朱曉云 巴元明

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，湖北武漢 430065；2.湖北省中醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北武漢 430061

慢性前列腺炎是影響各年齡段男性的常見疾病，然而，它更頻繁地發(fā)生在年輕的男性中[1]。臨床常見癥狀有會陰、下腹部區(qū)域疼痛不適，排尿異常，性功能異常等，病情易反復(fù)且長期存在，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。該病被美國國立衛(wèi)生研究院列為影響患者生活質(zhì)量最嚴(yán)重的慢性疾病之一[3]。慢性前列腺炎的西醫(yī)治療以對癥治療為主，僅能在一定程度上改善大多數(shù)臨床癥狀。慢性前列腺炎在癥狀上與古醫(yī)籍中的“精濁”“白淫”相似[4]。近年來，我國使用中藥治療慢性前列腺炎逐漸興起。相關(guān)文獻(xiàn)表明，中藥治療慢性前列腺炎的有效率高達(dá)90%以上，最高能夠達(dá)到98%[5]?！堵郧傲邢傺字形麽t(yī)結(jié)合診療指南》[6]明確將柴胡疏肝散定為治療慢性前列腺炎肝氣郁結(jié)證的推薦處方。目前，可查閱的從肝論治并使用柴胡疏肝散治療慢性前列腺炎的臨床經(jīng)驗(yàn)相關(guān)文獻(xiàn)中，均顯示療效顯著。男子以氣為用，以精為根，肝主疏泄，若精神抑郁，情志內(nèi)傷，疏泄失常，肝郁氣滯痰凝，則易患此病。因此肝郁是發(fā)病的根本原因，治宜疏肝理氣。柴胡疏肝散出自《景岳全書》，臨床主要用于肝郁氣滯證[7]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析柴胡疏肝散藥物成分與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，預(yù)測其治療慢性前列腺炎的可能機(jī)制，為后續(xù)藥物研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 有效成分和靶點(diǎn)的獲得

柴胡疏肝散的中藥組成包括陳皮、柴胡、川芎、香附、枳殼、白芍、甘草7 味中藥。本研究使用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索，設(shè)置以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為閾值條件，獲取各單味藥的成分組成信息。利用PubChem 數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/）、sea 數(shù)據(jù)庫（http：//sea.bkslab.org/）預(yù)測蛋白靶點(diǎn)，然后對預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行去重整合。應(yīng)用GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）以“chronic prostatitis”為檢索詞獲取慢性前列腺炎靶點(diǎn)基因名稱。通過比對中藥和疾病靶點(diǎn)，得到共有靶點(diǎn)基因信息。

1.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“1.1”中獲得的中藥、疾病共有基因輸入STRING（https：//string-db.org/），選擇“Homo sapiens”，進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.3 基因本體（GO）富集與京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）通路富集

篩選關(guān)鍵靶基因（>2 倍degree），將篩選出的靶基因?qū)隓AVID 6.8 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo Sapiens”，以P <0.05 為閾值條件，對關(guān)鍵靶基因進(jìn)行GO 分析和KEGG 通路富集分析。

1.4 “治療靶基因-中藥-化合物”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

選取前15 條KEGG 信號通路上的基因作為治療靶基因，將篩選的治療靶基因?qū)?yīng)的化合物和中藥導(dǎo)入到Cytoscape 軟件中，構(gòu)建治療靶基因-中藥-化合物網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 柴胡疏肝散有效成分及靶點(diǎn)基因篩選

篩選出柴胡疏肝散7 味中藥共129 個(gè)有效成分，根據(jù)有效成分篩選出1121 個(gè)靶點(diǎn)基因名稱。

2.2 慢性前列腺炎疾病靶點(diǎn)基因篩選

查詢得到的慢性前列腺炎靶點(diǎn)基因，取Rele vance score 2 次中位數(shù)后的靶點(diǎn)基因共計(jì)2050 個(gè)。

2.3 柴胡疏肝散活性成分治療慢性前列腺炎預(yù)測靶點(diǎn)的篩選

將“2.1”和“2.2”所得靶點(diǎn)基因結(jié)果進(jìn)行比對，取交集，利用韋恩圖展示疾病靶點(diǎn)與藥物成分靶點(diǎn)之間的交集情況（圖1），柴胡疏肝散靶點(diǎn)與慢性前列腺炎靶點(diǎn)的重疊部分共有476 個(gè)。

圖1 柴胡疏肝散潛在靶點(diǎn)與慢性前列腺炎疾病靶點(diǎn)Venn 圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

分析得到柴胡疏肝散作用于慢性前列腺炎的PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖2。共得到476 個(gè)節(jié)點(diǎn)、12 212 條邊。

圖2 柴胡疏肝散治療慢性前列腺炎靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 功能分析

將得到的48 個(gè)關(guān)鍵靶基因進(jìn)行GO 富集。結(jié)果包括生物過程（BP）469 條、分子功能（MF）64 條、細(xì)胞組分（CC）46 條，圖3中各列出了前20 條。由圖3可見，CC 富集主要細(xì)胞中的腦細(xì)胞控、膜封閉腔、細(xì)胞溶質(zhì)等；MF 富集結(jié)果主要為核苷酸結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白激酶活性等；BP 是數(shù)量最多的富集區(qū)域，包括對程序性的細(xì)胞凋亡調(diào)控、細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)等。

