丁文雙，劉國(guó)榮，李秀博,常麗君，嚴(yán) 青,杜 洪

(廣州市第一人民醫(yī)院暨華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院 病理科，廣東 廣州 510045)

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα(Topoisomerase II-alpha，TOP2A)是DNA代謝過(guò)程的重要核酶，對(duì)應(yīng)編碼基因?yàn)門OP2A，其主要通過(guò)降低DNA超螺旋結(jié)構(gòu)參與基因復(fù)制、細(xì)胞周期調(diào)控等功能。TOP2A蛋白在腫瘤組織中表達(dá)明顯高于正常組織，因此TOP2A成為抗癌藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。TOP2A蛋白抑制劑代表藥物有阿霉素、柔紅霉素等蒽環(huán)類藥[1-2]。蒽環(huán)類藥物是浸潤(rùn)性乳腺癌術(shù)后輔助化療的基礎(chǔ)藥物之一，然而不是所有乳腺癌患者均對(duì)蒽環(huán)類藥物敏感，且該類化療藥物有明顯的心臟毒性和誘發(fā)多種髓系腫瘤和急性白血病的毒副作用[3-5]。如何從乳腺癌患者中篩選出對(duì)蒽環(huán)類藥物敏感的群體成為臨床研究的熱點(diǎn)，多個(gè)臨床中心藥物試驗(yàn)顯示伴HER2和TOP2A共擴(kuò)增的浸潤(rùn)性乳腺癌患者能從含蒽環(huán)類藥物化療方案中明顯獲益[6-8]。換言之，HER2和TOP2A共擴(kuò)增是指導(dǎo)臨床選擇蒽環(huán)類化療藥的敏感指標(biāo)。

目前檢測(cè)TOP2A基因擴(kuò)增主要依靠熒光原位雜交(FISH)，鑒于FISH檢測(cè)成本和技術(shù)普及問(wèn)題，本研究用更普及的免疫組化法(IHC)檢測(cè)TOP2A蛋白表達(dá)，通過(guò)分析TOP2A蛋白表達(dá)與TOP2A基因改變的一致性，探討IHC法檢測(cè)TOP2A表達(dá)在初篩HER2和TOP2A共擴(kuò)增乳腺癌病人中的價(jià)值。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還對(duì)TOP2A蛋白表達(dá)與浸潤(rùn)性乳腺癌相關(guān)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行回顧性研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院病理科2018年1月至2020年8月檢測(cè)的浸潤(rùn)性乳腺癌177例，其中導(dǎo)管內(nèi)癌不納入該研究，回顧性分析每例浸潤(rùn)性乳腺癌相關(guān)臨床病理特征包括年齡、腫瘤分級(jí)、病理組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR表達(dá)、HER2狀態(tài)及Ki-67增殖指數(shù)。本組病例發(fā)病年齡28～92歲(中位年齡54歲)，按2011 St Gallen改良基于免疫組化的分子分型：Luminal A型59例(33%，59/177)，Luminal B型77例(44%，77/177)，HRE2陽(yáng)性型22例(12%，22/177)，三陰型19例(11%，19/177)。HRE2擴(kuò)增38例(21.5%，38/177)，HRE2無(wú)擴(kuò)增139例(78.5%，139/177)。

1.2TOP2A熒光原位雜交及判讀標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛液固定，石蠟包埋切片(厚度=3 μm)經(jīng)脫蠟、水化后滴加80 μL胃蛋白酶(廣州安必平)，37 ℃孵育消化20 min；70%、95%及100%梯度酒精脫水；加探針(TOP2A，廣州安必平)50 μL，加蓋玻片入雜交儀變性5 min，37 ℃雜交過(guò)夜；洗脫蓋片，干燥后滴加10μL DAPI，熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。TOP2A判讀標(biāo)準(zhǔn)：TOP2A/GEP17信號(hào)比>2為擴(kuò)增，TOP2A/GEP17信號(hào)比<0.8為缺失[9]。

