石 林，劉薇婉，張帥帥，任翠愛(ài)

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse Large B Cell Lymphoma，DLBCL)是最常見(jiàn)的淋巴瘤類(lèi)型，約占成人非霍奇金淋巴瘤的30%～40%，在發(fā)展中國(guó)家所占比例更高。DLBCL在表觀遺傳學(xué)、治療反應(yīng)、預(yù)后等方面存在較大的異質(zhì)性。一線(xiàn)R-CHOP治療方案使60%患者能夠長(zhǎng)期生存，但仍有40%的患者存在治療無(wú)效或短暫緩解后復(fù)發(fā)的現(xiàn)象[1]。因此，積極尋找新的可以提示DLBCL患者預(yù)后的獨(dú)立生物標(biāo)志物，具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)篩選目標(biāo)基因 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.oncomine.org/resource/login.html)搜索設(shè)置是①分析類(lèi)型：Cancer vs Normal Analysis；②癌癥類(lèi)型：Diffuse Large B-Cell Lymphoma；③數(shù)據(jù)類(lèi)型：mRNA。設(shè)定條件：under-expression，選擇Diffuse Large B-Cell Lymphoma點(diǎn)擊compare進(jìn)行分析。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 分析ADD3在不同腫瘤的表達(dá)情況 搜索設(shè)置是①基因輸入：ADD3；②THRESHOLD(PVALUE):1E-4；THRESHOLD(FOLD CHANGE)：2；THRESHOLD(GENE RANK)：TOP 10%；③數(shù)據(jù)類(lèi)型：mRNA。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 分析ADD3在DLBCL樣本中的表達(dá) 搜索設(shè)置是①基因：ADD3；②癌癥類(lèi)型：Diffuse Large B-Cell Lymphoma；③數(shù)據(jù)類(lèi)型：mRNA/DNA。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載數(shù)據(jù)集組進(jìn)行生存分析 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)搜索設(shè)置是①分析類(lèi)型：Cancer vs Normal Analysis；②癌癥類(lèi)型：Diffuse Large B-Cell Lymphoma；③臨床數(shù)據(jù)：Survival Status；選擇合適的數(shù)據(jù)集，在PUBMED上下載數(shù)據(jù)集組，進(jìn)行生存分析。

1.5 基于GEPIA2在線(xiàn)分析網(wǎng)站驗(yàn)證ADD3基因與DLBCL異質(zhì)性生物特征分子的相關(guān)性 登錄GEPIA2網(wǎng)站(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)，選擇癌癥類(lèi)型DLBCL，對(duì)ADD3進(jìn)行“Correlation Analysis”驗(yàn)證。

1.6 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析驗(yàn)證ADD3在DLBCL不同亞組中表達(dá)情況 登陸癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)分析網(wǎng)站(UALCAN)(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)，①Gene Symbol：ADD3；②TCGA dataset：Lymphoid Neoplasm Diffuse Large B-cell Lymphoma。點(diǎn)擊“explore”；③Links for analysis：Expression，對(duì)不同亞組進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 分析篩選出目的基因ADD3 篩選結(jié)果顯示Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)共計(jì)收錄了40個(gè)有關(guān)DLBCL的數(shù)據(jù)合集，總計(jì)樣本數(shù)據(jù)2 194個(gè)。其中符合DLBCL中“Cancer vs Normal Analysis”設(shè)置的數(shù)據(jù)集共7個(gè)，總計(jì)551個(gè)樣本數(shù)據(jù)。篩選得到排名前200的低表達(dá)基因，除去已經(jīng)被研究報(bào)道過(guò)的基因，得到目的基因ADD3，ADD3在薈萃分析中，位于顯著低表達(dá)基因的104位，中位秩次492.0，P=0.02。

2.2ADD3在不同腫瘤中的差異表達(dá)情況 檢索ADD3在不同腫瘤中的差異性表達(dá)，結(jié)果顯示，Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)共收錄了有關(guān)ADD3的研究共692項(xiàng)，樣本數(shù)量總計(jì)82 519個(gè)。其中符合條件的數(shù)據(jù)集共455項(xiàng)，有5項(xiàng)研究顯示ADD3在腫瘤樣本中顯著高表達(dá)，26項(xiàng)研究顯示ADD3在腫瘤組織中顯著低表達(dá)，其中有11項(xiàng)研究顯示ADD3在淋巴瘤中低表達(dá)。這11項(xiàng)研究具體包括DLBCL，霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤。

