孫方正，檀 軍，陸 祥，陳 偉

(遵義醫(yī)科大學(xué) 組織胚胎學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，每年新發(fā)病約為30.4萬(wàn)[1]。雖然乳腺癌的診斷和治療水平有了明顯的提高，但乳腺癌傳統(tǒng)治療方法存在的不足和現(xiàn)有生物學(xué)治療的靶向性較低、特異性較差，患者預(yù)后差、轉(zhuǎn)移率高仍是該疾病導(dǎo)致女性死亡的主要因素之一[2]。因此，研究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制對(duì)該疾病早期診斷和相關(guān)靶向藥物研發(fā)具有重要意義。

大量臨床資料顯示，在乳腺癌患者的癌組織和血液中miR-21和ERK磷酸化均高表達(dá)[3-5]，說(shuō)明miR-21-5p和ERK磷酸化升高都與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。microRNAs(miRNAs)是一種非編碼小分子RNA，能與靶基因3'-UTR結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA降解或抑制mRNA翻譯調(diào)控靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化[6]。

絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶。其中，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular regulated kinases，ERK)作為MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)末端主激酶，激活前ERK1/2定位于細(xì)胞質(zhì)中，受細(xì)胞外刺激后活化從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)磷酸化其底物，調(diào)控細(xì)胞周期變化，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化、血管生成，抑制細(xì)胞凋亡等[7]。Xie等[8]研究發(fā)現(xiàn)在MCF-7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-21-5p通過(guò)抑制MAPK家族成員之一MAPK10的表達(dá)，促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制癌細(xì)胞凋亡。本課題采用生物信息學(xué)篩選miR-21-5p的靶基因，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-21-5p及其下游靶基因相互關(guān)系，并在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中驗(yàn)證miR-21-5p與靶基因表達(dá)是否影響ERK磷酸化。

1 材料與方法

1.1 材料 miR-21-5p mimic、miR-21-5p mimic-NC、miR-21-5p inhibitor、miR-21-5p inhibitor-NC、pEXP-RB-Mam-EGFP-Spry1質(zhì)粒、pEXP-RB-Mam-EGFP空載體、si-Spry1和 si-Spry1-NC由中國(guó)廣州銳博生物科技有限公司構(gòu)建；miR-21-5p、Spry1引物由中國(guó)上海生工生物工程有限公司合成；HiSeript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒，購(gòu)自中國(guó)南京諾唯贊生物科技有限公司；β-Actin Rabbit Monoclonal Antibody、山羊抗兔IgG(HRP)二抗、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑購(gòu)自日本TAKARA公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher scientific公司；Spry1一抗(批號(hào)：#13013S)、ERK1/2一抗(批號(hào)：#9102S)、Phospho-ERK1/2一抗(批號(hào)：#4370S)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，將MCF-7細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，加入DMEM高糖完全培養(yǎng)基(內(nèi)含10%胎牛血清)，置于37℃恒溫、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

1.2.2 靶基因預(yù)測(cè) 采用Targetscan-Human 7.1(www.-targetscan.org)和miRDB(www.mirdb.org)數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)miR-21-5p的靶基因。

1.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.3.1 熒光素酶質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)Targetscan-human 7.1預(yù)測(cè)到miR-21-5p與靶基因Spry1 3'-UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)5'-AUAAGCUA-3'。利用點(diǎn)突變?cè)噭┖型蛔冊(cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)，突變序列5'-CAGCAUGG-3'。選取結(jié)合位點(diǎn)、突變位點(diǎn)上游150 bp和下游150 bp共計(jì)300 bp的序列克隆至psiCHECK2質(zhì)粒載體螢火蟲(chóng)熒光素酶R-LUCIFERASE(hRLuc)末端多克隆位點(diǎn)，并由上海漢恒生物有限公司完成Spry1 3'-UTR 野生型質(zhì)粒psiCHECK2-Spry1-WT(下文簡(jiǎn)稱(chēng)psi-Spry1-WT)及Spry1 3'-UTR突變質(zhì)粒psiCHECK2-Spry1-MUT(下文簡(jiǎn)稱(chēng)psi-Spry1-MUT)構(gòu)建。

1.2.3.2Spry1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 首先通過(guò)NCBI查詢(xún)到Spry1基因轉(zhuǎn)錄本(NM_001258038)，獲取CDS序列，并將其克隆至pEXP-RB-Mam-EGFP載體，酶切位點(diǎn)為XhoI和PmeI。構(gòu)建成Spry1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pEXP-RB-Mam-EGFP-Spry1(下文簡(jiǎn)稱(chēng)pEXP-Spry1)，空載體pEXP-RB-Mam-EGFP(下文簡(jiǎn)稱(chēng)pEXP-EGFP)。

