李玲 楊麗霞 郭梅

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384）

成熟果實(shí)為人們提供日常生活所需的營(yíng)養(yǎng)。果實(shí)成熟包括一系列的生理代謝過(guò)程，在分子層面上果實(shí)的生長(zhǎng)、發(fā)育及成熟是由許多轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)單獨(dú)或者協(xié)同調(diào)控特定的下游基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的［1］。SPL（SQUAMOSA promoter-binding protein-like）是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子，參與植物葉、花和果實(shí)發(fā)育，發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)化，植物激素和光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，花青素合成，逆境脅迫等過(guò)程［2-12］。SPL7 和SPL14 分別通過(guò)配置銅元素和控制病原抗性來(lái)調(diào)節(jié)植物的脅迫應(yīng)答［13］。SPL 調(diào)控植物孢子產(chǎn)生和雌雄配體發(fā)育［14］。大多數(shù)SPL基因具有miR156/157 結(jié)合位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄后水平受其調(diào)控［15-17］。miR156 調(diào)控?cái)M南芥SPL3基因進(jìn)而在翻譯后抑制SPL3 蛋白［17］。miR156/157 的靶基因SPL在番茄莖尖、花和果實(shí)中高效表達(dá)［18］。Wang等［19］發(fā)現(xiàn)SPL 通過(guò)MADS box基因調(diào)控植物開(kāi)花時(shí)間，提高SPL基因表達(dá)水平有助于MADS-box基因家族的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)開(kāi)花。

CNR 是SPL 轉(zhuǎn)錄因子家族中一個(gè)比較特殊的成員，已經(jīng)被證明在果實(shí)的發(fā)育和成熟過(guò)程中起很重要的作用。Manning 等［20］通過(guò)使用定點(diǎn)克隆的方法，在第2 條染色體長(zhǎng)臂上發(fā)現(xiàn)LeSPL-CNR基因。LeSPL-CNR基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生表觀遺傳變異會(huì)影響果皮類(lèi)胡蘿卜素生物合成和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致果實(shí)不能正常成熟［20］。番茄突變體Cnr（Colourless non-ripening）果實(shí)表現(xiàn)出不成熟性狀，果皮為黃色，果實(shí)類(lèi)胡蘿卜素合成量減少，果實(shí)不會(huì)變軟，與成熟相關(guān)酶基因的表達(dá)也受到影響［21-22］。Cnr突變體的多聚半乳糖醛酸酶和果膠酯酶的含量及活性比同時(shí)期野生型果實(shí)低［23］。Karlova 等［24］發(fā)現(xiàn)SlAP2a位于LeNAC-NOR、LeMADS-RIN和LeSPL-CNR的下游，LeSPL-CNR 能夠與SlAP2a的啟動(dòng)子直接結(jié)合，SlAP2a也可以對(duì)LeSPL-CNR表達(dá)進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)。總之，CNR 位于RIN、LeHB1、SlAP2a 和 SlTAGL1 的下游，對(duì)果實(shí)成熟起正調(diào)控作用［25］。

目前，由轉(zhuǎn)錄因子組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是研究果實(shí)成熟分子機(jī)制的熱點(diǎn)，CNR 是調(diào)控番茄成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。我們團(tuán)隊(duì)已經(jīng)證明CNR 蛋白在破色期番茄果實(shí)中表達(dá)量最高，發(fā)揮了至關(guān)重要的作用［26］，但是其調(diào)控番茄果實(shí)成熟的機(jī)制和路徑尚不清楚。所以，本研究以野生型AC 和突變體Cnr番茄果實(shí)為材料，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）篩選出差異表達(dá)基因，然后應(yīng)用qRT-PCR 技術(shù)進(jìn)一步確定差異基因，最后采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）確定轉(zhuǎn)錄因子CNR 直接調(diào)控的靶基因，以期為構(gòu)建以CNR 為中心的果實(shí)成熟調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定理論基礎(chǔ)。這不僅能夠完善果實(shí)成熟的調(diào)控理論，而且可以從生物工程角度有效延緩果實(shí)成熟，保持果實(shí)品質(zhì)和延長(zhǎng)果實(shí)貯藏期。