2.6 KEGG 富集中的信號通路

構(gòu)建中藥-化合物-治療靶基因網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。通過KEGG 通路富集分析靶點(diǎn)信號通路，以P ＜0.01 為閾值，依據(jù)count 值排序，選取前15 條信號通路中多條與炎癥相關(guān)的信號通路，其中包括Chemokine signaling pathway、MAPK signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、Neurotrophin signaling pathway 等，見圖5。依據(jù)結(jié)果繪制氣泡圖，見圖6。

圖4 柴胡疏肝散治療慢性前列腺炎的藥物-化合物-治療靶基因互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 柴胡疏肝散-慢性前列腺炎共有基因按degree 值排序的前20 個(gè)靶基因-前15 條KEGG 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

3 討論

慢性前列腺炎相對較常見，終生患病率為1.8%～8.2%[8]。研究發(fā)現(xiàn)，疏肝解郁膠囊能有效緩解ⅢB 型前列腺炎患者的焦慮、抑郁等心理問題，并改善臨床癥狀[9]。柴胡疏肝散為治療肝氣郁結(jié)之代表方，本方疏肝藥與養(yǎng)血柔肝藥相配，既養(yǎng)肝之體，又利肝之用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從藥物和疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，初步預(yù)測出藥物作用機(jī)制的學(xué)科[10]。分析得知，柴胡疏肝散的活性成分主要通過如蛋白激酶相關(guān)受體（AKT1、MAPK3）、炎癥相關(guān)受體（IL-6、IL-2、IL-1B、ALB）、生長因子相關(guān)受體（SRC、EGFR、KDR）等核心靶點(diǎn)對于治療慢性前列腺炎發(fā)揮作用。其中大部分屬于炎癥相關(guān)因子，炎癥因子與慢性前列腺炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。IL-6 是主要的抗炎性細(xì)胞因子，能夠抑制促炎因子的產(chǎn)生，并增強(qiáng)中性粒細(xì)胞活性和吞噬功能[13]，其水平變化與機(jī)體炎癥反應(yīng)程度呈明顯負(fù)相關(guān)。Drannik 等[14]研究報(bào)道慢性前列腺炎患者的免疫應(yīng)答中，IL-6 誘導(dǎo)T、B 細(xì)胞分化和增殖。AKT1調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞，包括促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生、吞噬、自噬并維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)[15]。IL-2 可刺激自然殺傷細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞大量增殖，促進(jìn)B 細(xì)胞分化和相關(guān)抗體合成，進(jìn)一步加強(qiáng)自身免疫炎癥應(yīng)答水平。SRC 蛋白在細(xì)胞的生長、增殖、分化、運(yùn)動(dòng)和凋亡等生理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[16]。EGFR 信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移，KDR 有抗細(xì)胞凋亡、維持內(nèi)皮細(xì)胞存活的效應(yīng)[17]。

關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散干預(yù)慢性前列腺炎的信號通路主要包括Chemokine signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、Natural killer cell mediated cytotoxicity、MAPKsignalingpathway、Neurotrophin signaling pathway 等，對比柴胡疏肝散對肝郁證模型大鼠的干預(yù)作用及分子靶標(biāo)結(jié)果可知，其大部分基因的主要作用在于傳遞信號給免疫效應(yīng)細(xì)胞，例如T 淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，部分基因的上調(diào)表達(dá)會誘導(dǎo)炎癥性肌炎[18]，T 細(xì)胞受體參與炎癥和適應(yīng)性免疫[19]。Chemokine signaling pathway 及其受體在先天免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)中都是至關(guān)重要的，它們能確保免疫細(xì)胞的遷移、激活和分化[20]。MAPK 信號通路是細(xì)胞信息傳遞的交匯點(diǎn)和共同通路，因此MAPK 抑制劑能夠有效減少促炎性細(xì)胞因子的合成及其信號傳導(dǎo)，因而被廣泛應(yīng)用。臨床試驗(yàn)表明，此類抑制劑對慢性炎性疾病患者大有益處[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散可以通過神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路作用于慢性前列腺炎。研究表明[22]，84%的慢性前列腺炎患者有不同程度的神經(jīng)精神癥狀。最近的一項(xiàng)研究還表明，慢性疼痛可部分由神經(jīng)炎癥控制的中樞敏化來維持[23]。同樣，在前列腺炎的小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)炎癥[24]。

目前臨床上主要認(rèn)為，慢性前列腺炎的發(fā)病機(jī)制與病原體感染、炎癥、免疫反應(yīng)異常、氧化應(yīng)激及精神心理因素有關(guān)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散可能具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，可通過有效抑制淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放類似生長因子，減輕前列腺炎和纖維化程度，恢復(fù)異常生化指標(biāo)，減輕炎癥，改善抗氧化防御，激活趨化因子信號通路。同時(shí)已有研究證實(shí)，可通過抑制炎性細(xì)胞因子及其信號通路等，達(dá)到治療抑郁癥的目的[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散治療重度抑郁癥的主要信號通路中，細(xì)胞周期與抑郁的發(fā)生密切相關(guān)，可通過抵抗神經(jīng)元凋亡和壞死、改變細(xì)胞周期進(jìn)程從而治療重度抑郁癥[27]。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝散可能作用于IL-6、IL-2、AKT1 等多個(gè)靶點(diǎn)，通過趨化因子、T 細(xì)胞受體，神經(jīng)營養(yǎng)素等信號通路來調(diào)控炎癥、細(xì)胞凋亡、免疫水平及精神狀態(tài)。本研究為深入探討柴胡疏肝散治療慢性前列腺炎的作用機(jī)制提供了新思路。