1.2.4 熒光素酶活性檢測(cè) 將1×104個(gè)293T細(xì)胞接種96孔板中，待細(xì)胞匯合度生長(zhǎng)至40%左右，操作流程參照LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將psi-Spry1-WT和miR-21-5p mimic、psi-Spry1-WT和miR-21-5p mimic-NC、psi-Spry1-MUT和miR-21-5p mimic、psi-Spry1-MUT和 miR-21-5p mimic-NC(miR-21-5p mimic轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L，質(zhì)粒濃度0.2μg/孔)分別共轉(zhuǎn)至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，按照雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(E1910，Promega)，使用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行雙熒光素酶活性的檢測(cè)。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將2×105個(gè)MCF-7細(xì)胞接種六孔板中，待細(xì)胞匯合度生長(zhǎng)至60%左右，設(shè)為8個(gè)轉(zhuǎn)染組分別為：miR-21-5p mimic組、miR-21-5p mimic-NC組、miR-21-5p inhibitor組、miR-21-5p inhibitor-NC組、pEXP-Spry1組、pEXP-EGFP組、si-Spry1組、si-Spry1-NC組。轉(zhuǎn)染前將六孔板內(nèi)10%完全培養(yǎng)基更換為Opti-MEM培養(yǎng)1.5 h，使用250 μL Opti-MEM稀釋LipofectamineTM2000(4 μL/孔)和miR-21-5p mimic(50 nmol/L)、miR-21-5p inhibitor(100 nmol/L)、si-Spry1(50 nmol/L)及相應(yīng)陰性對(duì)照，室溫放置5 min后，混合成500 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物，pEXP-Spry1(4 μg/孔)、pEXP-EGFP(4 μg/孔)與LipofectamineTM2000(8 μL/孔)，轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞。6 h后更換10%完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后分別使用Trizol和RIPA提取細(xì)胞的總RNA和蛋白質(zhì)并進(jìn)行分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 使用Trizol試劑提取各組轉(zhuǎn)染48 h后MCF-7細(xì)胞總RNA，NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，按照試劑說(shuō)明書(shū)使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA；使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒，在7500 Real-Time PCR系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)miR-21-5p和Spry1基因mRNA表達(dá)水平，分別以U6和GAPDH作為參照基因；擴(kuò)增完畢后，根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因CT值，采用2-△△CT(△△CT=△CT處理組-△CT對(duì)照組；△CT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因)方法計(jì)算miR-21-5p和Spry1的相對(duì)表達(dá)量。本研究使用引物如表1。

表1 引物名稱(chēng)及序列

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡(Western blot) 收集各組轉(zhuǎn)染48 h后MCF-7細(xì)胞，加入RIPA裂解緩沖液，冰上裂解30 min，12 000 g 4℃離心10 min，收集上清液，BCA法測(cè)總蛋白濃度；蛋白上樣，通過(guò)10%SDS-PAGE分離20 μg蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入β-Actin、Spry1、ERK、Phospho-ERK1/2一抗4 ℃孵育過(guò)夜(1∶1 000)；TBST洗滌3次，每次10 min，使用山羊抗兔IgG(HRP)二抗(1∶2 000)室溫孵育1.5 h，TBST洗滌3次，每次10 min；加入ECL HRP底物顯色液，凝膠成像系統(tǒng)拍照，ImageJ分析圖像。

2 結(jié)果

2.1Spry1是miR-21-5p下游靶基因 根據(jù)Targetscan-human 7.1，得知Spry1是miR-21-5p的靶基因之一，并預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)位于3'-UTR區(qū)(見(jiàn)表2)；設(shè)計(jì)該區(qū)域突變結(jié)合序列(見(jiàn)表3)；雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比miR-21-5p mimic和psi-Spry1-WT共轉(zhuǎn)組，熒光素酶活性明顯降低(P<0.001)；而miR-21-5p mimic和psi-Spry1-MUT共轉(zhuǎn)組與陰性對(duì)照組相比，熒光素酶活性無(wú)顯著變化(P>0.05，見(jiàn)圖1)。

psi-Spry1-WT和mimic共轉(zhuǎn)組與psi-Spry1-WT和miR-21-5p mimic-NC共轉(zhuǎn)組相比，***：P<0.001。