1 材料與方法

1.1 材料

選取由美國(guó)康奈爾大學(xué)BTI 植物研究所提供的Alisa Craig野生型和Cnr突變體番茄種子，由本實(shí)驗(yàn)室繁育保存。番茄種子種植于天津農(nóng)學(xué)院大棚，進(jìn)行常規(guī)管理。選取無(wú)機(jī)械損害、無(wú)病蟲(chóng)害且大小均一的番茄果實(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 番茄果實(shí)總RNA 的提取 采用TRIzol 法提取破色期野生型AC 和突變體Cnr番茄果實(shí)總RNA，具體操作步驟依據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［27］。將組織置于液氮中迅速研磨成干粉，放在10 mL 離心管中，加入4 mL TRIzol 提取液及80 μL β-巰基乙醇，充分混合均勻，室溫靜置10 min。向提取體系中加入60%氯仿/異戊醇（24∶1），15%無(wú)水乙醇，室溫靜置2 min，4℃ 5 000×g離心15 min。取上清液加入等體積氯仿/異戊醇，4℃ 5 000×g離心10 min，再吸取上清液加入兩倍體積的無(wú)水乙醇和五分之一體積的3 mol/L NaAC-HAC（pH 5.0）溶液，混合均勻，-20℃靜置1h。4℃ 5 000×g離心15 min 得到上清液，加等體積75%乙醇離心5 min，棄去上清，晾干內(nèi)壁殘留的乙醇溶液，用適量DEPC 水溶解沉淀。

1.2.2 RNA-seq 測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 從野生型AC 和突變體Cnr番茄果實(shí)中提取的RNA 檢測(cè)合格后，用于構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，然后送至諾禾致源基因研究中心進(jìn)行高通量RNA-seq。每個(gè)樣本3 次生物學(xué)重復(fù)。最終的數(shù)據(jù)處理和分析參考Bemer 等［28］的方法。

1.2.3 GO 和KEGG 富集分析 Gene Ontology（簡(jiǎn)稱(chēng)GO，http：//www.geneontology.org）是基因功能?chē)?guó)際標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi)體系，由基因本體聯(lián)合會(huì)（Gene Onotology Consortium）建立數(shù)據(jù)庫(kù)。基因可以通過(guò)ID 對(duì)應(yīng)或者序列注釋的方法找到與之對(duì)應(yīng)的GO 編號(hào)，而GO 編號(hào)可對(duì)應(yīng)到Term，即功能類(lèi)別或者細(xì)胞定位。采用Goseq 軟件進(jìn)行GO 富集分析。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息，與Pathway 相關(guān)的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)，是進(jìn)行生物體內(nèi)代謝分析、代謝網(wǎng)絡(luò)研究的強(qiáng)有力工具。應(yīng)用KOBAS（2.0）軟件進(jìn)行Pathway富集分析。

1.2.4 qRT-PCR 表達(dá)差異分析 參照Brown 等［29］的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 分析，檢測(cè)差異基因的表達(dá)量。qRT-PCR 使用的引物序列見(jiàn)表1。以Actin基因作為內(nèi)參，每個(gè)基因在AC 番茄果實(shí)中的表達(dá)量歸為1。Expression（2-ΔΔCt）表示為平均值±SE。

1.2.5 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）分析 按照Upstate 試劑盒說(shuō)明書(shū)和Li 的方法進(jìn)行ChIP 分析［30-31］。參照Z(yǔ)hu 等［32］的方法結(jié)合GE Health Ni Sepharose six 快速流動(dòng)親和層析柱操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行CNR 蛋白的原核表達(dá)和純化。然后將制備的高純度、有活性的CNR 蛋白免疫小鼠得到抗CNR 蛋白的多克隆抗體［26］。抗體純化后用于ChIP 分析。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估

野生型AC 和突變體Cnr番茄果實(shí)的總RNA 用于構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，然后在Illumina HiSeq 平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序。從圖1 可以看出，野生型AC 番茄果實(shí)3 個(gè)重復(fù)樣本的R2均大于0.974，Cnr突變體番茄果實(shí)3 個(gè)重復(fù)的R2都大于0.971。說(shuō)明樣品的重復(fù)性良好，數(shù)據(jù)非?？煽俊?/p>

原始圖像數(shù)據(jù)文件通過(guò)CASAVA 堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)換成Raw Reads，Raw Reads 包含低質(zhì)量、帶接頭的Reads。所以Raw Reads 必需經(jīng)過(guò)濾得到Clean Reads 以保證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量。后續(xù)的生物信息學(xué)分析都是基于Clean Reads。測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況如表2 所示，6 個(gè)樣本Q20 和Q30 的最小值分別是94.18%和88.92%，表明所有的測(cè)序數(shù)據(jù)均符合生物信息學(xué)分析的要求。

