楊 靜，馬景濤，艾力·伊敏，閆 駿

肝細(xì)胞癌為我國(guó)消化系統(tǒng)惡性腫瘤中的常見(jiàn)類(lèi)型，屬于原發(fā)性肝病范圍，在原發(fā)性肝癌中占比90%左右[1]，其死亡率相對(duì)較高，在現(xiàn)階段全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡原因中占據(jù)第三位[2]。近年來(lái)，關(guān)于肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制的研究得到本領(lǐng)域?qū)＜业膹V泛關(guān)注，很多研究都在探索其分子發(fā)病機(jī)制[3]。肝細(xì)胞癌中組蛋白甲基化酶SET結(jié)構(gòu)域分支型1（SETDB1）屬于組蛋白賴氨酸N端甲基轉(zhuǎn)移酶，其編碼基因的位置為人類(lèi)染色體1q21上。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌[4]、卵巢癌[5]患者中，SETDB1的表達(dá)水平較高時(shí)，可能會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移、增殖及侵襲過(guò)程發(fā)揮促進(jìn)作用，因此，SETDB1可作為預(yù)測(cè)癌癥患者預(yù)后的重要指標(biāo)。目前，在肝細(xì)胞癌中研究SETDB1的表達(dá)情況較少見(jiàn)，本研究選取確診的肝細(xì)胞癌患者，選取其癌組織和癌旁組織，展開(kāi)對(duì)比分析，了解肝細(xì)胞癌中SETDB1的表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月—2020年6月天津市第一中心醫(yī)院收治的90例肝細(xì)胞癌患者，其中男78例，女12例，年齡41～82歲，平均（61.32±4.52）歲；瘤體數(shù)量：?jiǎn)蝹€(gè)瘤體80例，2個(gè)及以上瘤體10例。腫瘤直徑為1～17 cm，若瘤體數(shù)量為2個(gè)及以上，計(jì)算其直徑總和作為直徑數(shù)值，其中直徑為6 cm及以上者18例，小于6 cm者72例。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 1）均經(jīng)手術(shù)切除獲得標(biāo)本，經(jīng)檢查確診為肝細(xì)胞癌；2）標(biāo)本在離體后30 min內(nèi)取材，在中性甲醛溶液內(nèi)保存并固定；3）未合并其他惡性腫瘤，無(wú)嚴(yán)重的肝腎功能障礙；4）患者同意自身標(biāo)本用于臨床實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 1）無(wú)法接受手術(shù)治療，而是通過(guò)化療或放療治療的患者；2）不愿自身資料被用于臨床研究；3）其他部位惡性腫瘤轉(zhuǎn)移所致的肝癌患者。

1.3 方法 1）取樣：對(duì)患者HE切片進(jìn)行調(diào)閱，從每位患者中選取癌細(xì)胞含量為70%以上的蠟塊，同時(shí)選取配對(duì)的癌旁正常肝組織蠟塊1個(gè)，注意將壞死區(qū)域、出血區(qū)域避開(kāi)。2）所用試劑和儀器：所用檢查試劑盒為FFPE RNA提取試劑盒、qRT-PCR儀，其中SETDB1引物由Primer5.0軟件制作，上游引物：5‘-CTATATGACTTCCGGCCGGATGA-3’，下游引物：5‘-GCATTGTCCGAAGGCAGAGA-3’。3）免疫組化染色：將標(biāo)本組織切片（石蠟包埋）常規(guī)脫蠟，實(shí)施水化預(yù)處理，以抗體稀釋液按照1:100的比例對(duì)兔抗人SETDB1多克隆抗體進(jìn)行稀釋?zhuān)诮M織切片上滴加抗體，注意需將組織標(biāo)本完全浸沒(méi)。放在4 ℃恒溫箱中，孵育過(guò)夜，將未結(jié)合一抗洗凈，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記后的山羊抗兔二抗和相應(yīng)一抗結(jié)合，以DAB法促使陽(yáng)性蛋白顯示。對(duì)各組織切片，于400倍視野下，隨機(jī)抽查10個(gè)視野，若癌細(xì)胞胞核有10%以上為棕褐色或棕黃色，則可判定為陽(yáng)性。4）qRT-PCR檢測(cè)：將肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織各個(gè)樣本切成厚度為5 μm，每份標(biāo)本共4張切片，放在EP管內(nèi)，根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取其中的總RNA，對(duì)其純度、濃度進(jìn)行檢測(cè)，若總RNA純度（A260/A280）數(shù)值為1.8～2.1，則判定為合格。所有樣本均采集RNA樣品1 μg，實(shí)施qRT-PCR反應(yīng)，其體系20 μL，反應(yīng)條件為55 ℃下行逆轉(zhuǎn)錄，共10 min；之后在95 ℃下行1 min預(yù)變性，在95 ℃下實(shí)施10 s循環(huán)，在60 ℃下行1 min循環(huán)，共循環(huán)40次。各個(gè)樣本重復(fù)試驗(yàn)3孔。采用2-△△Ct法計(jì)算SETDB1相對(duì)表達(dá)量。