表2 miR-21-5p與Spry1 3'-UTR區(qū)的結(jié)合序列

表3 miR-21-5p與Spry1 3'-UTR區(qū)的突變序列

2.2 miR-21-5p對(duì)MCF-7細(xì)胞中Spry1的影響 將miR-21-5p mimic、miR-21-5p inhibitor和相應(yīng)陰性對(duì)照(miR-21-5p mimic-NC、inhibitor-NC)分別轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)miR-21-5p表達(dá)水平。與陰性對(duì)照組相比，miR-21-5p mimic組miR-21-5p RNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；但miR-21-5p inhibitor組miR-21-5p RNA表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05)(見(jiàn)圖2A)；RT-qPCR檢測(cè)兩組MCF-7細(xì)胞Spry1 mRNA表達(dá)水平，與陰性對(duì)照組相比，miR-21-5p mimic組和inhibitor組Spry1 mRNA水平均無(wú)顯著變化(P>0.05，見(jiàn)圖2B)；Western blot檢測(cè)結(jié)果，與陰性對(duì)照組相比，miR-21-5p mimic組Spry1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，miR-21-5p inhibitor組Spry1蛋白表達(dá)升高(P<0.05，見(jiàn)圖2C、D)。

A：miR-21-5p mimic、miR-21-5p inhibitor組中miR-21-5p RNA表達(dá)的影響；B：miR-21-5p mimic、miR-21-5p inhibitor對(duì)Spry1 mRNA表達(dá)的影響；C、D：miR-21-5p mimic、miR-21-5p inhibitor對(duì)Spry1蛋白表達(dá)影響；與相應(yīng)陰性對(duì)照組相比,*：P<0.05，**：P<0.01。

2.3 miR-21-5p對(duì)MCF-7細(xì)胞中ERK磷酸化的影響 Western blot檢測(cè)miR-21-5p mimic組、miR-21-5p inhibitor組、相應(yīng)陰性對(duì)照組MCF-7細(xì)胞中ERK磷酸化表達(dá)。與陰性對(duì)照組相比，miR-21-5p mimic組ERK磷酸化水平升高(P<0.05)；miR-21-5p inhibitor組ERK磷酸化水平降低(P<0.05，見(jiàn)圖3A、B)。

A、B：miR-21-5p mimic、miR-21-5p inhibitor對(duì)ERK磷酸化的影響；與相應(yīng)陰性對(duì)照組相比，*：P<0.05。

2.4Spry1對(duì)MCF-7細(xì)胞中ERK磷酸化的影響 將pEXP-Spry1、si-Spry1和相應(yīng)陰性對(duì)照轉(zhuǎn)(pEXP-EGFP、si-Spry1-NC)染到MCF-7細(xì)胞，分別通過(guò)RT-qPCR和Western blot檢測(cè)Spry1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，與陰性對(duì)照組相比，pEXP-Spry1組Spry1 mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.01，P<0.05)；si-Spry1組Spry1 mRNA和蛋白水平降低(P<0.01，P<0.05,見(jiàn)圖4 A、C)；Western blot檢測(cè)ERK磷酸化的表達(dá)變化。與陰性對(duì)照組相比，pEXP-Spry1組ERK的磷酸化水平降低(P<0.05)；si-Spry1組ERK磷酸化水平升高(P<0.05，圖4 B、D)。

A：pEXP-Spry1、si-Spry1對(duì)Spry1 mRNA表達(dá)的影響；B-D：pEXP-Spry1、si-Spry1對(duì)Spry1、ERK磷酸化的影響；與相應(yīng)陰性對(duì)照組相比，*：P<0.05，**：P<0.01。

3 討論

乳腺癌是女性常見(jiàn)、難治、且死亡率高的惡性腫瘤[9]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA異常表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切[10]。miR-21-5p在多種腫瘤中表達(dá)升高，可調(diào)控與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的基因參與腫瘤的惡性進(jìn)展，并在乳腺癌患者組織和血漿中檢測(cè)出miR-21-5p表達(dá)水平高于健康女性[11-13]。miR-21-5p是由miR-21前體5'端臂端加工的致癌小分子RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平調(diào)控靶基因表達(dá)，改變相應(yīng)蛋白質(zhì)以及信號(hào)通路的分子水平，影響細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)[14-15]。Tao等[16]在MCF-7/PTX和MDA-MB-231/PTX紫杉醇耐藥細(xì)胞系中檢測(cè)到miR-21-5p表達(dá)被上調(diào)，會(huì)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖能力和化療耐藥性增強(qiáng)；Chang等[17]通過(guò)癌癥基因組圖譜(TCGA)分析發(fā)現(xiàn)miR-21-5p表達(dá)升高與人乳腺癌存活率有關(guān)。上述研究說(shuō)明miR-21-5p不僅參與乳腺癌發(fā)生的過(guò)程，并且在乳腺癌治療和患者生存率中也發(fā)揮一定作用。

