王衛(wèi)芹，牛 爍，陳學(xué)東

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，病變進(jìn)展時(shí)常伴有轉(zhuǎn)移，預(yù)后差[1]。乳腺改良根治術(shù)是重要的術(shù)式，但是損傷大，患者術(shù)后心理負(fù)擔(dān)重，生活質(zhì)量差。早期乳腺癌，尤其是前哨淋巴結(jié)無累及的患者適用于保乳手術(shù)[2]。微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)通過調(diào)控其基因功能參與腫瘤的形成和進(jìn)展，近年來認(rèn)為其可參與乳腺癌的進(jìn)展，可能與預(yù)后有關(guān)[3]。本研究關(guān)注保乳手術(shù)對早期乳腺癌的治療效果，同時(shí)觀察組織中微小RNA-21(MicroRNA-21,miR-21)和miR-155的表達(dá)，探討其臨床意義及與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集2013年1月-2014年5月在涿州市中醫(yī)醫(yī)院普外科行手術(shù)治療的124例早期乳腺癌患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有明確的病理診斷，且符合WHO的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②經(jīng)術(shù)中冰凍及術(shù)后病理明確前哨淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移；③腫瘤最大徑<3 cm。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重內(nèi)科疾??；②轉(zhuǎn)移癌；③依從性差?；颊呔鶠榕裕挲g23～78歲，平均58.4歲，其中原位癌39例，微浸潤性癌25例，浸潤性癌60例。應(yīng)用保乳手術(shù)進(jìn)行治療的患者62例，列為觀察組，患者年齡23～78歲，平均57.4歲，分子分型：管腔A型20例，管腔B型20例，HER-2亞型16例，基底細(xì)胞亞型6例。應(yīng)用改良根治手術(shù)治療的患者62例，列為對照組，患者年齡25～77歲，平均59.4歲，分子分型：管腔A型19例，管腔B型22例，HER-2亞型17例，基底細(xì)胞亞型4例。兩組在年齡及分子分型中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者或家屬簽定知情同意書。

1.2 手術(shù)方法 觀察組應(yīng)用保乳手術(shù)行原發(fā)腫物切除、乳腺區(qū)段或象限切除，切緣距離腫瘤>2 cm，經(jīng)術(shù)中冰凍及術(shù)后病理明確前哨淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移。腫物內(nèi)、外、上、下、基底部分別作標(biāo)記行冰凍切片病理檢查，病理檢查切緣結(jié)果均為陰性后縫合。對照組應(yīng)用傳統(tǒng)的乳腺癌改良根治術(shù)進(jìn)行治療，均留取術(shù)后的新鮮標(biāo)本，于-80 ℃冰箱中凍存。

1.3 術(shù)后治療方法 觀察組患者術(shù)后行常規(guī)放療，共25次。部分患者依情況選擇化療，于手術(shù)后2～4周進(jìn)行，選擇阿霉素、環(huán)磷酰胺、5氟尿嘧啶方案，進(jìn)行2～6個(gè)周期。針對ER、PR陽性患者于化療結(jié)束后服用三苯氧胺20 mg/d。針對HER-2陽性表達(dá)的患者，應(yīng)用赫賽汀治療。對照組部分患者術(shù)后行放、化療，方法同上。

1.4 隨訪 應(yīng)用電話隨訪、電子郵件及家訪等形式進(jìn)行隨訪，每半年一次，于術(shù)后3年及5年觀察生存情況。

1.5 乳腺癌復(fù)發(fā) 指經(jīng)病理證實(shí)的乳腺癌，經(jīng)過治療后，在原發(fā)灶附近或遠(yuǎn)隔器官出現(xiàn)病理性質(zhì)完全相同腫瘤的現(xiàn)象。

1.6 生活質(zhì)量評價(jià) 術(shù)后5年隨訪時(shí)進(jìn)行生活質(zhì)量的調(diào)查，應(yīng)用SF-36量表，共包含8個(gè)維度，即總體健康、生理功能、生理職能、軀體疼痛、活力、社會功能、情感職能及精神健康，每個(gè)維度分值為100分，得分越高，生活質(zhì)量越好。

