丁嘉偉 蘇新堯 尹薪項(xiàng) 馬婷玉 王晚晴 向麗 馮寶民 王彩霞

（1. 大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116622；2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；3. 河北科為先生物科技有限公司，衡水053311；4. 北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023）

黃花蒿（Artemisia annuaLinn.），民間多稱青蒿，為一年生草本，菊科植物，莖直立，上部多分枝，具縱棱線。葉互生，莖中部的葉二回羽狀分裂，花蕾期采收，割取地上部分，切碎，曬干。青蒿具有清熱解暑、除蒸、截瘧功效。用于暑邪發(fā)熱，陰虛發(fā)熱，夜熱早涼，骨蒸勞熱，瘧疾寒熱，濕熱黃疸［1］。青蒿除含有抗瘧成分青蒿素、青蒿酯鈉、蒿甲醚等外，還含有青蒿酸、雙氫青蒿素、青蒿醇、青蒿乙素、左旋樟腦等，具有一定的降壓、平喘、解熱、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能等功效［2］?？汞懰幬锴噍锼丶磥?lái)自于黃花蒿，是中藥為數(shù)不多的一類新藥，其發(fā)現(xiàn)者屠呦呦先生也因此獲得諾貝爾獎(jiǎng)。盡管青蒿知名度高，但是其在中藥行業(yè)用量不大，除了作為青蒿素提取的原料藥外，在動(dòng)物養(yǎng)殖上有所應(yīng)用（如青蒿散）。青蒿素提取工藝成熟、價(jià)格透明，因此提取青蒿素一般多選擇含量高的青蒿品種（1.5%-1.8%）用于降低成本。整體看來(lái)，我國(guó)青蒿種植及青蒿素原料藥制備企業(yè)利潤(rùn)低，行業(yè)壓力大。在青蒿種植過(guò)程中，還有許多青蒿素等功效成分含量較低的青蒿，以及青蒿素提取產(chǎn)生的青蒿葉渣，不合理利用則會(huì)增加企業(yè)支出，造成青蒿資源浪費(fèi)。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)青蒿素能夠有效對(duì)抗乙型肝炎、血吸蟲(chóng)病、小細(xì)胞肺癌和耐藥性癌癥。青蒿作為粗飼料，因其具有特殊的香氣，適口性較好，不論豬、兔，夏季每天投喂200-400 g，能起到消除暑熱和健胃的作用，可使禽畜在炎熱天不掉膘，生長(zhǎng)繁殖正常，增重快，且疾病少［3］。作為動(dòng)物保健產(chǎn)品使用可提高動(dòng)物免疫力，明顯抑制雞球蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育［4-5］。因此研究并開(kāi)發(fā)上述青蒿及葉渣并積極尋求新的應(yīng)用，對(duì)延長(zhǎng)延伸青蒿保健產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)鏈具有重要意義。

目前市場(chǎng)上的青蒿類動(dòng)物藥多為復(fù)方含青蒿藥材直接粉碎制備，產(chǎn)品利用率有待進(jìn)一步提高。微生物尤其是益生菌發(fā)酵中藥，具有改善中藥苦味、降低藥材本身毒性等優(yōu)點(diǎn)，發(fā)酵過(guò)程破壞藥材細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有利于功效成分釋放提高其利用率，還有助于將大分子物質(zhì)降解為利用度更高的小肽、多糖等，增強(qiáng)動(dòng)物吸收，發(fā)酵中藥中的益生菌本身對(duì)于可調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道健康，促進(jìn)營(yíng)物質(zhì)的消化吸收。

本研究以青蒿葉和葉渣作為主要原料，采用微生物發(fā)酵模式，將青蒿葉和葉渣功效成分充分釋放，探索其作為動(dòng)物保健產(chǎn)品的可能性，旨為拓寬青蒿原料的應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)鏈提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 實(shí)驗(yàn)菌株保存于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥所1 樓實(shí)驗(yàn)室-80℃ 50%甘油管中。植物乳桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌均為益生菌，能夠改善動(dòng)物腸道內(nèi)環(huán)境；釀酒酵母菌、黑曲霉菌、里氏木霉菌有較好的發(fā)酵能力，常用在工業(yè)發(fā)酵中。實(shí)驗(yàn)所用菌株生物特性見(jiàn)表1。

1.1.2 試劑 氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、石油醚、丙酮、硫酸均購(gòu)買(mǎi)自北京化工廠有限責(zé)任公司；青蒿素及其衍生物標(biāo)品購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母粉購(gòu)自索萊寶公司；標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白購(gòu)自美國(guó)BD 公司；青蒿葉與青蒿葉渣均由廣西仙草堂有限責(zé)任公司提供。

