席曉宇 李冰 鄭少杰 鐘長青 李連勇

戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科，北京 100101

【提要】 類器官是應(yīng)用體外3D培養(yǎng)技術(shù)建立的結(jié)構(gòu)和功能上類似于器官的小型組織，具有組織自我更新及可長期培養(yǎng)的特點(diǎn)。近年來，腫瘤類器官模型作為一種新的模型，在腫瘤發(fā)生機(jī)制、藥物篩選、精準(zhǔn)醫(yī)療、器官移植等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。本文重點(diǎn)討論類器官在胰腺癌研究中的構(gòu)建及應(yīng)用研究進(jìn)展。

目前，胰腺癌研究領(lǐng)域中常用的模型是腫瘤細(xì)胞系(patient-derived cancer cell lines，PDC)和人源腫瘤異種移植模型(patient-derived tumor xenograft，PDX)。PDC培養(yǎng)條件簡單，體外可無限增殖，但其無法模擬腫瘤體內(nèi)生長環(huán)境，不能代表腫瘤本身的異質(zhì)性，缺少空間組織性和多種細(xì)胞類型等[1]。PDX能夠在一定程度上模擬體內(nèi)微環(huán)境，也能較大程度保留腫瘤異質(zhì)性，但存在實(shí)驗(yàn)周期長、移植成功率低、成本高等局限性，這在很大程度上限制了臨床研究的進(jìn)展[2]。近年來，體外3D腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)模型，尤其是類器官模型受到了研究者的廣泛關(guān)注。與PDC和PDX相比，腫瘤類器官可以更近似地模擬來源組織的結(jié)構(gòu)、功能及生長環(huán)境，具有培養(yǎng)成功率高、培養(yǎng)周期短、保真性高等優(yōu)點(diǎn)。因此，類器官技術(shù)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究、藥物篩選、個(gè)體化治療研究、器官移植等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，已成為消化系統(tǒng)腫瘤研究的熱點(diǎn)。本文就類器官在胰腺癌研究中的構(gòu)建及應(yīng)用做一綜述。

一、類器官的概念

類器官是利用干細(xì)胞的自我更新及分化能力，在體外培養(yǎng)形成的一種在細(xì)胞成分、組織架構(gòu)及特定功能等方面與相應(yīng)器官高度相似的小型組織，實(shí)現(xiàn)了在體外培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)特定器官的復(fù)制[3]。由于類器官具有可大規(guī)模培養(yǎng)、培養(yǎng)時(shí)間較短、保真性高等特點(diǎn)，故成為腫瘤研究和治療的可靠模型。近年來已有多種腫瘤類器官成功構(gòu)建，并應(yīng)用于腫瘤基因組學(xué)及抗腫瘤藥物篩選等，特別是為個(gè)性化癌癥治療開辟了新的視野。

二、胰腺癌類器官的構(gòu)建

腫瘤類器官是保留原發(fā)腫瘤組織學(xué)和遺傳學(xué)特征的原發(fā)腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)物，其培養(yǎng)需要初始條件(包括起始細(xì)胞類型)、物理?xiàng)l件(基質(zhì)膠)、生長因子及信號(hào)傳導(dǎo)。胰腺癌類器官構(gòu)建一般來源于外科手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本或活檢組織，比如細(xì)針穿刺。在一項(xiàng)大規(guī)模的隊(duì)列研究中分離和傳代的胰腺癌類器官模型在切除腫瘤標(biāo)本及細(xì)針活檢之間具有相當(dāng)?shù)南嗨菩?>70%)，這使得在胰腺癌的各個(gè)階段都能產(chǎn)生類器官模型[4]。活檢組織經(jīng)過酶處理后，可嵌入基質(zhì)內(nèi)或在氣液界面培養(yǎng)。胰腺癌類器官構(gòu)建需要添加EGF(分裂素)、R-spondin-1(增信號(hào))、 Noggin(抑制BMP信號(hào))和Wnt3a等，另外還需煙酰胺、FGF10(絲裂原)、A83-01(Alk抑制劑)、前列腺素E(PGE、絲裂原)，進(jìn)行長期擴(kuò)增[5]。初始培養(yǎng)條件根據(jù)原始組織中起始細(xì)胞的類型選取不同的培養(yǎng)基，胰腺癌類器官的基礎(chǔ)培養(yǎng)基一般為Advanced DMEM/F-12培養(yǎng)基。在最佳生長狀態(tài)下，胰腺癌類器官可在20～45 d左右形成。胰腺癌類器官的構(gòu)建方法目前隨著研究不斷改進(jìn)，構(gòu)建成功率與培養(yǎng)速度也逐漸提高。

