穆國(guó)華 趙宗江 孟繁章 趙進(jìn)喜

2型糖尿病(Type 2 Diabetesmellitus，T2DM)近幾年逐漸成為危害我國(guó)人民健康的主要慢性代謝性疾病之一，發(fā)病率逐年上升且年齡呈下降趨勢(shì)。全球約4.15億的糖尿病患者中，約有90%為T2DM，做為人口大國(guó)的我們亦是T2DM發(fā)病最多的國(guó)家之一[1]。近幾年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸(bile acids，BA)的代謝與T2DM的防治有著密不可分的關(guān)系，其可參與糖脂的代謝，其主要機(jī)制與BA可以激活法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)進(jìn)而促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子19(fibroblast growth factor 19，F(xiàn)GF19)分泌以及活化G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5(G protein cooupled bile acid receptor 5，TGR5)促進(jìn)腸道L細(xì)胞分泌胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide，GLP-1)有關(guān)[2-3]。腸道的選擇性屏障與代謝性疾病的發(fā)生緊密相連，對(duì)維持人體代謝平衡起著重要的作用[4-5]。Occludin蛋白對(duì)腸上皮緊密連接至關(guān)重要，Occludin蛋白缺失引起腸道黏膜破壞，研究證實(shí)，T2DM伴隨著腸道腸屏障功能的損害，而腸道完整性由緊密連接控制[6]。

T2DM屬于中醫(yī)“消渴病”的范疇，明何柏齋《醫(yī)學(xué)管見(jiàn)》提出消渴的病機(jī)為“造化之機(jī)，水火而已，……交則為既濟(jì)，不交則為未濟(jì)。消渴證，不交而火偏盛也”，此理論為黃連、肉桂治療T2DM提供了有力的理論基礎(chǔ)。研究證實(shí)，黃連、肉桂可以有效的改善糖尿病的高血糖狀態(tài)，改善胰島細(xì)胞功能，延緩糖尿病的并發(fā)癥發(fā)病進(jìn)程[7-8]。本實(shí)驗(yàn)研究黃連肉桂是否通過(guò)調(diào)節(jié)自發(fā)性2型糖尿病(diabetes mouse，db/db)小鼠膽汁酸代謝及上調(diào)腸Occludin蛋白的表達(dá)改善腸道屏障功能，降低小鼠血糖及改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)雄性自發(fā)性2型糖尿病db/db小鼠(C57BLKS)30只以及6只同周齡雄性同窩野生型db/m小鼠(購(gòu)自常州卡文思實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(蘇2016-0010)，db/m小鼠體重20～25 g，db/db小鼠體重35～40 g，于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑

二甲雙胍片，規(guī)格0.5 g×20片，商品名：格華止，購(gòu)自中美上海施貴制藥有限公司。黃連、肉桂為中藥配方浸膏：黃連及肉桂購(gòu)自北京康美制藥有限公司，由北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行含量測(cè)定，并制成浸膏，均符合2010版藥典合格標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 儀器

血糖試紙：穩(wěn)豪型血糖試紙，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)證號(hào)：YZB/USA 0659- 2010,強(qiáng)生(上海)醫(yī)療器材有限公司。1.8 mL外旋凍存管，購(gòu)自corning公司。50 mL離心管，購(gòu)自corning公司。磁珠法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒(DP712)，購(gòu)自TIANGEN公司；血糖儀：強(qiáng)生穩(wěn)豪型血糖儀(ONETOUCH UltraEasy),強(qiáng)生(上海)醫(yī)療器材有限公司。高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳，型號(hào)KDC-140HR；分析儀：Thermo公司Q exactive高分辨質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)，配有電噴霧(ESI)離子源和Xcalibur工作站。

1.4 分組

所有小鼠按3只/籠，飼養(yǎng)于獨(dú)立通氣籠系統(tǒng)內(nèi)，室溫(24±2)℃，12小時(shí)光照維持，晝夜循環(huán)，自由攝食、飲水。普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，測(cè)量db/db糖尿病小鼠尾尖靜脈血糖，選取3次空腹血糖平均值>13 mmol/L[9](禁食6小時(shí)，間隔1天)的db/db小鼠30只，隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、黃連組、肉桂組及黃連肉桂組，每組6只；以同齡的db/m小鼠6只作為空白對(duì)照組。

1.5 給藥方法

中藥干預(yù)藥物為黃連、肉桂，西藥干預(yù)藥物為二甲雙胍。以上藥物的成人劑量為二甲雙胍1500 mg/60 kg，黃連∶肉桂=10∶1，小鼠劑量的換算方法參考徐叔云教授主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，人和動(dòng)物間按體表面積對(duì)劑量進(jìn)行換算：小鼠劑量(mg/kg)=9.1×人的臨床劑量(mg/kg)。采取灌胃的方式進(jìn)行給藥，空白組及模型組仍給予純凈水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開(kāi)始藥物干預(yù)，藥物干預(yù)時(shí)間為8周。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 血糖及胰島素檢測(cè) 在第8周時(shí)，采用血糖儀測(cè)定尾靜脈血，記錄小鼠血糖水平；最后摘除眼球取血離心，生化法測(cè)定小鼠空腹胰島素水平。