1.3 TOP2A免疫組織化學(xué)染色及判讀標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛液固定，石蠟包埋切片(厚度=3 μm)常規(guī)脫蠟水化，免疫組織化學(xué)染色均采用Leica全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)(設(shè)備型號(hào)：BenchMark ULTRA型)，TOP2A抗體(廣州安必平，即用型，克隆號(hào)：MyR1)。由于TOP2A蛋白表達(dá)半定量分析無(wú)統(tǒng)一參考標(biāo)準(zhǔn)，本研究從著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例兩方面共同評(píng)價(jià)TOP2A蛋白表達(dá)：依著色強(qiáng)度弱-強(qiáng)分別標(biāo)記為+-+++，對(duì)應(yīng)分值分別為1、2、3分；隨機(jī)選取10個(gè)浸潤(rùn)性癌高倍鏡視野(400倍)，記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)比例，0%～25%、26%～50%、51%～75%，76%～100%對(duì)應(yīng)分值分別為1、2、3、4；總分值=著色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞比例，其中1～6分為TOP2A蛋白低表達(dá)，7～12分為TOP2A蛋白高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，TOP2A基因與TOP2A蛋白表達(dá)一致性檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)，TOP2A蛋白表達(dá)在浸潤(rùn)性乳腺癌各臨床病理參數(shù)中的表達(dá)差異采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TOP2A熒光原位雜交結(jié)果TOP2A基因改變共28例(14.1%，28/177)，其中TOP2A基因擴(kuò)增22例(10.7%)，TOP2A基因缺失6例(3.4%)。TOP2A基因改變(包括擴(kuò)增或缺失)主要發(fā)生于HRE2擴(kuò)增組(63.2%，24/38)，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表1)。其中HER2和TOP2A共擴(kuò)增19例(50%，19/38，見(jiàn)圖1A、B)。

表1 TOP2A基因改變與HER2基因改變關(guān)系

2.2 TOP2A免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 80例可繼續(xù)研究組織行TOP2A免疫組化檢測(cè)，TOP2A蛋白陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞核，著色為棕黃色。按著色強(qiáng)度分為“+-+++”三級(jí)，其中“+”著色共21例(26.3%，21/80)，“++”著色共38例(47.5%，38/80)，“+++”著色共21例(26.3%，21/80)；TOP2A陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比例5%～100%不等，其中表達(dá)比例0%～25%共31例(38.8%，31/80)，26%～50%共17例(21.3%，17/80)，51%～75%共15例(18.8%，15/80)，76%～100%共17例(21.3%，17/80)；TOP2A蛋白高表達(dá)25例(31.3%，25/80)，TOP2A蛋白低表達(dá)55例(68.7%，55/80)，見(jiàn)圖1C、D。

A：HER2擴(kuò)增，HER2探針紅色，GEP17青色，紅色信號(hào)成簇狀擴(kuò)增(FISH × 1000)；B：TOP2A擴(kuò)增，TOP2A探針綠色，GEP17青色，TOP2A/GEP>2(FISH × 1000)；C：TOP2A蛋白高表達(dá)，棕黃色強(qiáng)信號(hào)定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞比例80%(IHC × 200)；D：TOP2A蛋白低表達(dá)，棕黃色中等信號(hào)定位細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞比例20%(IHC × 200)。

2.3 TOP2A蛋白表達(dá)與TOP2A基因改變一致性結(jié)果 免疫組化顯示共25例TOP2A蛋白高表達(dá)，其中16例FISH結(jié)果為擴(kuò)增。兩種不同實(shí)驗(yàn)方法的一致性Kappa值為0.536(見(jiàn)表2 ,P<0.05)。

表2 TOP2A蛋白表達(dá)與TOP2A基因改變一致性結(jié)果

2.4 TOP2A蛋白表達(dá)與浸潤(rùn)性乳腺癌相關(guān)臨床病理特征關(guān)系 TOP2A蛋白高表達(dá)率在HRE2擴(kuò)增組為56.3%(P<0.01)，在HRE2和TOP2A共擴(kuò)增組為84.2%(P<0.01)，TOP2A蛋白表達(dá)在不同年齡、腫瘤T分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)狀態(tài)、分子分型、ER、PR組間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表3)。

表3 TOP2A蛋白表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性

3 討論

乳腺癌是危及全球女性健康最常見(jiàn)腫瘤之一。2011年St Gallen國(guó)際乳腺癌會(huì)議時(shí)專家組提出了基于免疫組化檢測(cè)ER、PR、HER2及Ki-67表達(dá)的乳腺癌分子改良分型系統(tǒng)，各分子亞型對(duì)應(yīng)不同的臨床治療策略[10]。蒽環(huán)類藥物是TOP2A蛋白的活性抑制劑，TOP2A與HER2毗鄰位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂，兩者的基因改變具有一定協(xié)同性，學(xué)者們推測(cè)伴HER2擴(kuò)增的乳腺癌患者能從蒽環(huán)類化療方案中獲益與HER2和TOP2A基因共擴(kuò)增有關(guān)，該結(jié)論在后續(xù)的多個(gè)臨床藥物試驗(yàn)或臨床數(shù)據(jù)薈萃分析中得到證實(shí)[6,11-12]。病理診斷工作中篩選HER2和TOP2A基因共擴(kuò)增乳腺癌亞群具有重要的臨床意義，依據(jù)此分子改變可優(yōu)化乳腺癌患者的化療方案，對(duì)不必應(yīng)用蒽環(huán)類化療藥物的患者，可避免應(yīng)用蒽環(huán)類藥物而產(chǎn)生嚴(yán)重的細(xì)胞毒性反應(yīng)。