選用HISAT 軟件將經(jīng)過(guò)拼接的序列進(jìn)行比較分析和基因組定位。軟件的各項(xiàng)參數(shù)選擇默認(rèn)值，比對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3 所示。各個(gè)樣本reads mapped 的比例為92.92%-94.77%均高于70%，這說(shuō)明參考基因組選擇恰當(dāng)，且不存在實(shí)驗(yàn)污染的情況，數(shù)據(jù)和測(cè)序結(jié)果可信。

2.2 野生型AC和突變體Cnr番茄果實(shí)差異基因的篩選結(jié)果

圖2 是野生型AC 和突變體Cnr番茄果實(shí)表達(dá)基因的venn 圖，以fpkm＞1 作為判斷基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)。從圖2 中可以看出，AC 表達(dá)了17 225 個(gè)基因，Cnr表達(dá)了19 389 個(gè)基因。二者之間共有的表達(dá)基因是16 653 個(gè)。不同番茄果實(shí)差異基因的篩選條件為padj＜0.05 且|log2fold change|＞1。如圖3 所示，野生型AC 和突變體Cnr番茄果實(shí)的差異基因有10 223 個(gè)，其中上調(diào)的差異基因4 341 個(gè)，下調(diào)的差異基因5 882 個(gè)。

從圖4 可以看出，與突變體Cnr番茄果實(shí)相比，野生型AC 番茄果實(shí)中與能量代謝相關(guān)具有顯著性表達(dá)差異的基因是68 個(gè)，上調(diào)基因28 個(gè)，下調(diào)基因40 個(gè)；有4 個(gè)與固碳作用相關(guān)的上調(diào)差異基因；與線粒體電子傳遞或ATP 合成相關(guān)的基因是11 個(gè)差異上調(diào)基因，14 個(gè)差異下調(diào)基因；與脂質(zhì)代謝有關(guān)的基因是22 個(gè)差異上調(diào)基因和33 個(gè)差異下調(diào)基因；6 個(gè)基因負(fù)調(diào)控肌醇磷酸鹽代謝；與氨基酸代謝相關(guān)的是24 個(gè)差異上調(diào)基因和39 個(gè)差異下調(diào)基因；存在9 個(gè)與核酸代謝有關(guān)的差異上調(diào)基因和14個(gè)差異下調(diào)基因；6 個(gè)上調(diào)基因和6 個(gè)下調(diào)基因與氧化還原狀態(tài)有關(guān)；2 個(gè)下調(diào)基因與谷胱甘肽代謝相關(guān)；與次生代謝相關(guān)的基因有7 個(gè)差異上調(diào)和10個(gè)差異下調(diào)；與細(xì)胞壁及細(xì)胞膜完整性相關(guān)的基因包括18 個(gè)上調(diào)基因和19 個(gè)下調(diào)基因；3 個(gè)基因與番茄紅素合成相關(guān)，其中2 個(gè)上調(diào)，1 個(gè)下調(diào)；4 個(gè)上調(diào)基因與乙烯生物合成相關(guān)；與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的差異基因有4 個(gè)上調(diào)表達(dá)，4 個(gè)下調(diào)表達(dá)；8 個(gè)上調(diào)差異基因和15 個(gè)下調(diào)差異基因與植物激素相關(guān)；與植物MAPK 信號(hào)途徑相關(guān)的是1 個(gè)上調(diào)表達(dá)的差異基因；3 個(gè)下調(diào)基因與植物防御應(yīng)答相關(guān)；2個(gè)上調(diào)和8 個(gè)下調(diào)基因與植物病原途徑相關(guān)；3 個(gè)上調(diào)基因和1 個(gè)下調(diào)基因與植物非生物脅迫有關(guān)；2個(gè)差異上調(diào)基因與維生素代謝相關(guān)。

