趙文法 王春雷 馮家龍

山東省聊城市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東聊城 252000

甲狀腺是人體內(nèi)最大的內(nèi)分泌腺，分泌的甲狀腺激素是維持人體正常代謝和生長發(fā)育所必需的激素。甲狀腺功能低下或亢進(jìn)可致體內(nèi)甲狀腺激素水平過低或過高，都會(huì)引起各種癥狀。甲狀腺片為甲狀腺激素藥，是主要由豬、牛、羊的甲狀腺經(jīng)過加工制得的生化藥品。有促進(jìn)分解代謝（升熱作用）和合成代謝的作用，對(duì)人體正常代謝及生長發(fā)育有重要影響，對(duì)嬰幼兒中樞神經(jīng)的發(fā)育甚為重要，臨床使用量大，多用于治療各種原因引起的甲狀腺功能減退癥[1-3]。甲狀腺激素的基本作用是誘導(dǎo)新生蛋白質(zhì)包括特殊酶系的合成，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪三大物質(zhì)，以及水、鹽和維生素的代謝。由于甲狀腺激素誘導(dǎo)細(xì)胞膜Na+-K+泵的合成并增強(qiáng)其活力，使能量代謝增強(qiáng)。甲狀腺激素主要包括甲狀腺素（T4）和三碘甲狀腺原氨酸（T3）兩種。

甲狀腺片為國家基本藥物目錄收載品種，現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)為《中華人民共和國藥典》[4]2015 年版二部，本課題組在檢驗(yàn)過程中，在對(duì)該品種進(jìn)行微生物限度方法適用性試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)個(gè)別樣品的金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率不符合規(guī)定，有一定程度的抑菌性。因該品種系取豬、牛、羊等食用動(dòng)物的甲狀腺體，為單一成分動(dòng)物性組織，結(jié)合目前國內(nèi)動(dòng)物飼養(yǎng)存在抗生素濫用情況，本課題組推測(cè)其存在抗生素殘留的可能性。抗生素在人體內(nèi)蓄積，使人產(chǎn)生對(duì)抗生素的抗性，還可造成耐藥菌感染，給臨床治療帶來困難，嚴(yán)重時(shí)可引起各種組織器官病變，甚至癌變。在參考大量文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上[5-15]，本課題組對(duì)甲狀腺片中7 種喹諾酮類藥物殘留情況進(jìn)行了研究，建立了液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS）法，該方法檢測(cè)靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可用于甲狀腺片中喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè)，保障臨床用藥的安全性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY 超高效液相色譜儀（Waters），AB Sciex Q-TRAP 5500 三重四極桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）；AE240 電子天平（0.01 mg）（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q Integral 超純水儀（Millipore 公司）。

1.2 試藥

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：恩諾沙星（Dr.Ehrenstorfer GmbH，批號(hào)：50106，含量以99.2%計(jì)）、環(huán)丙沙星（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，批號(hào)：201901，濃度100 μg/mL）、培氟沙星（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，批號(hào)：201906，濃度100 μg/mL）、氧氟沙星（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，批號(hào)：201906，濃度100 μg/mL）、洛美沙星（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：201603，含量以90.4%計(jì)）、沙拉沙星（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，批號(hào)：201901，濃度100 μg/mL）、諾氟沙星（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，批號(hào)：201901，濃度100 μg/mL）。樣品甲狀腺片為2019 年度山東省藥品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)計(jì)劃“甲狀腺片專項(xiàng)”抽檢藥品。甲醇、乙腈和甲酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC?BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：40℃；以乙腈為流動(dòng)相A，以1%甲酸為流動(dòng)相B，按表1 中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；質(zhì)譜檢測(cè)器。

表1 梯度洗脫表

2.2 質(zhì)譜條件

采用ESI，蒸發(fā)溫度為550℃，氣簾氣壓力為30 psi，噴霧氣壓力為55 psi，輔助加熱氣壓力為55 psi，離子化電壓為5500 V。選擇正離子掃描方式，多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM），7 種成分的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液制備 分別精密稱取恩諾沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星和諾氟沙星對(duì)照品各適量，加甲醇制成各含1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取恩諾沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星和諾氟沙星對(duì)照品儲(chǔ)備液各適量用初始流動(dòng)相分別制成1、5、20、50、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，備用。

2.3.2 供試品溶液制備 取本品研細(xì)，混勻，精密稱取約2.0 g，置50 mL 具塞離心管中，加入4 mL 水，渦旋2 min，再加入10 mL 的1%乙酸乙腈，渦旋5 min，超聲處理（功率400 W，頻率40 kHz）30 min，放冷至室溫，4000 r/min（離心半徑=25 cm）離心5 min（溫度低于5℃），上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，重復(fù)提取，合并上清液，準(zhǔn)確移取5 mL 于10 mL 離心管中，45℃下氮吹至近干，用1 mL 溶解液（乙腈∶水=2∶8）重新溶解，加乙腈飽和的正己烷3 mL，渦旋混合脫脂凈化，5000 r/min 離心3 min，靜置分層，取下層溶液用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液[8]。提取離子色譜圖見圖1。

表2 7 種成分的質(zhì)譜參數(shù)

圖1 7 種對(duì)照品提取離子流圖

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.3.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下的條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品濃度（C）為橫坐標(biāo)，待測(cè)物質(zhì)峰面積（A）為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，結(jié)果表明7 種成分在相應(yīng)的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見表3。

