隋沂言 陳 穎 李 琰 劉曼華 錢 霖 湯 露 汪廣劍 瞿發(fā)林

精神分裂癥是一種重性精神疾病，現(xiàn)已成為全球高發(fā)疾病，該疾病的治療是一個非常復(fù)雜的過程。雖然藥物是精神分裂癥臨床主要治療手段，但是常用的抗精神分裂癥藥物普遍存在療效和不良反應(yīng)等方面的明顯個體差異性，導(dǎo)致重性精神分裂癥藥物治療有效率僅為30%～50%[1]。越來越多的研究表明，藥物代謝酶的基因特征是導(dǎo)致精神分裂癥發(fā)病和藥物反應(yīng)差異的重要因素[2]，因此檢測與藥物療效相關(guān)的基因多態(tài)性，可以為患者用藥種類及劑量方面提供理論依據(jù)，從而提高疾病治愈率。

細(xì)胞色素P450(CYP450)同工酶是體內(nèi)藥物代謝的主要酶系，它的多種同工酶參與了抗精神分裂癥藥物的代謝，其中主要有CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9等[3]，其酶活性受單核苷酸多態(tài)性影響，在不同個體或種族之間往往存在很大差異。目前對基因多態(tài)性的統(tǒng)計多集中在健康人群，對患病人群情況研究較少。本研究對中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九○四醫(yī)院精神分裂癥患者代謝酶CYP1A2*1C(3860G>A)、CYP1A2*1F(163C>A)、CYP2C19*3(636G>A)、CYP2C19*2(681G>A)、CYP2D6*2(2850C>T)、CYP2D6*10(100C>T)、CYP2D6*5(Wild>Del)共7個位點(diǎn)進(jìn)行了檢測，旨在比較健康人群與精神分裂癥患者代謝酶遺傳多態(tài)性的差異，探討遺傳多態(tài)性在精神分裂癥病因?qū)W中的作用。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2019年1月～2020年5月中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九○四醫(yī)院精神分裂癥患者基因檢測信息，入組患者均符合國際疾病分類第10版(ICD-10)精神分裂癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)患者服用的抗精神病藥物選擇不同的藥物代謝酶基因檢測，其中332例患者接受CYP1A2基因分型檢測，男219例，女113例；124例患者接受CYP2C19基因分型檢測，男81例，女43例；161例患者接受CYP2D6基因分型檢測，男119例，女42例?；颊呔鶠樘K南地區(qū)漢族人。

健康對照：CYP1A2基因分型健康對照來自元靜等[4]研究中接受CYP1A2基因分型檢測的100名中國漢族健康人群；CYP2C19、CYP2D6基因分型健康對照來自Dorji PW等[5]統(tǒng)計分析的Pubmed數(shù)據(jù)庫2018年4月～2019年2月基因多態(tài)性數(shù)據(jù)中接受CYP2C19、CYP2D6基因分型檢測的中國漢族人群。

1.2 方法

1.2.1 檢測儀器與試劑 PYROSEQ-E16焦磷酸測序儀(武漢菲思特生物科技有限公司)；Life Pro基因擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司)；Neofuge 13R臺式高速冷凍離心機(jī)(上海力新儀器有限公司)；BioPhotomete核酸蛋白測定儀(德國艾本德股份公司)；HB-100恒溫金屬浴(杭州博日科技有限公司)；MX-M 96孔板混勻儀(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司)。上海百傲科技股份有限公司核酸提取及純化試劑、菲思特生物科技有限公司PCR反應(yīng)試劑(擴(kuò)增液、擴(kuò)增酶、引物對)、菲思特生物科技有限公司測序反應(yīng)通用試劑[微珠、結(jié)合緩沖液、變性液、退火緩沖液、測序酶、測序底物、堿基A(dATPαS)、堿基T(dTTP)、堿基G(dGTP)、堿基C(dCTP)和DNase//RNase-free去離子水]。

1.2.2 基因型測定方法

1.2.2.1 人全血標(biāo)本DNA提取 抽取外周靜脈血5 ml，EDTA抗凝，按照上海百傲科技股份有限公司的核酸提取及純化試劑盒流程提取基因組DNA，核酸蛋白測定儀測定濃度后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增待測片段 采用菲思特生物科技有限公司全套試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性25 s，65 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，進(jìn)行20次循環(huán)(其中CYP2D6*5為95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行50次循環(huán))；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.2.3 單鏈制備 向PCR產(chǎn)物中加入結(jié)合緩沖液(含微珠)，置于臺式震蕩混勻儀1 100 rpm震蕩15 min，使DNA充分結(jié)合；結(jié)合后將混合物轉(zhuǎn)移至純化柱，離心，洗滌后，加入變性液靜止5 min，使DNA雙鏈解旋變成單鏈DNA；取潔凈的EP管加入退火緩沖液和測序引物，將上步純化柱套在EP管上離心，測序引物與單鏈DNA退火；將混合物轉(zhuǎn)移至測序管，加入測序酶和測序底物，待測。

1.2.2.4 焦磷酸測序儀測序 測序儀將四種堿基dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)選擇性地加入到測序反應(yīng)體系中，將可與單鏈模板配對的dNTP與測序引物末端形成共價鍵，dNTP的焦磷酸基團(tuán)釋放出來后被催化形成ATP，熒光素酶在ATP的驅(qū)動下將熒光素轉(zhuǎn)化為氧化熒光素，釋放熒光的量與產(chǎn)生ATP量成正比，從而判讀堿基序列。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同性別患者CYP1A2基因型及等位基因分布比較 332例患者進(jìn)行了CYP1A2*1C、*1F兩個位點(diǎn)的檢測，基因型及等位基因分布見表1，其中CYP1A2*1C純合突變基因型(AA)所占比率較低。CYP1A2*1F位點(diǎn)AA基因型及A等位基因頻率，男性均大于女性(P<0.05)。