2.3 差異表達(dá)基因GO和KEGG分析

GO 分 為 分 子 功 能（Molecular Function）、生物進(jìn)程（Biological Process）和細(xì)胞組分（Cellular Component）3 部分。通過(guò)對(duì)野生型和突變體番茄差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行GO 富集分析，以揭示哪些生物進(jìn)程、分子功能和細(xì)胞組分與CNR 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)。如圖5 所示，生物進(jìn)程極顯著的集中在次級(jí)代謝物生物合成、次級(jí)代謝、含硫化合物代謝、α-氨基酸代謝、對(duì)高光強(qiáng)度的應(yīng)答、有機(jī)酸生物合成、羧酸生物合成、谷胱甘肽代謝和對(duì)脂類(lèi)的細(xì)胞應(yīng)答；細(xì)胞組分顯著性的存在于色素體、葉綠體、細(xì)胞器亞單位、質(zhì)體類(lèi)囊體、質(zhì)體基質(zhì)、葉綠體類(lèi)囊體、類(lèi)囊體、葉綠體基質(zhì)、質(zhì)體包膜、類(lèi)囊體膜、葉綠體被膜、色素體類(lèi)囊體膜、葉綠體類(lèi)囊體膜；分子功能顯著性的集中于鐵離子束、亞鐵血紅素結(jié)合物、單加氧酶活性、氧化還原酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、四吡咯結(jié)合物、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性。

表1 用于qRT-PCR 驗(yàn)證的引物序列

圖1 番茄果實(shí)樣本的相關(guān)性

表2 數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量情況一覽表

表3 Reads 與參考序列比對(duì)情況一覽表

在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，通過(guò)Pathway 顯著性富集能確定差異表達(dá)基因參與的最主要代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG Pathway 富集分析，根據(jù)P＜0.05，選取26 個(gè)差異最顯著的 KEGG 通路，如圖6 所示。野生型AC 和突變體Cnr番茄的差異基因主要富集在谷胱甘肽代謝、MAPK 信號(hào)途徑、類(lèi)黃酮化合物代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、類(lèi)胡蘿卜素合成、脂代謝、糖代謝、苯丙素生物合成、萜類(lèi)化合物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑。

圖2 野生型AC 和突變體Cnr 番茄果實(shí)差異基因維恩圖

圖3 野生型AC 和突變體Cnr 番茄果實(shí)基因差異表達(dá)分析火山圖

圖4 野生型AC 和突變體Cnr 番茄果實(shí)差異基因的篩選結(jié)果

2.4 qRT-PCR驗(yàn)證AC和Cnr番茄果實(shí)中差異基因的相對(duì)表達(dá)量

選擇AC 和Cnr番茄果實(shí)中有極顯著差異的一些代表性基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證。由表4 可知，AC 番茄果實(shí)中參與果糖和甘露糖代謝的甘露聚糖-1，4-β-甘露糖苷酶基因（Solyc01g008710.2）的表達(dá)量是Cnr番茄果實(shí)的2 500 倍。亞油酸9S-脂氧合酶參與亞油酸代謝，AC 番茄果實(shí)中該酶基因（Solyc08g014000.2）的相對(duì)表達(dá)量是Cnr番茄果實(shí)的10 000 倍。參與細(xì)胞壁果膠代謝的果膠酯酶基因（Solyc07g064180.2）在AC 番茄果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量與亞油酸9S -脂氧合酶基因相似。發(fā)現(xiàn)一個(gè)新基因（novel.9194）參與番茄紅素合成，在AC 番茄果實(shí)中的表達(dá)量是Cnr番茄果實(shí)的100 倍。1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶基因（Solyc05g050010.2）在乙烯生物合成中起重要作用，該基因在AC 番茄果實(shí)的表達(dá)量是Cnr番茄果實(shí)的180 倍。脫落酸和環(huán)境應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白TAS14 基因（Solyc02g084850.2）參與植物激素代謝。硫胺素噻唑合酶基因（Solyc07g064160.2）參與硫胺素代謝。促分裂原活化蛋白激酶基因（Solyc02g084870.2）在Cnr 番茄果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量是0.069 7。以上這些基因在AC 番茄果實(shí)中上調(diào)表達(dá)。