1.6.2 液相色譜法檢測(cè)小鼠膽汁酸代謝情況 采用提尾反射法收集小鼠糞便標(biāo)本，使用無(wú)菌EP管收集標(biāo)本，每管采集3粒糞便，標(biāo)記后放入-80℃低溫冰箱保存，經(jīng)過(guò)樣品提取純化后，基于液相色譜分析法分析各組小鼠糞便中不同的BA含量。

1.6.3 蛋白免疫印跡法檢測(cè)小鼠回腸Occludin蛋白量的表達(dá) 取3只小鼠少量超低溫冰箱中的小鼠回腸粉碎組織加入RIPA裂解液勻漿后裂解,隨后于4℃冷凍離心機(jī)下12000 r/min離心10分鐘，取上清液使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，對(duì)蛋白進(jìn)行變性，制備SDS-PAGE上樣緩沖液，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、化學(xué)發(fā)光、顯影后，采用目的條帶與內(nèi)參蛋白條帶光密度比值作為結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6.4 電鏡觀察小鼠小腸超微結(jié)構(gòu)改變 取少量小腸組織，室溫下新鋨酸固定2小時(shí)，蒸餾水沖洗3次，2分鐘/次，后經(jīng)果脫水、包埋，超薄切片后于透射電鏡下觀察小腸黏膜超微結(jié)構(gòu)的改變。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 黃連肉桂對(duì)db/db小鼠血糖、胰島素監(jiān)測(cè)

藥物干預(yù)前，db/db小鼠各組的血糖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，在第8周分別對(duì)各組小鼠的血糖進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)第8周各組小鼠的血糖進(jìn)行分析，模型組小鼠血糖明顯高于其他組(P<0.05)，黃連組與黃連肉桂組小鼠血糖值明顯優(yōu)于雙胍組(P<0.05)，中藥各組相比黃連、黃連肉桂組小鼠血糖值優(yōu)于肉桂組(P<0.05)。正常組空腹胰島素明顯低于其余各組小鼠(P<0.05)，雙胍組、黃連組、黃連肉桂組小鼠空腹胰島素均明顯低于模型組(P<0.05),且三組中黃連肉桂組空腹胰島素均值最低。如表1所示。

表1 黃連肉桂對(duì)各組db/db小鼠第8周血糖及胰島素情況鼠只=6)

2.2 黃連肉桂對(duì)db/db小鼠膽汁酸代謝影響

用藥組中，肉桂組膽酸(cholic acid，CA)含量較正常組及模型組明顯升高(P<0.05)，黃連肉桂組CA含量較正常組及模型組明顯升高(P<0.05)；各組小鼠代謝中鵝去氧膽酸(chenodeoxy cholic acid，CDCA)含量相比，黃連肉桂組較模型組明顯升高(P<0.05)；熊去氧膽酸(Ursodeoxy cholic acid，UDCA)在各組小鼠糞便中含量相比較，黃連組比模型組明顯下降(P<0.05)，黃連肉桂組較模型組及雙胍組明顯降低(P<0.05)。如表2所示。

表2 黃連肉桂對(duì)各組小鼠不同膽汁酸代謝情況(鼠只=6，ng/mg)

2.3 黃連肉桂對(duì)db/db小鼠腸Occludin蛋白表達(dá)的影響

與正常組對(duì)比，模型組Occudin含量明顯減少(P<0.05),黃連肉桂組與模型組相比Occudin含量明顯明顯增加(P<0.05)，雙胍組Occudin含量較正常組及黃連肉桂組明顯減少(P<0.05)。余各組間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如圖1、表3所示。

圖1 各組小鼠腸組織Occludin蛋白表達(dá)情況

表3 蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組小鼠腸Occludin蛋白表達(dá)情況(鼠只

2.4 黃連肉桂對(duì)各組小鼠腸道超微結(jié)構(gòu)改變

正常組小鼠腸黏膜表皮微絨毛排列均勻整齊，邊界清晰，長(zhǎng)度一致，無(wú)不規(guī)則脫落情況，細(xì)胞無(wú)明顯改變，細(xì)胞間隙均勻，大小正常。模型組小鼠腸粘膜表皮微絨毛排列稀疏、邊界欠清，長(zhǎng)短不一，形態(tài)不規(guī)則，有脫落融合現(xiàn)象，腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接間隙增寬，結(jié)構(gòu)模糊，說(shuō)明腸黏膜緊密連接的超微結(jié)構(gòu)被破壞。三組中藥組小鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰完整，微絨毛排列整齊、形態(tài)正常，大小均勻且連接緊密，其中黃連肉桂組排列較其他兩中藥組及模型、雙胍組更為緊密均勻，細(xì)胞內(nèi)外結(jié)構(gòu)更為完整，細(xì)胞間隙均勻，大小正常，腸黏膜緊密連接的超微結(jié)構(gòu)較為完整，與正常組最為接近。如圖2所示。

