán)格區(qū)分，通常將這兩種細(xì)胞都稱為前脂肪細(xì)胞。前脂肪細(xì)胞在分化的早期有多個(gè)小脂滴貯存在脂肪細(xì)胞中，在胰島素等誘導(dǎo)因子的促進(jìn)下，這些小的脂滴逐漸向成熟的脂肪細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，逐漸融合成一個(gè)大的脂滴，開始合成甘油三酯，最后形成成熟的脂肪細(xì)胞，成熟的脂肪細(xì)胞一般是大顆粒脂滴充盈細(xì)胞的大部分，而位于周圍胞漿狹小區(qū)域的為稍微扁平的細(xì)胞核。脂泡是甘油三酯的儲(chǔ)藏庫，脂肪細(xì)胞內(nèi)脂泡的大小是脂肪組織成熟的一個(gè)重要參數(shù)，其大小反映了細(xì)胞的能量儲(chǔ)存和成熟程度。油紅O 染料是脂溶性的染料，在脂肪內(nèi)可高度溶解，使組織內(nèi)甘油三酯等中性脂肪特異性的著色，可使脂泡形成便于觀察的紅色小脂滴。脂肪前體細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化是受一系列轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的復(fù)雜過程［6］。

圖3 JAK/STAT 信號(hào)通路中基因mRNA 表達(dá)水平與甘油三酯含量相關(guān)性

3.1 Leptin對(duì)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯、游離脂肪酸含量的影響

脂肪即甘油三酯，是動(dòng)物體內(nèi)貯存能量的主要形式，在動(dòng)物新陳代謝中有著至關(guān)重要的作用。動(dòng)物體內(nèi)脂肪酸的合成主要來自兩條途徑，一是機(jī)體的自身合成，另一條途徑來源于肝臟脂肪酸的合成以及對(duì)腸道脂肪酸的吸收。動(dòng)物體內(nèi)脂肪的沉積過程是脂肪組織細(xì)胞內(nèi)脂肪的不斷合成、蓄積與脂肪不斷分化的過程［7-9］。因此，脂類代謝在動(dòng)物脂肪沉積中占有重要的地位。脂肪在動(dòng)物體內(nèi)的沉積是一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡過程，取決于脂肪酸的合成、分解及脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)等3 個(gè)過程，其中脂肪酸的合成與分解受酶促反應(yīng)的影響，與脂類代謝相關(guān)的酶基因和調(diào)控酶基因表達(dá)的機(jī)制己成為近年來關(guān)注的焦點(diǎn)。Leptin 對(duì)調(diào)節(jié)體內(nèi)甘油三酯的含量具有重要作用，Leptin 可增加脂肪酸氧化和甘油三酯的水解速度，同時(shí)抑制酯化作用［10］。在體外培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞中加入少量Leptin 可加速脂肪細(xì)胞的分化與增殖［11］，促使前脂肪細(xì)胞向成熟的脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Ramsay［12］研究表明，在培養(yǎng)基中加入100 ng/mL Leptin 處理豬脂肪細(xì)胞后，葡萄糖氧化、總脂合成及脂肪酸的合成降低并達(dá)到顯著水平，并可抑制胰島素對(duì)上述過程的促進(jìn)作用，顯著抑制了胰島素對(duì)糖代謝的影響，但對(duì)脂蛋白脂酶活性無影響。生物體內(nèi)脂肪酸的分解主要為β-氧化，β-氧化在線粒體基質(zhì)內(nèi)進(jìn)行。但長鏈脂肪酸不能透過線粒體內(nèi)膜，需要肉堿依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將其運(yùn)到線粒體基質(zhì)。CPT-1 催化長鏈脂酰CoA 與肉堿形成脂酰肉堿，是脂酰輔酶A 轉(zhuǎn)入線粒體進(jìn)行脂肪酸β-氧化的限速酶。CPT-1表達(dá)水平升高可促進(jìn)脂肪酸分解，降低其體脂肪的沉積量。ACOX1 可促進(jìn)脂肪酸在過氧化物酶體中的氧化，具有降低血清甘油三酯的作用［13］。ACOX1 參與過氧化物酶體β 氧化催化反應(yīng)的第一步，同時(shí)也是其限速酶。PGC-1α 為轉(zhuǎn)錄共激活因子，具有許多生理學(xué)的功能，如誘導(dǎo)線粒體增殖，促進(jìn)適應(yīng)性產(chǎn)熱，脂肪酸氧化等［14］。本研究表明，豬皮下前脂肪細(xì)胞中添加100 ng/mL Leptin，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量均顯著降低，游離脂肪酸含量降低，在誘導(dǎo)分化48 h 后，細(xì)胞中出現(xiàn)了脂滴，油紅O 紅染色后，可見脂滴著色并呈橘紅色。