FISH是檢測(cè)HER2和TOP2A基因擴(kuò)增的可靠手段之一。本研究中利用該方法檢測(cè)HER2和TOP2A基因共擴(kuò)增比例為50%，文獻(xiàn)報(bào)道HER2和TOP2A基因共擴(kuò)增比例約30%～50%，本研究數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致。同時(shí)本研究中數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)HER2正常組中3例伴TOP2A擴(kuò)增，文獻(xiàn)報(bào)道HER2正常組通常不伴有TOP2A擴(kuò)增[6-7]，該差異可能因TOP2A擴(kuò)增判讀標(biāo)準(zhǔn)差異或不同廠家探針引起。Varga等報(bào)道不同生產(chǎn)廠商探針檢測(cè)同一批病例TOP2A擴(kuò)增結(jié)果不一致(36% vs 26%)，HER2基因與TOP2A基因位置毗鄰，TOP2A基因探針覆蓋目標(biāo)基因片段過(guò)長(zhǎng)可同時(shí)覆蓋到HER2基因，對(duì)HER2基因擴(kuò)增而TOP2A基因無(wú)擴(kuò)增病例造成假陽(yáng)性判斷[9]。針對(duì)TOP2A擴(kuò)增而HER2正常的病例，建議更換不同廠家探針進(jìn)行驗(yàn)證。

鑒于FISH檢測(cè)成本和技術(shù)普及問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)利用更為普及的免疫組化法檢測(cè)TOP2A蛋白表達(dá)，探討TOP2A蛋白表達(dá)在初篩HER2和TOP2A共擴(kuò)增病人中的價(jià)值。結(jié)果顯示兩種不同檢測(cè)手段檢測(cè)TOP2A表達(dá)有中度相關(guān)性(Kappa值0.536)，由于本研究中TOP2A蛋白高表達(dá)病例較少，兩者一致性評(píng)價(jià)需積累更多病例進(jìn)一步證實(shí)。本研究的結(jié)論與部分文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)有一定差異，如Varga等研究發(fā)現(xiàn)TOP2A蛋白表達(dá)與TOP2A基因擴(kuò)增無(wú)明顯一致性，作者用免疫組化方法檢測(cè)TOP2A蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)9.5%(4/42)樣本陽(yáng)性信號(hào)<10%，而90.5%(38/42)樣本信號(hào)>10%(平均50%～80%)，該差異與判定TOP2A蛋白表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)[9]。

本研究首次從著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞占比兩方面半定量分析TOP2A蛋白表達(dá)，TOP2A蛋白高表達(dá)在HER2和TOP2A共擴(kuò)增組中比例為84.2%，該結(jié)果提示從著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞占比兩方面半定量評(píng)價(jià)TOP2A蛋白表達(dá)可一定程度預(yù)測(cè)TOP2A和HER2共擴(kuò)增狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)另發(fā)現(xiàn)TOP2A基因無(wú)擴(kuò)增組也存在部分TOP2A蛋白高表達(dá)病例(17%)，這表明TOP2A蛋白表達(dá)除了受TOP2A基因調(diào)控外，還會(huì)受其他轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[13]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)TOP2A蛋白表達(dá)在浸潤(rùn)性乳腺癌中的意義進(jìn)行探討，O'Malley等對(duì)一組伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的浸潤(rùn)性乳腺癌患者(n=477)TOP2A蛋白研究發(fā)現(xiàn)，TOP2A高表達(dá)組(陽(yáng)性細(xì)胞比例>13%)可從含蒽環(huán)類化療藥物方案(環(huán)磷酰胺+表柔比星+五氟尿嘧啶，CEF)中明顯獲益，無(wú)病進(jìn)展期和總體生存率均明顯高于CMF化療方案組，這提示TOP2A蛋白高表達(dá)可作為臨床篩選含蒽環(huán)類化療方案的標(biāo)記物。國(guó)內(nèi)劉麗娟等報(bào)道TOP2A蛋白表達(dá)與Ki-67增殖指數(shù)相關(guān)，且TOP2A蛋白高表達(dá)病人預(yù)后較差[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)Ki-67高增殖指數(shù)組TOP2A蛋白高表達(dá)率高于Ki-67低增殖指數(shù)組，但差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TOP2A蛋白表達(dá)與其他相關(guān)臨床病理特征無(wú)明顯相關(guān)性。

綜合所述，TOP2A蛋白可一定程度初篩TOP2A和HER2共擴(kuò)增狀態(tài)。建議診斷工作中常規(guī)開(kāi)展TOP2A蛋白免疫組化檢測(cè)，通過(guò)著色強(qiáng)度、比例兩方面半定量評(píng)價(jià)TOP2A蛋白表達(dá)，對(duì)TOP2A高表達(dá)病例建議行TOP2A基因檢測(cè)，以更好指導(dǎo)后續(xù)臨床用藥。