1.1.3 儀器 恒溫振蕩器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)UV-5100B：上海精密儀器；GCMS-QP20：日本島津；微量XPE/微量分析天平：梅特勒托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；漩渦震蕩器Vortex-1：上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；真空濃縮機(jī)CONCENTRATOR PLUS：德國(guó)艾本德公司。

1.2 方法

1.2.1 種子液制備 里氏木霉、地衣芽孢桿菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、酵母菌和畢赤酵母菌菌液接種于30 mL LB（1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%氯化鈉）培養(yǎng)基中（比例1∶50），活化兩次。取第二次活化菌液接種于100 mL LB 培養(yǎng)基中（比例1∶50），37℃培養(yǎng)24 h，其中酵母菌和畢赤酵母菌30℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 培養(yǎng)基組成成分 7.5 g 青蒿葉/青蒿葉渣、2.5 g 玉米漿、1.25 g 豆粕、1.25 g 麥麩、80 mL 無(wú)菌水，121℃濕熱滅菌30 min。

1.2.3 發(fā)酵 里氏木霉、地衣芽孢桿菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌酵、酵母菌和畢赤酵母菌單一菌種菌液接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基中（比例1∶50），37℃發(fā)酵5 d，其中酵母菌和畢赤酵母菌培養(yǎng)基30℃發(fā)酵5 d，每組3 個(gè)平行，青蒿葉和葉渣組加入等體積滅菌蒸餾水。每24 h 測(cè)定一次OD600，繪制菌株生長(zhǎng)曲線。發(fā)酵結(jié)束后，樣品（105±2）℃烘干120 min，小型磨粉機(jī)粉碎至粉末，取0.2 g 粉末進(jìn)行粗蛋白含量測(cè)定，取3.0 g 粉末進(jìn)行粗纖維含量測(cè)定，取5.0 g 粉末進(jìn)行粗脂肪含量測(cè)定。

1.2.4 粗纖維、粗蛋白、粗脂肪和功效成分含量測(cè)定 粗纖維的測(cè)定依據(jù)GB6432-86 方法進(jìn)行［14］，粗脂肪的測(cè)定依據(jù)GB6433-1994 方法進(jìn)行［15］，粗蛋白測(cè)定采用雙縮脲法進(jìn)行［16］。

青蒿素、青蒿乙素、雙氫青蒿酸、青蒿酸提取及測(cè)定：準(zhǔn)確稱取0.1 g 樣品放入50 mL 離心管，離心管中加入10 mL 石油醚，超聲萃取1 h，室溫靜置30 min，取9 mL 上清液，減壓濃縮制干［17］。GC-MS對(duì)青蒿素及其功效成分進(jìn)行分析鑒定［18］，所用色譜儀為島津氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-QP2010，色譜柱為HP-5（30 mm×0.25 mm×0.25 mm），離子源為EI 源，離子源溫度溫度，280℃；載氣氦氣流速1.5 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃，分流進(jìn)樣，分流比1∶1，進(jìn)樣量1 μL；柱箱程序升溫起始溫度100℃，保持1 min；然后以6℃/min 的速度升溫至220℃，保持3 min 后以30℃/min 的速度升溫至280℃，保持5 min；質(zhì)譜掃描范圍35-500 m/z。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用x-±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用LSD-t 法，P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 供試菌種及其特性

2 結(jié)果

2.1 菌株生長(zhǎng)曲線結(jié)果分析

如圖1 所示，青蒿葉和葉渣經(jīng)菌株發(fā)酵后，整體呈上升-平穩(wěn)-下降的趨勢(shì)。發(fā)酵菌株對(duì)數(shù)期主要集中于24-72 h，72 h 后培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)快速消耗，不足以維持菌株整體的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，OD600逐漸下降，其中里氏木霉和植物乳桿菌菌株生長(zhǎng)情況最好。