圖4 JAK/STAT 信號(hào)通路中基因mRNA 表達(dá)水平與游離脂肪酸含量相關(guān)性

3.2 Leptin對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

研究表明，Leptin 除了在食欲調(diào)節(jié)和肥胖方面發(fā)揮作用外，還在脂肪細(xì)胞的代謝以及改變脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)分解中發(fā)揮著重要的作用［11］。通常，STAT 蛋白是不活躍的細(xì)胞質(zhì)蛋白，在細(xì)胞因子激活后，STAT 蛋白細(xì)胞因子/受體復(fù)合物通過STAT上的被磷酸化的SH2 結(jié)構(gòu)域與受體結(jié)合，同時(shí)自身被磷酸化，從而形成磷酸化的二聚體p-STAT。形成的p-STAT 同源二聚體或異源二聚體使STAT 蛋白能夠有效的轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，與DNA 上的STAT特定調(diào)節(jié)序列結(jié)合之后能夠調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄［2，15］。CPT-1、ACOX1、PGC-1α基因均為活化STAT3 調(diào)節(jié)的靶基因。即Leptin 體外誘導(dǎo)皮下前脂肪細(xì)胞，可以激JAK/STAT 信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)與脂肪分解相關(guān)基因如CPT-1、ACOX1、PGC-1α的表達(dá)。CPT-1和ACOX1 分別是脂肪酸在線粒體和過氧化物酶體中經(jīng)β 氧化途徑的限速酶，PGC-1α 為轉(zhuǎn)錄共激活因子，具有誘導(dǎo)線粒體增殖、促進(jìn)適應(yīng)性產(chǎn)熱、脂肪酸氧化等功能。另外，活化的STAT3 受核內(nèi)及胞質(zhì)的PTP 和細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子的負(fù)調(diào)控作用。CPT-1 位于線粒體外膜，通過過氧化物酶體增殖物激活受體、丙二酸單酰輔酶A、磷酸化P 脫磷酸化依賴的細(xì)胞骨架成分在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯及翻譯后水平接受調(diào)解，在能量代謝中起關(guān)鍵作用。而且胰島素可以通過誘導(dǎo)乙酰輔酶A 羧化酶（Acetyl CoA carboxylase，ACC）的活化和合成的丙二酸單酰CoA濃度的增加直接或間接抑制CPT-1 的作用。同時(shí)當(dāng)細(xì)胞中游離脂肪酸濃度升高時(shí)也可以促進(jìn)CPT-1 的表達(dá)。本研究表明，100 ng/mL Leptin 體外誘導(dǎo)皮下前脂肪細(xì)胞，均使LepR、JAK2、STAT3、CPT-1、ACOX1、PGC-1α基因的表達(dá)水平增強(qiáng)。皮下前脂肪細(xì)胞Letin 組LepR、JAK2、STAT3、CPT-1、ACOX1、PGC-1α基因相對(duì)表達(dá)量均高于Letin 組并達(dá)到顯著水平。說明了Leptin 具有促進(jìn)游離脂肪酸氧化，降低甘油三酯含量的作用。

3.3 JAK/STAT通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平與細(xì)胞甘油三酯、游離脂肪酸含量相關(guān)性分析

脂肪組織具有強(qiáng)大的內(nèi)分泌功能，能夠產(chǎn)生和分泌多種脂肪源性因子如白介素-6、脂聯(lián)素、Leptin等，影響脂肪組織本身乃至整個(gè)機(jī)體的能量代謝平衡。Leptin 是脂肪細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子之一，可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，抑制食欲，減少進(jìn)食量。并通過興奮交感神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)脂肪分解，產(chǎn)熱增加，從而降低機(jī)體脂肪含量。另外，Leptin 還有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、促血細(xì)胞和血管生成等方面［16］。Leptin 對(duì)脂肪細(xì)胞脂類代謝的調(diào)節(jié)主要是通過激活JAK/STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。甘油三酯主要在肝臟、脂肪組織和小腸粘膜上皮合成，其合成方式有甘油二酯和甘油一酯兩種途徑。其中甘油二酯合成甘油三酯是其脂肪細(xì)胞合成的主要途徑，脂肪酸的從頭合成提供了合成大部分甘油三酯所需要的脂肪酸。在機(jī)體需要時(shí)，甘油三酯被脂肪酶逐步水解為游離脂肪酸和甘油，游離脂肪酸經(jīng)一系列酶氧化分解產(chǎn)生能量供機(jī)體的需要。100 ng/mL Leptin 體外誘導(dǎo)皮下前脂肪細(xì)胞，啟動(dòng)了JAK/STAT 信號(hào)通路，使LepR、JAK2、STAT3、CPT-1、ACOX1、PGC-1α基因的相對(duì)表達(dá)量升高。其中CPT-1、ACOX1、PGC-1α基因均是脂肪分解代謝相關(guān)基因，其表達(dá)量的升高加快了脂肪酸的氧化。該信號(hào)通路激活之后，上調(diào)與脂肪分解的相關(guān)基因CPT-1、ACOX1和PGC-1α等的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了脂肪酸的分解，降低了細(xì)胞中甘油三酯的含量。本研究結(jié)果表明皮下前脂肪細(xì)胞中添加Leptin，細(xì)胞中甘油三酯、游離脂肪酸含量均降低。另外，本研究將JAK/STAT 信號(hào)通路中基因的相對(duì)表達(dá)量分別于細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量和游離脂肪酸含量進(jìn)行了相關(guān)性分析，皮下前脂肪細(xì)胞LepR、JAK2、STAT3、CPT-1、ACOX1、PGC-1α基因mRNA 表達(dá)水平與脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和游離脂肪酸的含量均呈負(fù)相關(guān)。這表明該基因在脂肪分解代謝過程中起到重要作用。

4 結(jié)論

Leptin 激活皮下前脂肪細(xì)胞中JAK/STAT 信號(hào)通路，上調(diào)其通路中相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸氧化，降低了甘油三酯含量。