周新朋 金曄華 張潤(rùn)潤(rùn) 何東儀

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬光華醫(yī)院關(guān)節(jié)內(nèi)科，上海 200052

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性炎癥性疾病，以關(guān)節(jié)受累為主，引起關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞，并最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)的畸形[1]。其發(fā)病與遺傳、性別、年齡、吸煙等密切相關(guān)[2]。成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）是間充質(zhì)來(lái)源的、具有成纖維細(xì)胞特征的滑膜細(xì)胞，是RA 發(fā)病過(guò)程中的主要的效應(yīng)細(xì)胞[3]。

人類(lèi)基因組絕大部分都可以被轉(zhuǎn)錄，但只有一小部分（大約2%）轉(zhuǎn)錄為mRNA，剩余部分則轉(zhuǎn)錄為不同種類(lèi)的非編碼RNA[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是指長(zhǎng)度超過(guò)200 nt，但不具有蛋白編碼能力的RNA[5]。lncRNA 可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）機(jī)制，通過(guò)微小RNA（miRNA）反應(yīng)元件（microRNA response elements，MREs）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[6]。

本課題組在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）中獲得RA-FLS 細(xì)胞的lncRNA 表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集，將多個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行合并，構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)并預(yù)測(cè)關(guān)鍵的lncRNA。

1 材料與方法

1.1 基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集的獲取

在GEO 中獲取相關(guān)的數(shù)據(jù)集GSE103578、GSE8 3147、GSE128813，每個(gè)數(shù)據(jù)集中對(duì)照組含有3 個(gè)健康人滑膜分離的FLS，RA 組含有3 個(gè)RA 患者滑膜分離的FLS。使用limma 包[7]進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，通過(guò)idmap3 包[8]對(duì)探針進(jìn)行注釋?zhuān)鶕?jù)基因名稱(chēng)將數(shù)據(jù)集合并，并去除批次效應(yīng)。

1.2 差異基因的篩查

根據(jù)基因類(lèi)型篩選mRNA 及l(fā)ncRNA，通過(guò)limma包[7]分別進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，以logFC >1.0 并且P ＜0.05 的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。

1.3 構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)

在lncbase[9]、starBase[10]、miRcode[11]數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得與差異表達(dá)的lncRNA 相關(guān)miRNA，在miRWalk[12]、TargetScan[13]數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找與mRNA 相關(guān)的miRNA，二者取交集，通過(guò)Cytoscape 軟件[14]，構(gòu)建lncRNAmiRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)，將網(wǎng)絡(luò)中的lncRNA 作為關(guān)鍵lncRNA。

2 結(jié)果

2.1 芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理

對(duì)獲得的數(shù)據(jù)集進(jìn)行注釋及合并，得到對(duì)照組、RA 組各9 個(gè)樣本，共有20 050 條基因的數(shù)據(jù)集，其中mRNA 有14 760 條、lncRNA 有5290 條。去除批次效應(yīng)后各樣本間數(shù)據(jù)達(dá)到一致性要求（批次效應(yīng)處理前后數(shù)據(jù)集均一性變化如圖1 所示），可以進(jìn)行差異表達(dá)分析。

2.2 基因差異表達(dá)分析

分別對(duì)數(shù)據(jù)集中的mRNA 和lncRNA 進(jìn)行差異表達(dá)分析。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，RA 組mRNA 上調(diào)31 條，下調(diào)56 條，見(jiàn)圖2A；RA 組lncRNA上調(diào)9 條，下調(diào)14 條，見(jiàn)圖2B。

圖1 去除批次效應(yīng)前后基因的表達(dá)情況

圖2 基因差異表達(dá)分析

2.3 lncRNA-mRNA 共表達(dá)分析

對(duì)差異表達(dá)的mRNA 和lncRNA 進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析顯示，具有明顯相關(guān)性的lncRNA 有18 條，mRNA有51 條（R ＞0.85 且P ＜0.05）。構(gòu)造的lncRNAmRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3。

2.4 通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)獲取多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的RNA 信息，得到與共表達(dá)的lncRNA、mRNA 有結(jié)合位點(diǎn)的miRNA，并取交集，獲得相關(guān)miRNA，構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA 相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，其中l(wèi)ncRNA 有13 條，包括lncRNA XIST、NR2F2-AS1、LINC01018 等，miRNA 有26 條，mRNA 有46 條。lncRNA-miRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖4。

3 討論

圖3 lncRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

FLS 是RA 血管翳中最常見(jiàn)的一種細(xì)胞類(lèi)型，通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶及侵襲關(guān)節(jié)軟骨導(dǎo)致關(guān)節(jié)的破壞。RA-FLS 與健康人滑膜FLS 比較，在細(xì)胞因子的表達(dá)、細(xì)胞信號(hào)通路的激活、原癌基因的表達(dá)方面存在明顯不同[15]，這些不同可能與RA-FLS 的表觀(guān)遺傳學(xué)改變有關(guān)[16-17]。

lncRNA 的作用機(jī)制多樣，可在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后改變基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)各種生物學(xué)過(guò)程。最近發(fā)現(xiàn)可通過(guò)與miRNA 相互作用，改變miRNA 的表達(dá)水平，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)。lncRNA 與mRNA 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MRE，可先通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)lncRNA-miRNA-mRNA 之間的相互關(guān)系[18]，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供指導(dǎo)。

有研究顯示XIST 是多種腫瘤的原癌基因[19]，本研究發(fā)現(xiàn)XIST 在基因表達(dá)芯片中差異表達(dá)，并且與多個(gè)miRNA、mRNA 相互作用，Wang 等[20]發(fā)現(xiàn)XIST 在骨性關(guān)節(jié)炎（OA）樣本中表達(dá)升高，XIST 及MMP-13、ADAMTS5 為miR-1277-5p 的靶基因，通過(guò)ceRNA 機(jī)制競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-1277-5p，導(dǎo)致MMP-13、ADAMTS5升高，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，RA 與OA 發(fā)病存在共有機(jī)制[21]，XIST 的研究對(duì)RA 骨破壞機(jī)制的研究具有參考意義。NR2F2-AS1 在多種腫瘤中具有重要作用，NR2F2-AS1 在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞中表達(dá)升高，通過(guò)與BMI1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-320b 而與腫瘤的TNM 分期、患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[22]。LINC01018 在肝臟內(nèi)可以通過(guò)RNA 結(jié)合蛋白HuR 調(diào)節(jié)脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)[23]。肝癌細(xì)胞中LINC01018 的DNA甲基化水平改變，導(dǎo)致在肝細(xì)胞癌中表達(dá)水平下降，抑制肝癌細(xì)胞增生減弱[24]。

圖4 lncRNA-miRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

lncRNA 在RA 中的作用已在多項(xiàng)研究中被證實(shí)，但是主要集中在HOTAIR、LincRNA-p21 等被廣泛研究的lncRNA 中，其他lncRNA 在RA 中的作用還需要進(jìn)一步尋找并驗(yàn)證[25]。本研究發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵lncRNA 有13 條，可以構(gòu)建復(fù)雜的lncRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步揭示了lncRNA 在RA-FLS 細(xì)胞中的功能機(jī)制。