朱曉云 巴元明

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，湖北武漢 430065；2.湖北省中醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北武漢 430061

慢性前列腺炎是影響各年齡段男性的常見疾病，然而，它更頻繁地發(fā)生在年輕的男性中[1]。臨床常見癥狀有會陰、下腹部區(qū)域疼痛不適，排尿異常，性功能異常等，病情易反復(fù)且長期存在，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。該病被美國國立衛(wèi)生研究院列為影響患者生活質(zhì)量最嚴重的慢性疾病之一[3]。慢性前列腺炎的西醫(yī)治療以對癥治療為主，僅能在一定程度上改善大多數(shù)臨床癥狀。慢性前列腺炎在癥狀上與古醫(yī)籍中的“精濁”“白淫”相似[4]。近年來，我國使用中藥治療慢性前列腺炎逐漸興起。相關(guān)文獻表明，中藥治療慢性前列腺炎的有效率高達90%以上，最高能夠達到98%[5]?！堵郧傲邢傺字形麽t(yī)結(jié)合診療指南》[6]明確將柴胡疏肝散定為治療慢性前列腺炎肝氣郁結(jié)證的推薦處方。目前，可查閱的從肝論治并使用柴胡疏肝散治療慢性前列腺炎的臨床經(jīng)驗相關(guān)文獻中，均顯示療效顯著。男子以氣為用，以精為根，肝主疏泄，若精神抑郁，情志內(nèi)傷，疏泄失常，肝郁氣滯痰凝，則易患此病。因此肝郁是發(fā)病的根本原因，治宜疏肝理氣。柴胡疏肝散出自《景岳全書》，臨床主要用于肝郁氣滯證[7]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析柴胡疏肝散藥物成分與靶點的相互作用關(guān)系，預(yù)測其治療慢性前列腺炎的可能機制，為后續(xù)藥物研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 有效成分和靶點的獲得

柴胡疏肝散的中藥組成包括陳皮、柴胡、川芎、香附、枳殼、白芍、甘草7 味中藥。本研究使用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索，設(shè)置以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為閾值條件，獲取各單味藥的成分組成信息。利用PubChem 數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/）、sea 數(shù)據(jù)庫（http：//sea.bkslab.org/）預(yù)測蛋白靶點，然后對預(yù)測靶點進行去重整合。應(yīng)用GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）以“chronic prostatitis”為檢索詞獲取慢性前列腺炎靶點基因名稱。通過比對中藥和疾病靶點，得到共有靶點基因信息。

1.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“1.1”中獲得的中藥、疾病共有基因輸入STRING（https：//string-db.org/），選擇“Homo sapiens”，進行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.3 基因本體（GO）富集與京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）通路富集

篩選關(guān)鍵靶基因（>2 倍degree），將篩選出的靶基因?qū)隓AVID 6.8 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo Sapiens”，以P <0.05 為閾值條件，對關(guān)鍵靶基因進行GO 分析和KEGG 通路富集分析。

1.4 “治療靶基因-中藥-化合物”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

選取前15 條KEGG 信號通路上的基因作為治療靶基因，將篩選的治療靶基因?qū)?yīng)的化合物和中藥導(dǎo)入到Cytoscape 軟件中，構(gòu)建治療靶基因-中藥-化合物網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 柴胡疏肝散有效成分及靶點基因篩選

篩選出柴胡疏肝散7 味中藥共129 個有效成分，根據(jù)有效成分篩選出1121 個靶點基因名稱。

2.2 慢性前列腺炎疾病靶點基因篩選

查詢得到的慢性前列腺炎靶點基因，取Rele vance score 2 次中位數(shù)后的靶點基因共計2050 個。

2.3 柴胡疏肝散活性成分治療慢性前列腺炎預(yù)測靶點的篩選

將“2.1”和“2.2”所得靶點基因結(jié)果進行比對，取交集，利用韋恩圖展示疾病靶點與藥物成分靶點之間的交集情況（圖1），柴胡疏肝散靶點與慢性前列腺炎靶點的重疊部分共有476 個。

圖1 柴胡疏肝散潛在靶點與慢性前列腺炎疾病靶點Venn 圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選

分析得到柴胡疏肝散作用于慢性前列腺炎的PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖2。共得到476 個節(jié)點、12 212 條邊。

圖2 柴胡疏肝散治療慢性前列腺炎靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 功能分析

將得到的48 個關(guān)鍵靶基因進行GO 富集。結(jié)果包括生物過程（BP）469 條、分子功能（MF）64 條、細胞組分（CC）46 條，圖3中各列出了前20 條。由圖3可見，CC 富集主要細胞中的腦細胞控、膜封閉腔、細胞溶質(zhì)等；MF 富集結(jié)果主要為核苷酸結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白激酶活性等；BP 是數(shù)量最多的富集區(qū)域，包括對程序性的細胞凋亡調(diào)控、細胞死亡調(diào)節(jié)、細胞凋亡調(diào)節(jié)、細胞增殖調(diào)節(jié)等。

