蔡秀珍 張曼 劉濤

1濰坊市中醫(yī)院藥學(xué)部，濰坊 261041；2濰坊市腦科醫(yī)院藥劑科，濰坊 261021

【提要】 采用CCK8檢測(cè)胰腺癌PANC1細(xì)胞的存活率，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)與細(xì)胞增殖、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的蛋白表達(dá)等方法探討黃芪甲苷對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示，黃芪甲苷干預(yù)PANC1細(xì)胞后可抑制細(xì)胞的存活率，顯著減少遷移和穿膜的細(xì)胞數(shù)量，影響相關(guān)蛋白的表達(dá)，提示黃芪甲苷抑制胰腺癌PANC1細(xì)胞生長的機(jī)制可能與其抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程有關(guān)。

黃芪甲苷是中藥黃芪天然活性成分提取物之一，具有許多藥理作用，如抑制炎癥、抗氧化、降低血糖、調(diào)節(jié)脂肪及能量代謝、抗纖維化、調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤等[1-6]。早期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可以通過PKC-α-ERK1/2-NF-κB信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞A549的遷移和侵襲[7]。然而黃芪甲苷是否對(duì)胰腺癌發(fā)揮同樣的抗腫瘤作用尚不明確。本研究探討黃芪甲苷對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞的作用及其機(jī)制，為胰腺癌的治療提供新的策略。

一、材料與方法

1．PANC1細(xì)胞增殖活性檢測(cè)：胰腺癌PANC1細(xì)胞購自ATCC，常規(guī)復(fù)蘇并傳代。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，接種于96孔板，每孔3×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)過夜后將溶解于DMSO的終濃度為1、2.5、5、7.5 μg/ml的黃芪甲苷(成都科程生物科技開發(fā)公司)分別孵育細(xì)胞24、48、72、96 h，以單加DMSO作為對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)到相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，避光每孔加入10 μl CCK8(武漢博士德生物公司)，繼續(xù)孵育2 h，上酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在450 nm處吸光度值(A450值)。篩選出合適的黃芪甲苷濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2．PANC1細(xì)胞遷移能力檢測(cè)：取對(duì)照組和黃芪甲苷組對(duì)數(shù)生長期PANC1細(xì)胞，分別以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)過夜后，用200 μl無菌槍頭劃痕，PBS輕輕沖洗后加入含合適濃度黃芪甲苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)0、24 h，拍照計(jì)算遷移到痕跡空白處的細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取均值。

3．PANC1細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)：取對(duì)照組和黃芪甲苷組對(duì)數(shù)生長期PANC1細(xì)胞，接種1×106細(xì)胞/100 μl于隔膜鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室(美國BD公司)的上室，下室加500 μl培養(yǎng)液，培養(yǎng)孵育24 h后，取出小室隔膜，用棉簽輕輕擦去隔膜上室面未穿膜細(xì)胞，將隔膜置于4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，光鏡下計(jì)算高倍鏡下的穿膜細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)置3個(gè)小室，取均值。

4．相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)：收集對(duì)照組和黃芪甲苷組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液(美國賽默飛公司)，冰上裂解30 min。離心取上清，應(yīng)用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Thermo公司)測(cè)定蛋白濃度。取30～40 μg蛋白，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖能力的蛋白PCNA[8]、細(xì)胞凋亡的效應(yīng)蛋白caspase3[9]、上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、vimentin表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。所有一抗均購于英國Abcam公司，按相應(yīng)抗體說明書推薦比例稀釋一抗。最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

二、結(jié)果

1．黃芪甲苷抑制胰腺癌PANC1細(xì)胞的存活：與對(duì)照組比較，1 μg/ml黃芪甲苷組存活細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2.5、5、7.5 μg/ml黃芪甲苷組的存活細(xì)胞數(shù)量呈劑量及時(shí)間依賴性地減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。5 μg/ml與7.5 μg/ml黃芪甲苷組的存活細(xì)胞數(shù)量在不同時(shí)間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，故選擇5 μg/ml黃芪甲苷組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1)。