2.3ADD3在DLBCL樣本中的表達(dá)情況 篩選出8個(gè)符合篩選條件的數(shù)據(jù)集，結(jié)果顯示其中7個(gè)數(shù)據(jù)集ADD3的mRNA表達(dá)量與正常樣本相比，均顯示出明顯的低表達(dá)，且所有差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ADD3的DNA表達(dá)量沒(méi)有明顯改變，提示ADD3 mRNA表達(dá)降低，可能是轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)異常，而不是DNA拷貝數(shù)減少的影響。其中Basso Lymphoma(Under-expression Gene Rank：24，P-value：9.24E-11，t-Test：-7.839，F(xiàn)old change：-2.975)，Alizadeh Lymphoma(Under-expression Gene Rank：27，P-value：1.01E-4，t-Test：-5.049，F(xiàn)old change：-2.716)，Brune Lymphoma(Under-expression Gene，Rank：2 375，P-value：0.004，t-Test：-3.077，F(xiàn)old change：-1.944)，Rosenwald Lymphoma(Under-expression Gene Rank：331，P-value：0.005，t-Test：-3.500，F(xiàn)old change：-1.491)，Compagno Lymphoma(Under-expression Gene Rank：537，P-value：2.15E-14，t-Test：-9.739，F(xiàn)old change：-2.220)，Rosenwald Multi-Cancer(Under-expression Gene Rank：492，P-value：0.002，t-Test：-3.259，F(xiàn)old change：-2.276)，Storz Lymphoma(Under-expression Gene Rank：1 513，P-value：0.011，t-Test：-2.869，F(xiàn)old change：-3.009)為分析mRNA表達(dá)的數(shù)據(jù)集，TCGA Lymphoma(Under-expression Gene Rank：3 809，P-value：0.140，t-Test：-1.117，F(xiàn)old change：-1.025)為分析DNA表達(dá)的數(shù)據(jù)集。

2.4ADD3對(duì)DLBCL患者的預(yù)后意義 Hummel Lymphoma Dataset(GSE4475數(shù)據(jù)集)使用Human Genome U133A Array基因表達(dá)譜芯片，共檢測(cè)221例淋巴瘤患者，包括28例非典型伯基特淋巴瘤患者，8例伯基特淋巴瘤患者，1例伯基特白血病患者，18例成熟B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤患者和166例DLBCL患者，該數(shù)據(jù)集同時(shí)包含了患者的治療經(jīng)歷，基因異位情況，總體生存時(shí)間等，其中具有完整生存信息的123例。Lenz Lymphoma Dataset(GSE10846數(shù)據(jù)集)使用Affymetrix U133 Plus 2.0 microarrays基因芯片，共檢測(cè)414例初治的DLBCL患者，該數(shù)據(jù)集還包含了患者的化療方案，總體生存時(shí)間，年齡，性別，疾病分期等數(shù)據(jù)。Shaknovich Lymphoma Dataset(GES23501數(shù)據(jù)集)同樣使用Affymetrix U133 Plus 2.0 microarrays基因芯片，共檢測(cè)69例DLBCL患者的基因表達(dá)狀況，同時(shí)記錄患者的年齡，性別，疾病分期，總體生存狀況等。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載上述3個(gè)數(shù)據(jù)集原始數(shù)據(jù)，分析DLBCL患者的生存預(yù)后與ADD3表達(dá)量之間的關(guān)系。兩個(gè)數(shù)據(jù)集生存分析結(jié)果皆顯示，ADD3低表達(dá)組預(yù)后更差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖1(A)、(B)。Hummel Lymphoma Dataset中共收集了166例DLBCL患者數(shù)據(jù)，去除缺少生存預(yù)后數(shù)據(jù)的樣本，符合條件的樣本共有123個(gè)，ADD3低表達(dá)組的中位生存期為12.8個(gè)月，高表達(dá)組為55.3個(gè)月，HR=0.531 3(0.323 1～0.873 6)，P=0.012 7，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Lenz Lymphoma Dataset(n=414)，ADD3低表達(dá)組中位生存期為4.13年，高表達(dá)組未達(dá)，HR=0.5642(0.415 0～0.767 0)，P=0.000 3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖1(C)為Shaknovich Lymphoma Dataset(n=69)數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果，P=0.141 1，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本數(shù)量較少有關(guān)。由于ShaknovichLymphoma Dataset與Lenz Lymphoma Dataset數(shù)據(jù)集均使用Affymetrix U133 Plus 2.0 microarrays基因芯片，整合兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示，ADD3低表達(dá)組中位生存期為6.08年，高表達(dá)組未達(dá)，HR=0.579 3(0.431 1～0.778 5)，P=0.000 4，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖1(D)。由于Lenz Lymphoma的患者分別使用了CHOP化療方案(n=181)和Rituximad-CHOP化療方案(n=233)，為了區(qū)分不同治療方案所導(dǎo)致的生存差異，因此，將Lenz Lymphoma分為CHOP-treated和Rituximad-CHOP-treated兩個(gè)亞組，分別進(jìn)行生存分析和表達(dá)量分析，結(jié)果顯示，在不同亞組間，ADD3的表達(dá)量無(wú)明顯差異，且ADD3低表達(dá)組預(yù)后皆為不良，圖1(E)、(F)、(G)。