1.7 miR-21和miR-155的檢測 miR-21和miR-155的檢測應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR)。術(shù)后留取的樣本均于取材后3個(gè)月內(nèi)集中檢測。試劑盒購自美國Invitrogen公司。操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。首先配制1%的DEPC水，并將實(shí)驗(yàn)用EP管、剪刀、研磨棒、研缽、移液槍槍頭等用1%的DEPC水浸泡12 h，高壓滅菌。用液氮預(yù)冷研缽，取凍存樣本，應(yīng)用研磨棒研磨成粉末狀，待液氮揮發(fā)完全，用槍頭吸頭寬口刮取粉末加入1.5 mL離心管中，加入1 000 μL Trizol試劑(購自美國Invitrogen公司，貨號:10296010)后按照試劑盒說明書步驟提取總RNA，使用紫外分光光度計(jì)(品牌：RUNQEE，型號：UV-1900)測定濃度和純度。miR-21引物上游：5′-CTCAACTGTGAACTGGAGG-3′，下游：5′-ACAAACCCAAACTGGGTG-3′；miR-155引物上游：5′-GCAAACGTTGAGTAACCAC-3′，下游：5′-CGACAACCACAACGTTAA-3′。RNU6B上游：TCGTGATAGTGATGATCCAGCCA，下游：CGTAGTAGTACAGATAGTAGATGA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將提取的總RNA稀釋至濃度為2 ng/μL。反應(yīng)條件為16 ℃、30 min，42 ℃ 、30 min，85℃、5 min，4 ℃恒溫。實(shí)時(shí)qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，32個(gè)循環(huán)。所得結(jié)果平均閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)，按2-ΔΔCT計(jì)算，以Relative Quantity(RQ)表示。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者隨訪生存率的比較 對照組60例患者完成隨訪(1例因意外死亡，1例因腦出血呈植物狀態(tài)剔除)，觀察組均完成隨訪。觀察組與對照組3年和5年生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表1。

表1 兩組隨訪3年和5年生存率的比較

2.2 兩組患者術(shù)后5年隨訪生活質(zhì)量的比較 隨訪患者均完成問卷調(diào)查。結(jié)果顯示觀察組患者在8個(gè)維度的評分均高于對照組,表2。

表2 兩組患者術(shù)后5年隨訪生活質(zhì)量的比較

2.3 觀察組miR-21和miR-155在不同臨床病理特征中的表達(dá)比較 觀察組miR-21的表達(dá)為283.21～542.12，平均402.11±56.17；miR-155的表達(dá)為302.31～596.31，平均456.31±56.21。miR-21和miR-155在不同組織學(xué)分級、脈管癌栓及有無壞死、鈣化的分組中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表3，圖1，圖2。

圖1 miR-21在乳腺癌中的表達(dá)

圖2 miR-155在乳腺癌中的表達(dá)

表3 觀察組中miR-21和miR15在不同臨床病理特征中的表達(dá)比較

2.4 觀察組5年內(nèi)是否復(fù)發(fā)患者miR-21和miR-155表達(dá)的比較 觀察組5年內(nèi)復(fù)發(fā)患者miR-21和miR-155的表達(dá)明顯高于非復(fù)發(fā)患者，表4。

表4 觀察組5年內(nèi)是否復(fù)發(fā)患者miR-21和miR-155表達(dá)的比較

2.5 觀察組中miR-21和miR-155表達(dá)的生存分析 對患者均進(jìn)行術(shù)后5年(60個(gè)月)生存時(shí)間的隨訪，隨訪的末次時(shí)間是2019年4月4日，患者術(shù)后生存時(shí)間為10～60個(gè)月。生存分析顯示miR-21(臨界值為283.21，χ2=4.24，P=0.023)和miR-155(臨界值為302.31，χ2=5.09，P=0.016)與生存時(shí)間有關(guān)，即miR-21和miR-155高表達(dá)患者的生存時(shí)間短，預(yù)后差(圖3、圖4，表5)。