表3 線性關(guān)系結(jié)果及定量限

2.5 精密度試驗(yàn)

取濃度為20 ng/mL 混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得各被測(cè)成分峰面積的RSD 分別為恩諾沙星（1.5%）、環(huán)丙沙星（2.2%）、培氟沙星（1.8%）、氧氟沙星（1.7%）、洛美沙星（2.0%）、沙拉沙星（2.3%）、諾氟沙星（2.2%），表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取濃度為20 ng/mL 混合對(duì)照品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得7 種被測(cè)成分峰面積的RSD 分別為恩諾沙星（2.3%）、環(huán)丙沙星（2.0%）、培氟沙星（2.5%）、氧氟沙星（2.2%）、洛美沙星（2.9%）、沙拉沙星（3.2%）、諾氟沙星（2.5%），表明其在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的甲狀腺片（批號(hào)：014180801）6 份，每份2.0 g，精密加入混合對(duì)照品溶液適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制成低、中、高3 個(gè)不同濃度的供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，7 種喹諾酮類藥物平均加樣回收率均在85.0%～100.0%范圍內(nèi)。分別為恩諾沙星（99.1%）、環(huán)丙沙星（90.8%）、培氟沙星（96.7%）、氧氟沙星（96.2%）、洛美沙星（98.8%）、沙拉沙星（89.2%）、諾氟沙星（91.5%），符合分析要求。見表4。

表4 加樣回收率結(jié)果（n=6）

2.8 樣品測(cè)定

按上述方法對(duì)收到的30 批樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中5 批樣品檢出氧氟沙星，5 批樣品均來自同一生產(chǎn)企業(yè)，批號(hào)分別為180201、180803、180806、181004、190301，其他均未檢出。檢出氧氟沙星殘留的5 批次樣品與微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率不符合規(guī)定的批次一致[16]。

3 討論

甲狀腺片系取豬、牛、羊等食用動(dòng)物的甲狀腺體，為單一成分動(dòng)物性組織，結(jié)合目前國內(nèi)動(dòng)物飼養(yǎng)存在抗生素濫用情況，存在抗生素殘留的可能性。抗生素在人體內(nèi)蓄積，使人產(chǎn)生對(duì)抗生素的抗性，給臨床治療帶來困難，抗生素還可以誘導(dǎo)一些微生物產(chǎn)生耐藥菌株，導(dǎo)致人類過敏，甚至更大的危害。甲狀腺片主要用于甲狀腺功能低下和甲狀腺功能減退患者，需要長期服藥，藥品中如果有抗生素殘留，可能會(huì)對(duì)服用者產(chǎn)生一定危害，甲狀腺片現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)沒有抗生物殘留檢查項(xiàng)目，經(jīng)筆者了解，因?yàn)槿狈ο嚓P(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和參考依據(jù)，生產(chǎn)廠家對(duì)原料抗生素殘留檢驗(yàn)的種類和頻次各不相同。建議盡快出臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)增加相關(guān)的檢驗(yàn)項(xiàng)目，對(duì)甲狀腺片及其原料中抗生素的含量進(jìn)行控制，以便更好地控制甲狀腺片的質(zhì)量，以免對(duì)服用者產(chǎn)生危害。

喹諾酮類藥物化學(xué)性質(zhì)相似，分離困難，用常規(guī)液相色譜方法實(shí)現(xiàn)分離造成每次進(jìn)樣時(shí)間很長。LC-MS/MS 法表現(xiàn)出的高選擇性、高靈敏度，不要求各成分完全分離，大大縮短了分析時(shí)間。采用質(zhì)譜檢測(cè)器，用MRM 方式測(cè)定，可以有效避免干擾，專屬性更強(qiáng)，可以準(zhǔn)確測(cè)定樣品中藥物殘留的含量。通過試驗(yàn)優(yōu)化了不同色譜柱和不同流動(dòng)相體系，結(jié)果顯示，采用ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫，待測(cè)組分分離效果好，檢測(cè)靈敏度較高。質(zhì)譜分析中，對(duì)各被測(cè)成分的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，喹諾酮類藥物成分在正離子模式下有較高的響應(yīng)和較好的峰形。

參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T21312-2007[15]供試品制備方法[提取：稱取均質(zhì)試樣5.0 g，置50 mL 離心管中，加入20 mL 0.1 mol/L 的EDTA-Mcllvaine 緩沖液，1000 r/min渦旋混合1 min，超聲提取10 min，10 000 r/min 離心5 min（溫度低于5℃），提取3 次，合并上清液。凈化：將提取的上清液以2～3 mL/min 的速度過HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL），棄去濾液，用2 mL 5%甲醇水溶液淋洗，棄去淋洗液，將小柱抽干，再用6 mL 甲醇洗脫并收集洗脫液，洗脫液用氮?dú)獯蹈?，? mL 0.2%甲酸水溶液溶解，即得]。實(shí)驗(yàn)中分別考察了水、甲醇、乙腈作為提取溶劑，超聲與渦旋兩種提取方式。經(jīng)提取條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)選用水提取，加入1%乙酸乙腈除去蛋白，加乙腈飽和的正己烷脫脂凈化后，各被測(cè)成分峰形較好，提取率較高。

本研究建立了LC-MS/MS 法測(cè)定甲狀腺片中7 種喹諾酮類藥物的殘留的方法，該方法簡便、快速、靈敏度高、專屬性好，可用于甲狀腺片中喹諾酮類藥物殘留的質(zhì)量控制。