田延龍等[18]采用不同濃度miR-21慢病毒轉(zhuǎn)染乳腺癌 MCF-7細(xì)胞，檢測(cè) miR-21與 PDCD4 蛋白的調(diào)控關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-21 通過(guò)調(diào)控 PDCD4 蛋白的表達(dá)可以影響乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞的遷移和侵襲行為；與近期Pulito等[19]藥理學(xué)相關(guān)劑量二甲雙胍處理BT-474(三陽(yáng)型乳腺癌)、MCF-7(Luminal A型乳腺癌)、SUM159PT和BT-549(三陰型乳腺癌)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，不僅發(fā)現(xiàn)4種乳腺癌細(xì)胞中miR-21-5p表達(dá)均降低，并且證實(shí)二甲雙胍治療后在小鼠乳腺癌荷瘤組織和96位乳腺癌患者血清中miR-21-5p水平也均降低，并分別通過(guò)細(xì)胞平板克隆、劃痕愈合和Trans well侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制miR-21-5p表達(dá)后4種乳腺癌細(xì)胞系克隆和遷移能力降低，均說(shuō)明通過(guò)干擾miR-21的表達(dá)可以控制乳腺癌細(xì)胞的發(fā)生與進(jìn)展。隨著干擾miRNA表達(dá)的技術(shù)已日趨成熟，如能通過(guò)干預(yù)miR-21-5p的表達(dá)作為靶點(diǎn)影響乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡，可能成為有效治療乳腺癌的一種新策略。

臨床資料表明，在乳腺癌組織中ERK磷酸化水平明顯高于癌旁組織，Ⅰ/Ⅱ期患者腫瘤組織ERK磷酸化明顯低于Ⅲ/Ⅳ期，而ERK磷酸化水平低的乳腺癌患者有較好預(yù)后[20]。ERK是信號(hào)從細(xì)胞外轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)的傳遞者，活化后從胞質(zhì)移位到核內(nèi)，通過(guò)調(diào)節(jié)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白等基因表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞多種生理過(guò)程[7,21]。田繼華等[22]在ERK 抑制劑 U0126下調(diào) Cyclin D1與 Survivin 蛋白表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的研究中發(fā)現(xiàn)：在MCF-7、MDA-MB-231 細(xì)胞中通過(guò)阻斷ERK信號(hào)通路，調(diào)控Cyclin D1和 Survivin蛋白的表達(dá)，獲得抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的結(jié)果。晉志遠(yuǎn)等[23]發(fā)現(xiàn)miR-21表達(dá)升高可抑制下游靶基因PTEN的表達(dá)，激活ERK和AKT信號(hào)通路，促進(jìn)膽管癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。上述研究表明，miR-21通過(guò)激活MAPK/ERK信號(hào)通路途徑，參與調(diào)節(jié)乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞凋亡。

研究報(bào)道Sprouty1(Spryl)蛋白作為生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，與正常組織相比79%乳腺癌組織中Spry1表達(dá)也下調(diào)[24]。Ahmed等[25]研究發(fā)現(xiàn)Spry1可通過(guò)抑制腫瘤生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附以及抑制細(xì)胞遷移和侵襲而起到乳腺癌抑制劑的作用，說(shuō)明Spry1是一種重要的乳腺癌抑癌基因。Spry1蛋白表達(dá)增加可以拮抗受體酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase，RTK)信號(hào)通路，發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞增殖、遷移等作用[26]。MAPK/ERK作為RTK下游信號(hào)通路，當(dāng)MAPK激酶被激活后使ERK活化，會(huì)導(dǎo)致ERK磷酸化水平增加并入核，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生物學(xué)效應(yīng)[27]。上訴研究說(shuō)明，Spry1表達(dá)異常參與乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展，如若將Spry1作為治療靶點(diǎn)，針對(duì)Spry1為靶點(diǎn)進(jìn)行靶向藥物的研發(fā)，以增強(qiáng)人乳腺癌細(xì)胞中Spry1對(duì)ERK磷酸化的抑制作用，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。

我們研究表明Spry1是miR-21-5p潛在靶基因，在MCF-7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-21-5p后Spry1蛋白表達(dá)顯著降低，ERK磷酸化水平升高；而抑制miR-21-5p表達(dá)后Spry1蛋白水平升高，ERK磷酸化水平降低；與Shen等[23]在miR-21通過(guò)PDCD4和Spry1的MAPKs負(fù)反饋調(diào)節(jié)對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化影響的研究中miR-21與Spry1的相互關(guān)系結(jié)果一致。過(guò)表達(dá)Spry1可明顯抑制ERK磷酸化，而干擾Spry1表達(dá)后ERK磷酸化水平升高，顯示在MCF-7細(xì)胞中Spry1表達(dá)被抑制可促進(jìn)ERK的磷酸化。

綜上所述，miR-21-5p可在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞Spry1的表達(dá)，促進(jìn)ERK磷酸化，可能是乳腺癌發(fā)生的分子機(jī)制之一，后續(xù)研究中將構(gòu)建乳腺癌小鼠移植瘤模型，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討miR-21-5p對(duì)Spry1、ERK磷酸化的影響。