圖5 野生型AC 和突變體Cnr 番茄果實(shí)GO 顯著性富集分析

圖6 KEGG 顯著富集通路

已糖載體基因（Solyc02g079220.2）在Cnr突變體中的相對(duì)表達(dá)量是101.640 3，鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 合成酶基因（Solyc01g096190.2）在Cnr突變體中的相對(duì)表達(dá)量是6.597 4。脂氧合酶基因（Solyc08g029000.2）在Cnr番茄果實(shí)中的表達(dá)量是AC 果實(shí)中的276 367倍。過(guò)氧化物酶基因（Solyc02g082090.2）與氧化還原狀態(tài)有關(guān)，在Cnr番茄果實(shí)中的表達(dá)量是AC 果實(shí)中的1 233 倍。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因（Solyc09g011630.2）參與谷胱甘肽代謝，在Cnr番茄果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量是5 383.808 2。果膠酯酶基因（Solyc09g075330.2）在Cnr番茄果實(shí)中的表達(dá)量是AC 番茄果實(shí)中的1 026 倍。番茄紅素ε-環(huán)化酶基因（Solyc12g008980.1）參與番茄紅素代謝，在Cnr突變體中的表達(dá)量是15.691 3。乙烯響應(yīng)蛋白抑制因子1 基因（Solyc08g080630.2）位于乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在Cnr番茄果實(shí)中的相對(duì)積累量為222.453 4。植物生長(zhǎng)素載體組分基因（Solyc07g006900.1）在植物激素代謝過(guò)程有重要作用，其在Cnr番茄果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量是 254.237 6，相對(duì)表達(dá)量較高。葡聚糖-1，3-β-葡萄糖苷酶B 基因（Solyc01g060020.2）與防御應(yīng)答相關(guān)，在Cnr突變體果實(shí)中的表達(dá)量是AC 果實(shí)中的71 倍。

2.5 CNR靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的ChIP檢測(cè)

為了證明CNR 在番茄果實(shí)體內(nèi)直接結(jié)合的靶基因，我們進(jìn)行了ChIP 檢測(cè)。染色質(zhì)從粉紅期果實(shí)中提取并與蛋白質(zhì)交聯(lián)。用抗CNR 的鼠IgG 免疫沉淀CNR 及其相關(guān)DNA-蛋白復(fù)合物（ChIP）。陰性對(duì)照為正常小鼠的免疫球蛋白G（IgG）。ChIP-qPCR 顯示八氫番茄紅素合成酶基因（PSY）、多聚半乳糖醛酸酶基因（PG）、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶基因（ACS）、亞油酸9S-脂氧合酶基因和果膠酯酶基因的GTAC 基序顯著富集（圖7）。八氫番茄紅素合成酶基因的結(jié)合能力最強(qiáng)，果膠酯酶基因結(jié)合能力最弱。ChIP-qPCR 結(jié)果說(shuō)明在番茄果實(shí)體內(nèi)CNR 直接結(jié)合在PSY、ACS、LOX、PE以及PG基因的啟動(dòng)子區(qū)域，這些基因是轉(zhuǎn)錄因子CNR 的靶基因。

3 討論

番茄果實(shí)的成熟和衰老過(guò)程是復(fù)雜而有序的，包括顏色、質(zhì)地、風(fēng)味、香氣成分和其他新陳代謝的變化，同時(shí)又與基因調(diào)控過(guò)程高度相關(guān)。野生型AC 和突變體Cnr番茄果實(shí)的差異基因涉及番茄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)方面，包括能量相關(guān)代謝途徑、固碳作用、線粒體電子傳遞、ATP 合成、脂代謝、磷酸肌醇代謝、氨基酸代謝、核酸代謝、氧化還原狀態(tài)、谷胱甘肽代謝、次生代謝、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜完整性、番茄紅素合成、乙烯生物合成、乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物激素、植物防御應(yīng)答、植物病原相關(guān)、非生物脅迫、維生素代謝和MAPK 信號(hào)通路。

脂氧合酶（LOX）是高等植物中的一種非血紅素鐵蛋白，參與香氣成分合成、果實(shí)成熟和衰老、氧脅迫、脂質(zhì)過(guò)氧化等過(guò)程，對(duì)細(xì)菌感染和不利的外部條件有很好的防御作用［33-34］。LOX 的反應(yīng)產(chǎn)物可能通過(guò)參與乙烯對(duì)躍變型果實(shí)的觸發(fā)而加速果實(shí)成熟。另一方面，LOX 通過(guò)催化不飽和脂肪酸的氧化影響植物成熟和衰老。亞油酸9S-脂氧合酶基因（Solyc08g014000.2）在AC 番茄果實(shí)中表達(dá)量較高，脂氧合酶基因（Solyc08g029000.2）的相對(duì)表達(dá)量在AC 番茄果實(shí)中降低。果膠酯酶在植物組織和微生物中分布較為廣泛，作用于細(xì)胞壁降解、細(xì)胞分裂，果實(shí)軟化及植物抗?。?5］。與Cnr突變體番茄果實(shí)相比，AC 番茄果實(shí)中的果膠酯酶基因（Solyc07g064180.2）上調(diào)，另一個(gè)果膠酶基因（Solyc09g075330.2）下調(diào)。以上結(jié)果表明，脂氧合酶和果膠酯酶是由多基因家族編碼的，各個(gè)基因在番茄果實(shí)成熟和軟化過(guò)程中起不同作用。