1.4 觀察指標(biāo) 1）評(píng)估肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織中SETDB1的表達(dá)情況。2）對(duì)不同年齡、性別、腫瘤直徑、癌細(xì)胞不同分化程度、有無(wú)肝硬化患者、不同分型、分期肝細(xì)胞癌患者的SETDB1表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 SETDB1的表達(dá)情況 免疫組化染色中，SETDB1位置為細(xì)胞核內(nèi)，其陽(yáng)性表達(dá)情況見(jiàn)表1。經(jīng)對(duì)比，癌組織中SETDB1陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。經(jīng)qRT-PCR檢查，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌組織中的SETDB1相對(duì)表達(dá)量為（1.674±0.287），癌旁組織中為（1.215±0.147），經(jīng)對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.504，P＜0.001）。

表1 癌組織和癌旁組織中SETDB1的表達(dá)情況

2.2 不同年齡、性別、腫瘤直徑患者SETDB1的檢測(cè)情況 不同年齡、不同性別患者的肝細(xì)胞癌樣本中，癌組織SETDB1水平組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腫瘤直徑為6 cm及以上者的癌組織SETDB1水平明顯高于腫瘤直徑不足6 cm者（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同年齡、性別、腫瘤直徑肝細(xì)胞癌患者SETDB1的測(cè)定結(jié)果

2.3 不同分化程度、有無(wú)肝硬化肝細(xì)胞癌患者SETDB1的水平 不同癌細(xì)胞分化程度、肝硬化患者，癌組織SETDB1水平組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 不同分化程度、有無(wú)肝硬化肝細(xì)胞癌患者SETDB1的測(cè)定結(jié)果

2.4 不同分型、分期肝細(xì)胞癌患者SETDB1的測(cè)定結(jié)果 MVI分型中，M1+M2分型的癌細(xì)胞SETDB1水平明顯高于M0分型（P＜0.05）；pTNM分期中，Ⅲ+Ⅳ期患者癌細(xì)胞SETDB1水平明顯高于I +II期（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 不同分型、分期肝細(xì)胞癌患者SETDB1的測(cè)定結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，隨著生活環(huán)境不斷變化、生活方式逐漸改變，全球范圍內(nèi)的癌癥患者數(shù)量逐漸增多。肝細(xì)胞癌屬于常見(jiàn)疾病類(lèi)型，若不能及時(shí)治療，患者死亡風(fēng)險(xiǎn)較高，肝細(xì)胞癌的治療引起了人們的關(guān)注，然而部分患者經(jīng)治療后，效果仍不佳，故而臨床醫(yī)師近年來(lái)日益重視探索肝細(xì)胞癌的分子發(fā)病機(jī)制，希望為此類(lèi)患者的治療提供新的靶點(diǎn)[6]。

肝癌表觀遺傳變異，對(duì)于腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，乃至其轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，均可發(fā)揮巨大作用。SETDB1屬于組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶，能夠和異染色質(zhì)蛋白1、抑制子KAPI于異染色質(zhì)內(nèi)結(jié)合，對(duì)H3K9me3的形成發(fā)揮促進(jìn)作用[7-8]。目前，有很多研究在多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)SETDB1異常表達(dá)問(wèn)題，但是領(lǐng)域內(nèi)專(zhuān)家對(duì)這一物質(zhì)的生物學(xué)功能還未獲得明確結(jié)論[9]。對(duì)于非小細(xì)胞肺癌患者，SETDB1可將WNT-β-catenin信號(hào)通路正向激活，對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖過(guò)程發(fā)揮促進(jìn)作用，而在腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，也能夠發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的生物學(xué)行為。有研究提出，SETDB1在肝癌中水平較高，且其升高與肝癌進(jìn)展、侵襲和預(yù)后情況密切相關(guān)[10]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默SETDB1可對(duì)肝細(xì)胞癌的遷移、侵襲及增殖能力造成抑制作用[11]。本研究經(jīng)免疫組化染色可知，肝細(xì)胞癌組織中SETDB1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，然后用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌組織中SETDB1相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織，可見(jiàn)SETDB1在肝細(xì)胞癌組織內(nèi)的表達(dá)水平較高，而這一指標(biāo)的檢測(cè)，能夠?qū)Ω渭?xì)胞癌的診斷提供一定依據(jù)。