圖1 ADD3表達(dá)水平與患者預(yù)后關(guān)系

2.5ADD3低表達(dá)為DLBCL的預(yù)后不良因素，與年齡、性別等因素?zé)o關(guān) 對(duì)Hummel Lymphoma Dataset，Lenz Lymphoma Dataset進(jìn)行亞組分析(由于Shaknovich Lymphoma Dataset樣本量較少，故不再進(jìn)行亞組分析)，圖2(A)、(B)，Hummel Lymphoma Dataset數(shù)據(jù)集顯示，DLBCL中ADD3的表達(dá)量在性別和年齡亞組無(wú)顯著差異。圖2(C)顯示，Lenz Lymphoma Dataset中，在性別亞組，ADD3的表達(dá)量無(wú)明顯差異。圖2(D)顯示，Lenz Lymphoma Dataset中，在年齡亞組，21～40歲年齡組，ADD3的表達(dá)量要高于41～60歲(P=0.006)、61～80歲(P=0.013)、81～100歲(P=0.002)年齡組。由于81～100歲年齡組人數(shù)較少，且41～60歲、61～80歲、81～100歲年齡組中ADD3的表達(dá)量無(wú)明顯差異，因此，將樣本分為21～40歲年齡組和41～100歲年齡組兩個(gè)亞組進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在21～40歲亞組中，ADD3低表達(dá)組預(yù)后更差，HR=0.101 8(0.022 83～0.454 2)，P=0.002 7，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖2(E)。41～100歲年齡組中，ADD3低表達(dá)組中位OS為3.93年，ADD3高表達(dá)組的中位OS為7.49年，HR=0.618 5(0.451 4～0.847 4)，P=0.003 1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖2(F)。在不同年齡亞組中，ADD3低表達(dá)組預(yù)后皆為不良。

圖2 DLBCL的預(yù)后不良因素

2.6ADD3與DLBCL異質(zhì)性生物特征分子呈弱相關(guān)性 比較顯示ADD3與DLBCL異質(zhì)性生物特征分子c-Myc(P=0.014，R=0.36)，Bcl2(P=0.000 55，R=0.49)，P53(P=0.003 1，R=0.42)等呈弱相關(guān)性。

2.7 UALCAN網(wǎng)站驗(yàn)證ADD3在DLBCL不同亞組的表達(dá) 數(shù)據(jù)庫(kù)分析網(wǎng)站(UALCAN)，對(duì)DLBCL中疾病階段，種族，性別，體質(zhì)量，年齡以及TP53突變等亞組進(jìn)行逐個(gè)分析，結(jié)果顯示DLBCL中ADD3的表達(dá)與疾病階段，種族，性別，體質(zhì)量，年齡以及TP53突變等無(wú)關(guān)，圖3。