表4 AC 和Cnr 番茄果實(shí)差異基因的相對(duì)表達(dá)量

圖7 鑒定CNR 在番茄果實(shí)體內(nèi)結(jié)合的順式元件

過(guò)氧化物酶催化涉及過(guò)氧化氫的各種氧化反應(yīng)，有多重氧化還原進(jìn)程。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因（Solyc08g080940.2）參與上述反應(yīng)。過(guò)氧化物酶的積累可以應(yīng)對(duì)由不良傷害和非生物脅迫引起的活性氧（ROS）過(guò)量產(chǎn)生。過(guò)氧化物酶基因（Solyc02g082090.2）在AC 番茄果實(shí)中下調(diào)表達(dá)。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）屬于蛋白質(zhì)超家族，當(dāng)植物受到非生物脅迫時(shí)，它可以清除活性氧并保護(hù)植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整和蛋白質(zhì)的活性［36］。AC 番茄果實(shí)的谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶基因（Solyc09g011630.2）下調(diào)。絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在植物免疫反應(yīng)中起重要作用，該酶基因（Solyc02g084870.2）在Cnr突變體番茄果實(shí)中沒(méi)有表達(dá)，僅在AC 番茄果實(shí)中檢測(cè)到，這揭示CNR 轉(zhuǎn)錄因子與MAPK 途徑密切相關(guān)。番茄紅素具有抗氧化性能，能夠保護(hù)機(jī)體免受氧化帶來(lái)的損傷，同時(shí)可以介導(dǎo)細(xì)胞通訊對(duì)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控［37］。本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與番茄紅素合成相關(guān)的新基因（novel.9194），該基因在AC 番茄果實(shí)中上調(diào)表達(dá)；番茄紅素ε-環(huán)化酶基因（Solyc12g008980.1）在AC 番茄果實(shí)中下調(diào)表達(dá)，這兩個(gè)基因在番茄果實(shí)的著色過(guò)程中共同起作用。

乙烯是一種激素，影響成熟相關(guān)基因的表達(dá)，在水果的生長(zhǎng)過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用［38］。AC 番茄果實(shí)中ACS基因（Solyc05g050010.2）呈上調(diào)表達(dá)，Cnr突變體中該基因不表達(dá)，無(wú)乙烯合成。乙烯響應(yīng)蛋白抑制因子1 基因（Solyc08g080630.2）在AC番茄果實(shí)中呈負(fù)調(diào)控。LOX 途徑是植物特有的芳香物質(zhì)合成途徑，一些揮發(fā)性化合物通過(guò)LOX 途徑合成，如LOX 通過(guò)亞麻酸途徑參與醛香物質(zhì)的合成［39］。也有研究發(fā)現(xiàn)，在香氣物質(zhì)的形成過(guò)程中乙烯發(fā)揮了重要作用。LOX 途徑中與香氣相關(guān)的基因Tomlox C表達(dá)降低，說(shuō)明番茄果實(shí)LOX 途徑中香氣物質(zhì)的產(chǎn)生依賴(lài)乙烯［40］。氨基酸代謝途徑的差異表達(dá)基因決定野生型AC 和突變體Cnr番茄果實(shí)具有不同風(fēng)味，但是番茄果實(shí)香氣的組成和形成機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

CNR 轉(zhuǎn)錄因子的功能涉及番茄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育階段的各個(gè)方面。CNR 通過(guò)直接結(jié)合八氫番茄紅素合成酶基因（PSY）、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶基因（ACS）、亞油酸9S-脂氧合酶基因（LOX）、果膠酯酶基因（PE）以及聚半乳糖醛酸酶基因（PG）的啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控番茄的成熟軟化過(guò)程。