本研究將肝細(xì)胞癌患者根據(jù)不同方法進(jìn)行分組，進(jìn)一步探索不同分期、腫瘤直徑等患者的SETDB1表達(dá)情況。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在不同性別、不同年齡的肝細(xì)胞癌患者中，雖然SETDB1表達(dá)水平有一定差異，但是差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見(jiàn)性別及年齡不是影響SETDB1表達(dá)的因素。在腫瘤直徑為6 cm及以上患者中，筆者發(fā)現(xiàn)其癌細(xì)胞SETDB1水平明顯高于腫瘤直徑不足6 cm患者，從這一結(jié)果可以看出，SETDB1表達(dá)水平較高的肝細(xì)胞癌組織，SETDB1的表達(dá)可能會(huì)越發(fā)活躍，因此這一指標(biāo)的水平較高；隨著腫瘤體積增大，不僅預(yù)示著患者治療難度增加，同時(shí)也提示患者預(yù)后可能更差，疾病進(jìn)展更加嚴(yán)重，由此可見(jiàn)，SETDB1表達(dá)情況在腫瘤進(jìn)展評(píng)估中也能發(fā)揮重要作用[12-13]。

在不同癌細(xì)胞分化程度、是否伴隨肝硬化的患者中，癌細(xì)胞SETDB1水平組間差異不顯著，由此可見(jiàn)，肝硬化的有無(wú)并不會(huì)影響SETDB1的表達(dá)，而癌細(xì)胞分化程度與SETDB1表達(dá)水平之間也不存在必然的聯(lián)系。研究還對(duì)MVI分型情況展開(kāi)對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M1+M2分期的癌細(xì)胞SETDB1水平明顯高于M0分期，而在不同pTNM分期的患者中，Ⅲ+Ⅳ期患者癌細(xì)胞SETDB1水平明顯高于I +II期，之所以出現(xiàn)這一結(jié)果，是因?yàn)榘殡SMVI患者的腫瘤體積通常更大，而患者的生存期一般較短。而TNM分期直接反映腫瘤進(jìn)展程度，Ⅲ+Ⅳ期的腫瘤進(jìn)展更快，患者預(yù)后一般相對(duì)較差。從這一結(jié)論可以看出，SETDB1表達(dá)情況與微血管侵犯、腫瘤分期密切相關(guān)，推斷SETDB1水平升高與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后差之間有一定關(guān)聯(lián)，因此可將SETDB1水平用作對(duì)肝細(xì)胞癌患者腫瘤進(jìn)展、預(yù)后評(píng)估的一個(gè)重要指標(biāo)[14-15]。陳靜等[16]在研究中，發(fā)現(xiàn)對(duì)SETDB1進(jìn)行抑制，可抑制裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)，且可導(dǎo)致細(xì)胞中H3K9me3水平下降，p53水平升高。我們體會(huì)到，對(duì)于SETDB1表達(dá)情況與肝細(xì)胞癌患者其他病理特征、預(yù)后之間的關(guān)系，還需繼續(xù)擴(kuò)大研究樣本量，并考慮其蛋白表達(dá)情況，做更深入的分析。

對(duì)于肝細(xì)胞癌患者，下調(diào)SETDB1表達(dá)水平，能夠?qū)Ω伟┥L(zhǎng)發(fā)揮抑制作用，這可作為后續(xù)治療肝細(xì)胞癌的重要靶點(diǎn)，領(lǐng)域內(nèi)專(zhuān)家可通過(guò)大量試驗(yàn)，探索抑制SETDB1表達(dá)水平的藥物及治療方案，來(lái)改善肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后情況。

綜上所述，肝細(xì)胞癌中組蛋白甲基化酶SETDB1的表達(dá)明顯升高，且腫瘤直徑較大、M1+M2型、pTNM分期較高的患者中，肝細(xì)胞癌內(nèi)SETDB1的表達(dá)水平明顯升高，這有望為肝細(xì)胞癌治療方案的研制提供新的治療靶點(diǎn)。