三、胰腺癌類器官的應(yīng)用與研究

1．在胰腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的研究：腫瘤從發(fā)生、發(fā)展到惡化、轉(zhuǎn)移及藥物抵抗是一個(gè)復(fù)雜的多環(huán)節(jié)相互聯(lián)系的過程。而利用類器官技術(shù)建立不同演變階段的腫瘤模型，可以為腫瘤各階段機(jī)制的研究工作提供可用的優(yōu)質(zhì)平臺(tái)。研究表明胰腺癌的發(fā)生與多種基因改變有關(guān)，如致癌基因(K-ras等)的激活和抑癌基因(TP53、p16/CDKN2A、SMAD4、BRCA2等)的失活。目前已知有MAPK、Wnt、Notch、Hedgehog、PI3K/AKT等信號(hào)通路參與。胰腺癌進(jìn)展過程中也存在大量基因改變，如K-ras、TP53基因突變?cè)斐蒞nt、MAPK、Notch信號(hào)持續(xù)激活，易導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。2015年，Boj等[6]率先報(bào)道了小鼠和人胰腺癌的3D類器官模型，可以移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生類似胰腺上皮內(nèi)瘤變的侵襲前病變，進(jìn)而表現(xiàn)出侵襲性腺癌并轉(zhuǎn)移的特異性。Moreira等[7]采用RNAseq和質(zhì)譜分析對(duì)小鼠胰腺三維器官進(jìn)行了基因表達(dá)和蛋白組學(xué)分析，觀察到基因和蛋白組學(xué)特征與胰腺腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。Bailey等[8]結(jié)合了來自456個(gè)胰腺癌全基因組、外顯子和RNA測序分析定義了4種不同的胰腺導(dǎo)管腺癌亞型(鱗癌、胰腺祖細(xì)胞腫瘤、免疫原性亞型和異常分化的內(nèi)外分泌腫瘤)，并將每種亞型與特定的分子通路、組織病理學(xué)特征和生存率聯(lián)系起來，其結(jié)果有助于發(fā)現(xiàn)潛在的靶向治療方法。以上研究均顯示，胰腺癌類器官為胰腺癌發(fā)生機(jī)制和特定基因功能的研究提供了一個(gè)全新的平臺(tái)。

2．在抗腫瘤藥物篩選中的應(yīng)用：近年來，包括免疫治療藥物在內(nèi)的靶向藥物改善了患者的預(yù)后，但部分患者仍無法從現(xiàn)有治療中獲益。由于腫瘤異質(zhì)性的存在，患者個(gè)體差異和藥效之間存在密切關(guān)系，甚至同一腫瘤中不同癌細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)也有顯著差異。胰腺癌通常發(fā)現(xiàn)較晚，只有10%～15%的患者可行手術(shù)治療，而對(duì)無法手術(shù)切除的胰腺癌患者，類器官為抗腫瘤藥物精準(zhǔn)篩選提供了可靠的選擇，從胰腺癌患者的腫瘤組織中提取并構(gòu)建的類器官用于高通量藥物篩選，更有助于篩選有效藥物[9]。Tiriac等[10]利用156例患者來源的類器官，建立了一個(gè)平臺(tái)來測試單藥化療和靶向藥物治療，結(jié)果顯示胰腺癌類器官的治療效果與患者的結(jié)果相一致。Huang等[11]研發(fā)出了一種利用三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從胰腺癌患者組織中擴(kuò)增和培養(yǎng)原代癌細(xì)胞類器官，并進(jìn)行了藥物檢測。研究者使用吉西他濱和表觀遺傳抑制劑處理5例患者的腫瘤類器官，結(jié)果顯示5個(gè)樣本對(duì)藥物有不同的敏感度，且敏感度與耐藥生物標(biāo)志物呈正相關(guān)，胰腺癌類器官能夠在體外保留患者組織本身對(duì)新型藥劑的敏感性。盡管這是一個(gè)小樣本測試，但它證明了使用類器官技術(shù)研究測試腫瘤異質(zhì)性的可行性，此技術(shù)有望建立多個(gè)患者腫瘤組織的活體樣本庫用于研究個(gè)體患者的特異致病機(jī)制，有助于針對(duì)性研究和個(gè)體化的藥物測試[12]。