2.6 KEGG 富集中的信號通路

構(gòu)建中藥-化合物-治療靶基因網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。通過KEGG 通路富集分析靶點信號通路，以P ＜0.01 為閾值，依據(jù)count 值排序，選取前15 條信號通路中多條與炎癥相關(guān)的信號通路，其中包括Chemokine signaling pathway、MAPK signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、Neurotrophin signaling pathway 等，見圖5。依據(jù)結(jié)果繪制氣泡圖，見圖6。

圖4 柴胡疏肝散治療慢性前列腺炎的藥物-化合物-治療靶基因互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 柴胡疏肝散-慢性前列腺炎共有基因按degree 值排序的前20 個靶基因-前15 條KEGG 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

3 討論

慢性前列腺炎相對較常見，終生患病率為1.8%～8.2%[8]。研究發(fā)現(xiàn)，疏肝解郁膠囊能有效緩解ⅢB 型前列腺炎患者的焦慮、抑郁等心理問題，并改善臨床癥狀[9]。柴胡疏肝散為治療肝氣郁結(jié)之代表方，本方疏肝藥與養(yǎng)血柔肝藥相配，既養(yǎng)肝之體，又利肝之用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從藥物和疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，初步預(yù)測出藥物作用機制的學(xué)科[10]。分析得知，柴胡疏肝散的活性成分主要通過如蛋白激酶相關(guān)受體（AKT1、MAPK3）、炎癥相關(guān)受體（IL-6、IL-2、IL-1B、ALB）、生長因子相關(guān)受體（SRC、EGFR、KDR）等核心靶點對于治療慢性前列腺炎發(fā)揮作用。其中大部分屬于炎癥相關(guān)因子，炎癥因子與慢性前列腺炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。IL-6 是主要的抗炎性細胞因子，能夠抑制促炎因子的產(chǎn)生，并增強中性粒細胞活性和吞噬功能[13]，其水平變化與機體炎癥反應(yīng)程度呈明顯負相關(guān)。Drannik 等[14]研究報道慢性前列腺炎患者的免疫應(yīng)答中，IL-6 誘導(dǎo)T、B 細胞分化和增殖。AKT1調(diào)節(jié)巨噬細胞，包括促進抗炎性細胞因子的產(chǎn)生、吞噬、自噬并維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)[15]。IL-2 可刺激自然殺傷細胞和T 淋巴細胞大量增殖，促進B 細胞分化和相關(guān)抗體合成，進一步加強自身免疫炎癥應(yīng)答水平。SRC 蛋白在細胞的生長、增殖、分化、運動和凋亡等生理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[16]。EGFR 信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞分化、細胞周期和細胞遷移，KDR 有抗細胞凋亡、維持內(nèi)皮細胞存活的效應(yīng)[17]。

關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散干預(yù)慢性前列腺炎的信號通路主要包括Chemokine signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、Natural killer cell mediated cytotoxicity、MAPKsignalingpathway、Neurotrophin signaling pathway 等，對比柴胡疏肝散對肝郁證模型大鼠的干預(yù)作用及分子靶標結(jié)果可知，其大部分基因的主要作用在于傳遞信號給免疫效應(yīng)細胞，例如T 淋巴細胞和自然殺傷細胞，部分基因的上調(diào)表達會誘導(dǎo)炎癥性肌炎[18]，T 細胞受體參與炎癥和適應(yīng)性免疫[19]。Chemokine signaling pathway 及其受體在先天免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)中都是至關(guān)重要的，它們能確保免疫細胞的遷移、激活和分化[20]。MAPK 信號通路是細胞信息傳遞的交匯點和共同通路，因此MAPK 抑制劑能夠有效減少促炎性細胞因子的合成及其信號傳導(dǎo)，因而被廣泛應(yīng)用。臨床試驗表明，此類抑制劑對慢性炎性疾病患者大有益處[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散可以通過神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路作用于慢性前列腺炎。研究表明[22]，84%的慢性前列腺炎患者有不同程度的神經(jīng)精神癥狀。最近的一項研究還表明，慢性疼痛可部分由神經(jīng)炎癥控制的中樞敏化來維持[23]。同樣，在前列腺炎的小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)炎癥[24]。

目前臨床上主要認為，慢性前列腺炎的發(fā)病機制與病原體感染、炎癥、免疫反應(yīng)異常、氧化應(yīng)激及精神心理因素有關(guān)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散可能具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，可通過有效抑制淋巴細胞和單核細胞釋放類似生長因子，減輕前列腺炎和纖維化程度，恢復(fù)異常生化指標，減輕炎癥，改善抗氧化防御，激活趨化因子信號通路。同時已有研究證實，可通過抑制炎性細胞因子及其信號通路等，達到治療抑郁癥的目的[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散治療重度抑郁癥的主要信號通路中，細胞周期與抑郁的發(fā)生密切相關(guān)，可通過抵抗神經(jīng)元凋亡和壞死、改變細胞周期進程從而治療重度抑郁癥[27]。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝散可能作用于IL-6、IL-2、AKT1 等多個靶點，通過趨化因子、T 細胞受體，神經(jīng)營養(yǎng)素等信號通路來調(diào)控炎癥、細胞凋亡、免疫水平及精神狀態(tài)。本研究為深入探討柴胡疏肝散治療慢性前列腺炎的作用機制提供了新思路。