2.2 青蒿葉和葉渣粗脂肪、粗蛋白、粗纖維含量測(cè)定

如圖2 示，粗蛋白和粗脂肪含量整體呈上升趨勢(shì)，粗纖維含量整體呈下降趨勢(shì)。發(fā)酵前后粗蛋白含量對(duì)比，釀酒酵母菌發(fā)酵青蒿葉后粗蛋白含量提高了75.59%（P＜0.05），提高最多，其次是地衣芽孢桿菌，其發(fā)酵后粗蛋白含量提高了69.28%（P＜0.05）；發(fā)酵前后粗脂肪含量對(duì)比，植物乳桿菌發(fā)酵青蒿葉后粗脂肪含量提高106%（P＜0.05），提高最多，其次是黑曲霉菌，發(fā)酵后其粗脂肪含量提高了74.32%（P＜0.05）；發(fā)酵前后粗纖維含量對(duì)比，枯草芽胞桿菌發(fā)酵后粗纖維含量降低了43.30%（P＜0.05），降低最多，其次是枯草芽孢桿菌，發(fā)酵后粗纖維含量降低了42.10%（P＜0.05）。發(fā)酵青蒿葉渣后粗蛋白含量對(duì)比，釀酒酵母菌發(fā)酵后粗蛋白含量提高了85.30%（P＜0.05），提高最多，其次是畢赤酵母菌，其發(fā)酵青蒿葉渣后粗蛋白含量提高了44.60%（P＜0.05）；植物乳桿菌和干酪乳桿菌粗脂肪含量提高了87.73%（P＜0.05），提高最多，其次是黑曲霉菌，發(fā)酵后粗脂肪含量提高了57.60%（P＜0.05）；枯草芽孢桿菌發(fā)酵后粗纖維含量降低了55.67%（P＜0.05），降低最多，其次是里氏木霉菌，發(fā)酵青蒿葉渣后粗纖維含量降低了43.04%（P＜0.05）。綜合上述數(shù)據(jù)看，說(shuō)明釀酒酵母菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌在對(duì)粗蛋白、粗脂肪提高以及粗纖維降低方面最好，可用于發(fā)酵生產(chǎn)。

圖1 青蒿葉（A）和青蒿葉渣（B）發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)曲線

2.3 青蒿葉和葉渣發(fā)酵前后功效成分含量

青蒿葉和葉渣發(fā)酵后通過(guò)GC-MS 檢測(cè)，與混合標(biāo)準(zhǔn)品相比，青蒿發(fā)酵產(chǎn)物分別在14.914、15.470、18.848、19.334 min 出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品相同質(zhì)譜圖的新峰，見(jiàn)圖3 所示，比較青蒿發(fā)酵前后功效成分含量變化。

如圖4 所示，青蒿葉發(fā)酵后，雙氫青蒿酸、青蒿酸、青蒿乙素和青蒿素4 種功效成分含量顯著升高。與對(duì)照組比，枯草芽孢桿菌發(fā)酵后雙氫青蒿酸含量提高了86.01%（P＜0.05），地衣芽孢桿菌發(fā)酵后青蒿酸含量提高了21.49%（P＜0.05），黑曲霉菌發(fā)酵后青蒿乙素和青蒿素含量分別提高了88.06%（P＜0.05）、133.27%（P＜0.05）。黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌發(fā)酵青蒿葉后，青蒿4 種功效成分含量提升顯著。

如圖5 所示，青蒿葉渣發(fā)酵后，雙氫青蒿酸和青蒿乙素兩種功效成分整體呈上升趨勢(shì)。與對(duì)照組比較，枯草芽孢桿菌發(fā)酵后其雙氫青蒿酸含量提高了71.91%（P＜0.05），地衣芽孢桿菌發(fā)酵后其青蒿乙素含量提高了94.71%（P＜0.05）。青蒿葉渣經(jīng)枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌發(fā)酵后，產(chǎn)物中青蒿成分含量提升明顯，地衣芽孢桿菌具有獨(dú)特的奪氧機(jī)制，不適合與好氧菌進(jìn)行混合發(fā)酵。

3 討論

微生物發(fā)酵青蒿葉和葉渣，提高了粗蛋白、粗脂肪及青蒿素等功效成分含量，降低了粗纖維含量，使青蒿葉和葉渣中的功效成分得到充分釋放，增加了作為動(dòng)物保健產(chǎn)品的可能性，為拓寬青蒿原料的應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)鏈提供理論依據(jù)。