圖3 ADD3在DLBCL不同亞組的表達(dá)

3 討論

DLBCL是具有高度侵襲性的非霍奇金淋巴瘤，根據(jù)Globalcancerstatistics 2018的最新統(tǒng)計(jì)[2]，非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病率占全球癌癥發(fā)病率的2.8%，死亡率占全球癌癥致死率的2.6%，雖然一線(xiàn)R-CHOP化療方案使得DLBCL患者的生存率大大提高，但由于臨床與病理診斷的異質(zhì)性與復(fù)雜性，仍有部分DLBCL患者，存在難治與緩解后復(fù)發(fā)等現(xiàn)象[3]，目前Bcl2，c-Myc，P53突變等遺傳學(xué)異常已被證實(shí)與DLBCL的預(yù)后相關(guān)[4-5]，因此，尋找新的預(yù)后生物標(biāo)志物，對(duì)于治療DLBCL具有重要的臨床意義。

Ocomine數(shù)據(jù)庫(kù)是目前全球最大的癌癥基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)收納整合了全球權(quán)威研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表在專(zhuān)業(yè)雜志上的公開(kāi)數(shù)據(jù)，主要包括腫瘤相關(guān)RNA和DNA等數(shù)據(jù)，是用于挖掘癌癥基因信息的權(quán)威數(shù)據(jù)平臺(tái)。癌癥基因圖譜(TCGA)是由美國(guó)癌癥基因研究所和美國(guó)人類(lèi)基因組研究所合作啟動(dòng)的項(xiàng)目計(jì)劃，收錄了人類(lèi)不同癌癥的臨床數(shù)據(jù)，基因組變異數(shù)據(jù)，mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，甲基化數(shù)據(jù)等，是癌癥研究的重要數(shù)據(jù)來(lái)源。目前基于數(shù)據(jù)庫(kù)分析，已成功挖掘出肺腺癌的靶基因KRAS[6]，多發(fā)性骨髓瘤的生物靶點(diǎn)CD200[7]，胰腺癌的生物靶點(diǎn)MALAT1[8]等，且均已得到驗(yàn)證。

ADD3(Adducin 3)屬于Adducins家族，又名adducin γ，位于染色體10q24.2～24.3，是膜蛋白與肌動(dòng)蛋白連接處的骨架蛋白，參與血紅蛋白中血影蛋白-肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，離子轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與細(xì)胞增殖等生命活動(dòng)[9]。目前關(guān)于ADD3的研究較少，Karrie[10]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)的ADD3在多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中具有致癌作用，并且ADD3喪失功能的多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞能夠通過(guò)VEGF/VEGFR2信號(hào)傳導(dǎo)刺激內(nèi)皮細(xì)胞激活，促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成。在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，ADD3的耗竭，加速了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移[11]。在膽道閉鎖的研究中顯示，ADD3基因沉默的小鼠與野生型小鼠相比，臟器纖維化程度更高，并通過(guò)與NK細(xì)胞作用，導(dǎo)致膽道閉鎖的發(fā)生[12]。Fan的研究顯示[13]，通過(guò)敲降A(chǔ)DD3的表達(dá)，會(huì)損害腎傳入小動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈的肌源性反應(yīng)，并影響B(tài)K通道活性。高度的侵襲性是DLBCL的主要生物學(xué)特征，常常侵犯淋巴結(jié)組織及周?chē)鞴?，使其?fù)發(fā)率高，預(yù)后效果差，ADD3的耗竭可能是通過(guò)減少細(xì)胞-細(xì)胞之間或細(xì)胞-基質(zhì)之間的接觸，解除細(xì)胞抑制，促進(jìn)DLBCL細(xì)胞遷移，同時(shí)激活血管生長(zhǎng)，促進(jìn)了DLBCL的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，ADD3在DLBCL中低表達(dá)，且與預(yù)后呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性，ADD3的功能喪失可能會(huì)解除細(xì)胞之間的接觸抑制，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，有望作為DLBCL的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物，為治療和預(yù)防DLBCL提供參考靶點(diǎn)。