表1 不同性別CYP1A2基因型及等位基因分布比較[n(%)]

2.2 不同性別患者CYP2C19基因型及等位基因分布比較 124例患者進(jìn)行了CYP2C19*3、*2兩個位點(diǎn)的檢測，基因型及等位基因分布見表2，其中CYP2C19*3位點(diǎn)純合突變型(AA)男女性別中均未檢測到。兩位點(diǎn)不同性別患者的基因型及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 不同性別CYP2C19基因型及等位基因分布比較[n(%)]

2.3 不同性別患者CYP2D6基因型及等位基因分布比較 161例患者進(jìn)行了CYP2D6*2、*10、*5三個位點(diǎn)的檢測，基因型及等位基因分布見表3，其中CYP2D6*2、*5純合突變型(TT，Del/Del)、CYP2D6*5雜合突變型(Wild/Del)所占比率均較低。三個位點(diǎn)不同性別患者的基因型及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 不同性別CYP2D6基因型及等位基因分布比較[n(%)]

2.4 精神分裂癥患者與健康人群CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6等位基因分布比較 精神分裂癥患者CYP1A2*1C、CYP1A2*1F等位基因頻率與元靜等[4]研究中健康對照數(shù)據(jù)相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；精神分裂癥患者CYP2C19*3、CYP2C19*2等位基因頻率與Dorji PW等[5]研究中健康對照數(shù)據(jù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，CYP2D6*2、CYP2D6*10、CYP2D6*5等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

表4 CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6等位基因在精神分裂癥患者與健康人群中的分布比較[n(%)]

3 討論

CYP1A2代謝酶主要介導(dǎo)抗精神分裂癥藥物氯丙嗪、奧氮平、氯氮平等在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過程，其主要的功能性單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為CYP1A2*1C和CYP1A2*1F[6]。CYP1A2代謝酶活性個體差異大，可受吸煙、藥物、基因等因素的影響[7]。Olsson E等[8]認(rèn)為，CYP1A2*1F與氯氮平血藥濃度之間存在相關(guān)性；Lane HY等[9]研究表明，精神分裂癥患者服用氯氮平后，女性患者血藥濃度高于男性。本研究結(jié)果顯示，精神分裂癥患者的CYP1A2*1F位點(diǎn)男性突變率高于女性，因CYP1A2*1F可使CYP1A2酶活性增強(qiáng)，從而增加CYP1A2介導(dǎo)代謝的藥物清除率，降低其血藥濃度。這與Lane HY等[9]等的研究結(jié)果相一致，提示精神分裂癥患者CYP1A2*1F突變在人群中分布可能存在性別差異。有研究顯示，該位點(diǎn)基因多態(tài)性與抗精神病藥物的不良反應(yīng)相關(guān)[10]，因此精神分裂癥患者服用藥物的不良反應(yīng)發(fā)生率可能也存在性別差異。

CYP2C19是CYP450酶系家族第二亞家族的重要成員，參與大量精神科藥物的代謝，包括氯氮平、舍曲林、西酞普蘭等。本研究中CYP2C19*2、CYP2C19*3位點(diǎn)不同性別患者基因型及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，與健康人群的等位基因頻率相比較，差異也不存在統(tǒng)計學(xué)意義，這與婁小燕等[11]的研究結(jié)果一致，提示CYP2C19可能不是精神分裂癥的易感因素。

CYP2D6是CYP450酶系統(tǒng)家族中具有兩態(tài)分布的亞族，參與代謝的藥物譜較為廣泛，其中抗精神分裂癥藥物中主要介導(dǎo)阿立哌唑、利培酮、氟哌啶醇等的代謝。本研究結(jié)果中精神分裂癥患者CYP2D6 3個位點(diǎn)的突變率高于健康人群，提示CYP2D6基因多態(tài)性可能是精神分裂癥的易感因素，猜測3個位點(diǎn)可能參與了精神分裂癥的病理過程。以往研究顯示，CYP2D6基因多態(tài)性與癌癥、帕金森病及一些精神疾病的易感有關(guān)[12～14]，同時一些疾病不良反應(yīng)的發(fā)生也與該基因多態(tài)性相關(guān)[15，16]，提示CYP2D6基因多態(tài)性在精神疾病發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要的作用，但是這些結(jié)果同時也存在爭議，因此仍需大樣本量的人群進(jìn)一步驗(yàn)證。

基因多態(tài)性在不同地區(qū)不同人群往往表現(xiàn)出差異性，因此人群遺傳學(xué)的研究顯得至關(guān)重要。本研究重點(diǎn)探索了蘇南地區(qū)漢族精神分裂癥患者的基因多態(tài)性，可以為醫(yī)生個體化用藥選擇和預(yù)防不良反應(yīng)發(fā)生提供重要參考。但是，本研究的樣本量相對較小，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證；同時，課題組今后將更加注重藥物基因組學(xué)與臨床實(shí)踐的結(jié)合，為個體化精準(zhǔn)醫(yī)療的開展提供理論依據(jù)。