3．在胰腺癌個(gè)體化治療中的研究：個(gè)體化治療是腫瘤治療的趨勢，而胰腺癌類器官模型可用來進(jìn)行有針對(duì)性的研究和篩選靶向藥物[13-14]。研究表明，腫瘤反應(yīng)、進(jìn)展與器官樣體對(duì)特定治療方案的敏感性、耐藥性之間有良好的相關(guān)性，這表明器官樣體系統(tǒng)可預(yù)測治療結(jié)果[15]。隨著胰腺癌生物活體組織庫的建立，研究者使用腫瘤和鄰近正常的器官進(jìn)行了深入的基因組和轉(zhuǎn)錄組分析，從而對(duì)腫瘤特異性的DNA和RNA變異進(jìn)行比較和識(shí)別，利用自動(dòng)化定量高通量篩選系統(tǒng)，可以更好地發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證新型藥物，模擬和研究靶向藥物[16]。在臨床腫瘤治療中，可以單一或組合藥物進(jìn)行敏感性篩選，然后在個(gè)體胰腺癌類器官模型中進(jìn)行驗(yàn)證，確定每個(gè)患者的藥物治療有效方案，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。目前使用胰腺癌類器官進(jìn)行個(gè)體化治療的研究有限，但在這些初步研究結(jié)果的支持下，相信未來胰腺類器官可進(jìn)一步推進(jìn)胰腺癌的個(gè)體化治療。

四、胰腺癌類器官的局限性

類器官具有顯著優(yōu)勢，但仍存在一定局限性。首先類器官通常保留多個(gè)類型細(xì)胞，模型中缺乏神經(jīng)、血管及免疫細(xì)胞，限制了類器官在篩選靶向藥物的應(yīng)用。其次，類器官構(gòu)建中需要使用基質(zhì)膠，而基質(zhì)膠的復(fù)雜性和組分的可變性使得培養(yǎng)環(huán)境難以完全統(tǒng)一，且基質(zhì)膠的應(yīng)用會(huì)影響藥物的滲透。此外，在類器官培養(yǎng)過程中需要添加生長因子及化學(xué)試劑，這可能會(huì)造成細(xì)胞基因突變或生長發(fā)育異常，從而影響藥物試驗(yàn)結(jié)果。

五、小結(jié)與展望

胰腺癌類器官是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)課題，相關(guān)研究領(lǐng)域正在蓬勃發(fā)展。在藥物敏感性篩選方面，胰腺癌類器官具有高通量、高特異性的特點(diǎn)，可大幅度縮短臨床前試驗(yàn)與臨床試驗(yàn)的周期、降低開發(fā)成本與風(fēng)險(xiǎn)，為精準(zhǔn)藥物治療提速。在發(fā)病機(jī)制和治療方面，胰腺癌類器官具有高保真性，可以深入研究疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。此外將基因編輯技術(shù)引入胰腺癌類器官模型中，可以更加靈活和準(zhǔn)確地在基因?qū)用娌僮饕认侔╊惼鞴?，使精?zhǔn)醫(yī)學(xué)研究成為可能。但該技術(shù)目前尚不成熟，有許多問題需進(jìn)一步探究，如人體中的免疫成分、血管成分和神經(jīng)成分無法在目前的類器官系統(tǒng)中很好地體現(xiàn)；腫瘤類器官的培養(yǎng)環(huán)境仍與腫瘤在人體生長的微環(huán)境有一定差距；培養(yǎng)基基質(zhì)及培養(yǎng)基中的成分需進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化；培養(yǎng)體系有待進(jìn)一步優(yōu)化；利用胰腺癌類器官所進(jìn)行的體外藥敏試驗(yàn)仍需進(jìn)一步與臨床結(jié)合等。相信隨著類器官技術(shù)的發(fā)展，胰腺類器官技術(shù)在疾病模型、藥物開發(fā)及個(gè)體化治療領(lǐng)域?qū)⑷〉瞄L足進(jìn)展。

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