圖2 掃描電鏡下各組小鼠小腸超微結(jié)構(gòu)的改變

3 討論

黃連味苦性寒，歸心、胃、肝、大腸經(jīng)，其主要功效為清熱燥濕、瀉火解毒，肉桂辛、甘、熱，歸心、肝、脾、腎經(jīng)，具有補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛、溫經(jīng)通脈和引火歸源的功效，王好古謂其“補(bǔ)命門不足，益火消陰”；兩者配伍，一上一下，一寒一熱，下可溫補(bǔ)腎陽(yáng)、引火歸原，上可瀉火解毒、益陰清熱。近幾年，諸多研究證實(shí)黃連肉桂同用可以有效的改善T2DM患者高血糖狀態(tài)，改善胰島細(xì)胞功能，延緩糖尿病的并發(fā)癥發(fā)病進(jìn)程[10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，黃連素及油桂皮醛均具有抗?jié)?、止瀉、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)及促進(jìn)膽汁分泌等功效,且兩者配伍后降糖效果明顯[11-12]。黃連肉桂用于T2DM的治療有著充分的中醫(yī)學(xué)理論依據(jù)和藥理學(xué)研究基礎(chǔ)。

BA的代謝與T2DM的關(guān)系是目前研究的熱點(diǎn)，BA在人體肝臟中主要由膽固醇在肝細(xì)胞中通過(guò)復(fù)雜的類固醇羥基化及側(cè)鏈氧化步驟而合成，BA主要通過(guò)經(jīng)典途徑、替代途徑兩條途徑生成，分別產(chǎn)生CA和CDCA，在小鼠體內(nèi)同時(shí)還可以產(chǎn)生鼠膽酸(muricholic acid，MCA)和UDCA作為主要膽汁酸[13-15]。BA參與糖脂代謝的調(diào)節(jié)，主要是通過(guò)FXR和TGR5來(lái)實(shí)現(xiàn)[16]，F(xiàn)XR可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)因子成纖維生長(zhǎng)因子15/人直系同源19(fibroblast growth factor 15/19，F(xiàn)GF15/19)的分泌，BA-FXR介導(dǎo)的腸FGF15/19與肝成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4/可羅索β蛋白結(jié)合，從而促進(jìn)肝糖原合成和降低血糖，同時(shí)還可以減輕T2DM小鼠的體重增加、葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗[17]，TGR5可以促進(jìn)腸道L細(xì)胞分泌GLP-1來(lái)調(diào)節(jié)血糖[18]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，黃連肉桂可以促進(jìn)db/db小鼠CA和CDCA的分泌，同時(shí)減少UDCA的含量，有研究證實(shí)，不同BA對(duì)FXR的激活作用不盡相同，CDCA是FXR最有效的膽汁酸配體，CA次之[19]，而UDCA對(duì)FXR受體具有拮抗作用[20]。

腸道屏障的完整性與人體的健康關(guān)系密切，腸道屏障的損傷可以引發(fā)諸多炎性因子及內(nèi)毒素入血，進(jìn)而導(dǎo)致許多代謝疾病的發(fā)生，腸道通透性改變，可以激活導(dǎo)致胰島素抵抗的全身性炎癥反應(yīng)繼而誘導(dǎo)T2DM的發(fā)生[21]。T2DM患者常伴有腸道完整性的損害，腸道屏障的完整性是否完好取決于緊密連接控制[22]，而緊密連接是由跨膜蛋白和胞質(zhì)蛋白組成，Occludin蛋白為其中之一，Occludin蛋白是最早被發(fā)現(xiàn)的跨膜緊密連接蛋白[23]，研究證實(shí)，Occludin蛋白的丟失可以導(dǎo)致腸上皮緊密連接滲透通路的通透性增加，損害腸道屏障[24]。此次試驗(yàn)中，黃連肉桂可以有效提高db/db小鼠腸道Occludin蛋白的表達(dá)改善小腸通透性，提高小腸屏蔽功能。

本實(shí)驗(yàn)再次通過(guò)檢測(cè)db/db小鼠的血糖、空腹胰島素、膽汁酸代謝、腸道Occludin蛋白的表達(dá)及其對(duì)小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，探討黃連肉桂改善db/db小鼠高血糖狀態(tài)的作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)研究顯示，黃連肉桂可以有效改善db/db小鼠高血糖狀態(tài)，減少db/db小鼠空腹胰島素分泌，其機(jī)制可能與其可以調(diào)節(jié)膽汁酸代謝、增加腸道Occludin蛋白表達(dá)改善腸道通透性有關(guān)，為黃連肉桂在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。