2．黃芪甲苷抑制胰腺癌PANC1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡：與對(duì)照組比較，黃芪甲苷組PCNA蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(1.32±0.12比0.86±0.16，t=5.142，P=0.007，圖2A)，caspase3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(0.45±0.17比0.87±0.15，t=4.142，P=0.004，圖2B)，表明黃芪甲苷組胰腺癌PANC1細(xì)胞存活數(shù)量減少可能是由于黃芪甲苷抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所引起。

3．黃芪甲苷抑制胰腺癌PANC1細(xì)胞的遷移和侵襲能力：劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪甲苷組的遷移細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著減少(76.35±11.32比52.34±9.46，圖3A～3B)；穿膜細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著減少(135.24±12.45比54.69±25.39，圖3C～3D)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為3.623、6.369，P值分別為0.022、0.003)，表明黃芪甲苷可抑制胰腺癌PANC1細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖1 不同濃度黃芪甲苷對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞增殖的影響

圖2 對(duì)照組(1)、黃芪甲苷組(2)PANC1細(xì)胞PCNA(2A)和caspase3(2B)蛋白表達(dá)

圖3 對(duì)照組、黃芪甲苷組的PANC1細(xì)胞遷移(3A～3B)和侵襲(3C～3D)能力

4．黃芪甲苷抑制胰腺癌PANC1細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程：與對(duì)照組比較，黃芪甲苷組E-cadherin表達(dá)上調(diào)(0.35±0.09比0.96±0.15)，N-cadherin(0.45±0.08比0.27±0.08)和vimentin(0.37±0.07比0.21±0.05)表達(dá)均下調(diào)(圖4)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為7.797、3.558、4.159，P值均<0.05)，提示黃芪甲苷可能通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程進(jìn)而抑制胰腺癌PANC1的遷移和侵襲能力。

圖4 對(duì)照組(1)、黃芪甲苷組(2)PANC1細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)

討論早期胰腺癌首選手術(shù)治療，術(shù)后輔助進(jìn)行化療，以控制潛在的腫瘤細(xì)胞微轉(zhuǎn)移[10-11]。有研究表明，5-氟尿嘧啶加亞葉酸或吉西他濱的輔助化療可將胰腺癌患者5年生存率提高到16%～21%[12]。然而，腫瘤的早期復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及腫瘤耐藥等問題仍是胰腺癌臨床治療亟待解決的難題。近年來，從中藥中提取的單體在各種惡性腫瘤的治療及輔助治療的研究廣泛開展。目前有研究表明黃芪甲苷通過抑制AKT信號(hào)通路增強(qiáng)阿帕替尼對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的抗腫瘤作用[13]，但黃芪甲苷對(duì)胰腺癌細(xì)胞的作用尚不清楚。

本研究應(yīng)用黃芪甲苷處理胰腺癌PANC1細(xì)胞，結(jié)果顯示，黃芪甲苷處理后呈劑量和時(shí)間依賴性抑制PANC1細(xì)胞存活率，同時(shí)下調(diào)細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)，上調(diào)caspase3蛋白表達(dá)，表明黃芪甲苷不僅可以抑制細(xì)胞增殖，且能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，黃芪甲苷處理還能顯著減少遷移和穿膜的細(xì)胞數(shù)量，表明黃芪甲苷能抑制PANC1細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

為深入研究黃芪甲苷的作用機(jī)制，本研究檢測(cè)了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示黃芪甲苷處理后PANC1細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin和vimentin表達(dá)均下調(diào)，提示黃芪甲苷可能通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程進(jìn)而抑制胰腺癌PANC1細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，黃芪甲苷可顯著抑制胰腺癌PANC1細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，從而抑制胰腺癌的發(fā)生發(fā)展，有望成為治療胰腺癌的新型藥物靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突