圖3 miR-21的表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系

圖4 miR-155的表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系

表5 COX回歸模型對患者影響的單因素生存分析結(jié)果

3 討論

乳腺癌改良根治手術(shù)是治療的常用方法，但是手術(shù)時(shí)切除的范圍大，常有局部體形的改變，患者心理及生活質(zhì)量受到影響[4]。保乳治療是近年應(yīng)用于早期乳腺癌的治療方法，主要針對無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，術(shù)中冰凍檢測前哨淋巴結(jié)是重要的方法[5]。本研究結(jié)果顯示保乳手術(shù)與改良根治術(shù)治療后的3年和5年隨訪生存率無明顯差別，提示兩種治療均可以應(yīng)用于臨床中。結(jié)果顯示觀察組隨訪生活質(zhì)量評分明顯高于對照組，提示保乳手術(shù)可以改善患者的生活質(zhì)量。針對預(yù)后相關(guān)影響因素，本研究檢測了觀察組中miR-21和miR-155的表達(dá)，結(jié)果顯示兩者均與組織學(xué)分級、脈管癌栓、有無壞死及鈣化有關(guān)，以上因素均與乳腺癌的生物學(xué)行為及預(yù)后有關(guān)，因此兩者高表達(dá)提示腫瘤處于進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-21和miR-155的表達(dá)與患者術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，且兩者的表達(dá)與生存時(shí)間有關(guān)，因此兩者高表達(dá)的狀態(tài)常提示腫瘤易于復(fù)發(fā)及不良的預(yù)后，臨床檢測miR21和miR-155有重要意義。保乳手術(shù)常與術(shù)后的化療、放療及內(nèi)科治療同時(shí)進(jìn)行，臨床應(yīng)用前景廣泛。保乳手術(shù)在手術(shù)時(shí)的范圍要足夠，一般為腫瘤邊緣周圍的2～2.5 cm，術(shù)中冰凍對判斷切緣的狀態(tài)有重要意義，依靠術(shù)中病理將腫瘤完整切除。近年來學(xué)者認(rèn)識到非編碼RNA的重要作用，認(rèn)為其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中及預(yù)后判斷中具有一定的調(diào)節(jié)作用[6]。非小細(xì)胞肺癌中miR-155的高表達(dá)表現(xiàn)為明顯的促進(jìn)作用[7]。非翻譯區(qū)出現(xiàn)了miRNA，是miR-21的有效識別位點(diǎn)，并且可以和miR-661進(jìn)行靶定位點(diǎn)結(jié)合，同時(shí)能夠?qū)ζ渌膍iRNA進(jìn)行調(diào)控[9]。也有研究認(rèn)為miRNA能夠?qū)D(zhuǎn)錄后水平的基因翻譯過程進(jìn)行抑制，進(jìn)而對靶miRNA進(jìn)行調(diào)解，使靶基因的生物學(xué)功能發(fā)生改變。miR-21和miR-155的異常表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞的失控性增生和異常增殖，腫瘤細(xì)胞數(shù)量增加，腫瘤體積增大。miR-21和miR-155的表達(dá)變化對細(xì)胞增殖的作用可能更直接[10]。miR-155的作用與癌基因相似，其活化后的作用與整合素的激活有關(guān)，引起腫瘤細(xì)胞遷移的能力增強(qiáng)。異常表達(dá)的miR-155可以表現(xiàn)為對導(dǎo)管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)作用，可能與對核因子等相關(guān)癌基因的調(diào)控有關(guān)[11-12]。保乳手術(shù)的重點(diǎn)為監(jiān)測術(shù)后復(fù)發(fā)情況，多種指標(biāo)雖然可以輔助判斷，但是其特異性較差[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)的檢測miR-21和miR-155的表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系可能為臨床判斷腫瘤的預(yù)后提供一種新的客觀指標(biāo)，同時(shí)也為臨床術(shù)后復(fù)發(fā)的判斷提供了指標(biāo)，聯(lián)合其它實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)可能對指導(dǎo)臨床工作具有一定價(jià)值[13-15]。

miR-21和miR-155的明顯升高可作為乳腺癌的危險(xiǎn)因素，同時(shí)患者采用保乳手術(shù)進(jìn)行治療，無論治療效果還是生活質(zhì)量都明顯升高。而術(shù)后監(jiān)測miR-21和miR-155的表達(dá)對判斷預(yù)后同樣具有一定價(jià)值。