中藥發(fā)酵產(chǎn)物作為動(dòng)物飼料添加劑方面的應(yīng)用價(jià)值較高，趙帥等［19］研究發(fā)現(xiàn)杜仲具有提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì)等多種功能，在日糧中添加發(fā)酵杜仲葉粉0.3%飼喂海蘭褐蛋雞，能夠顯著提升產(chǎn)蛋率2.7%，同時(shí)蛋重提高0.6%。喬宏興等［20］使用植物乳桿菌和屎腸球菌對(duì)中藥黃芪進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后產(chǎn)物作為飼料添加劑飼喂斷奶仔豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.6%發(fā)酵黃芪添加組斷奶仔豬的平均采食量顯著提高，證明發(fā)酵黃芪產(chǎn)物對(duì)斷奶仔豬有明顯的促生長(zhǎng)作用。何玉華等［21］發(fā)現(xiàn)，在雉雞日糧中添加發(fā)酵水飛薊殘?jiān)?，可提高其采食量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率。根據(jù)中藥在飼料添加劑方面的應(yīng)用價(jià)值與前景，探索開(kāi)發(fā)青蒿葉和葉渣發(fā)酵產(chǎn)物作為動(dòng)物保健品。

圖2 青蒿葉發(fā)酵后中粗蛋白（A）、粗脂肪（C）、粗纖維含量（E）、以及青蒿葉渣發(fā)酵后中粗蛋白（B）、粗脂肪（D）、粗纖維（F）含量

圖3 發(fā)酵產(chǎn)物中青蒿素等化合物GC-MS 分析確定

圖5 青蒿葉渣發(fā)酵后中雙氫青蒿酸（A）、青蒿乙素（B）含量

探索開(kāi)發(fā)青蒿葉和葉渣發(fā)酵產(chǎn)物作為動(dòng)物保健品，功效成分含量的多少對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育其關(guān)鍵性作用。飼料中粗纖維含量多少同樣影響著動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，粗纖維含量低，使飼料體積減小，功效成分含量提高，普遍適口性好［22］。里氏木霉、枯草芽孢桿菌能在含有青蒿葉和葉渣的培養(yǎng)基中較好生長(zhǎng)，可產(chǎn)生大量的纖維素酶、糖化酶、淀粉酶及植酸酶等酶類，有利于細(xì)胞壁的破碎，從而使青蒿葉和葉渣中的功效成分得到充分釋放［23］。粗蛋白在機(jī)體內(nèi)以多種小分子蛋白、游離氨基酸和肽發(fā)揮作用，是機(jī)體內(nèi)重要的營(yíng)養(yǎng)元素，可提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)氧化分解功能。釀酒酵母菌以及植物乳桿菌等自身含有大量多種蛋白質(zhì)、氨基酸、微生物等多種營(yíng)養(yǎng)成分，常用于工業(yè)飼料領(lǐng)域，可大量提高發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量。李漠等［24］研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中粗蛋白含量升高，貉血清中游離的蘇氨酸、蛋氨酸、賴氨酸等總氨基酸含量均明顯升高，有利于貉的生長(zhǎng)發(fā)育，為冬毛期獲得大張幅皮張奠定基礎(chǔ)。粗脂肪含量是判定飼料產(chǎn)品質(zhì)量和等級(jí)的重要指標(biāo)。根據(jù)菌株生長(zhǎng)曲線可知，植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況較好，能夠快速生長(zhǎng)并積累大量的粗脂肪。植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌作為益生菌具有調(diào)節(jié)免疫力，抑制致病菌，降低血清膽固醇含量和預(yù)防心血管疾病，維持腸道內(nèi)菌群平衡等保健作用。

綜上所述，黑曲霉菌發(fā)酵青蒿葉和葉渣使青蒿素和青蒿乙素含量提高最多，但是在發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生黑曲霉毒素，需要引起注意。釀酒酵母菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌在粗蛋白、粗脂肪提高以及降低粗纖維方面較好，可用于發(fā)酵生產(chǎn)。青蒿葉和葉渣通過(guò)微生物發(fā)酵模式，可大幅度提高功效成分含量，充分發(fā)揮藥用價(jià)值，探索開(kāi)發(fā)新的產(chǎn)品應(yīng)用于多領(lǐng)域當(dāng)中，可使中藥資源得到充分利用。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)微生物液態(tài)發(fā)酵青蒿葉和葉渣，發(fā)酵后粗蛋白、粗脂肪、青蒿素、雙氫青蒿酸、青蒿乙素和青蒿酸的含量均較對(duì)照組有所提高，粗纖維含量均較對(duì)照組有所降低。青蒿葉和葉渣經(jīng)釀酒酵母菌發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白含量均最高，經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后產(chǎn)物中粗脂肪含量均最高，經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后產(chǎn)物中粗纖維含量均降低最多。該研究結(jié)果為今后進(jìn)一步探索工廠化發(fā)酵生產(chǎn)青蒿動(dòng)物保健產(chǎn)品提供參考依據(jù)。