秦振英 仲逢鈺 陳 瑤 李 婧 楊 梓 文 娟 王玉美 胡幼芳

1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇省婦幼保健院兒童保健科，江蘇南京 210036；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210029；3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇南京 210004；4.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬淮安市婦幼保健院新生兒疾病篩查科，江蘇淮安 223302

近年來，超重/肥胖發(fā)生率逐年上升[1]，呈明顯低齡化趨勢(shì)，不僅影響兒童生長(zhǎng)發(fā)育，且成年后罹患多種代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)增加[2]。作為機(jī)體重要的代謝儲(chǔ)能器官，脂肪組織還可分泌諸多炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、抵抗素、脂連素、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等[3]，加之后天靜坐少動(dòng)、膳食結(jié)構(gòu)改變等環(huán)境因素影響[4]，造成脂肪組織過多異常積聚，脂源性細(xì)胞因子的分泌及作用出現(xiàn)異常，誘發(fā)了肥胖相關(guān)胰島素抵抗的發(fā)生并加劇其進(jìn)展[5]。

微小RNA（miRNA），一類新型內(nèi)分泌因子，通過抑制翻譯或降解靶標(biāo)mRNA 對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，參與能量代謝調(diào)節(jié)[6]、胰島素抵抗[7-8]、腫瘤發(fā)生[9]等病理生理過程。本研究小組前期發(fā)現(xiàn)，miR-506 在正常與肥胖患者脂肪組織中差異表達(dá)，進(jìn)一步生物信息學(xué)及靶基因富集分析發(fā)現(xiàn)，miR-506 與胰島素抵抗、脂肪細(xì)胞因子、胰腺癌等多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。而目前有關(guān)miR-506 主要集中于腫瘤性疾病的研究[10-11]。本研究擬探討脂源性炎癥因子（TNF-α、IL-6）對(duì)人脂肪細(xì)胞中miR-506 表達(dá)的調(diào)控作用，為闡明其在肥胖相關(guān)胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人前體脂肪細(xì)胞系（HPA-v），購(gòu)自美國(guó)Science Cell 公司。

1.2 脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

人前體脂肪細(xì)胞，在37℃、5%CO2孵箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）中培養(yǎng)，以含5%胎牛血清的人脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Science Cell 公司，No.7211）培養(yǎng)人脂肪前體細(xì)胞，按1×105個(gè)/mL 密度接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至完全融合并使細(xì)胞接觸抑制48 h 后開始誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)液換用含3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（MIX，美國(guó)Sigma 公司，No.I7018）0.5 mmol/L、地塞米松（美國(guó)Sigma 公司，No.50-02-2）1 μmol/L、胰島素（美國(guó)Sigma 公司，No.I2643）5 μg/mL 和羅格列酮（美國(guó)Sigma 公司，No.R2408）1 μmol/L 的DMEM/F12的無糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司，No.12400-024）。培養(yǎng)4 d 后換用含5 μg/mL 胰島素的DMEM/F12 無糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3 天換液1 次，直至第15 天，采用油紅“O”（美國(guó)Sigma 公司，No.O8010）染色法驗(yàn)證分化成熟度。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)人成熟脂肪細(xì)胞中miR-506 的表達(dá)情況

將人脂肪前體細(xì)胞接種于6 孔板中，誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞。細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)前1 d 更換為無血清無糖的DMEM/F12 培養(yǎng)基饑餓刺激過夜，后分別以含濃度為10、30 ng/mL 的TNF-α（美國(guó)Sigma 公司，No.T6674）、IL-6（美國(guó)Sigma 公司，No.KX-GMP-027）的DMEM/F12 無糖培養(yǎng)基干預(yù)0、4、8、24 h。分別收取各時(shí)間點(diǎn)不同濃度的脂肪細(xì)胞，-70℃冰箱凍存?zhèn)溆?。具體如下：Trizol（美國(guó)Invitrogen 公司，No.15596026）法提取脂肪細(xì)胞中總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TAKARA 公司，No.RR037A）說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所用引物序列由廣州銳博生物技術(shù)有限公司提供。采用SYBRGreen PCR 試劑盒（美國(guó)KAPA Biosystems 公司，No.KK4601）定量擴(kuò)增體系進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)總體積10 μL：cDNA 1 μL，引物0.5 μL，SYBR Primix Ex TaqTM2 μL，加RNase H2O 至10 μL。其中PCR 擴(kuò)增條件：50℃預(yù)變性20 min，95℃變性2 min，95℃15 s，60℃60 s，40 個(gè)循環(huán)。應(yīng)用2-△△CT方法計(jì)算表達(dá)量。分別與0 h比較，計(jì)算藥物干預(yù)4、8、24 h 后miR-506 的相對(duì)表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)操作至少3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8 及SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人脂肪細(xì)胞分化過程中形態(tài)學(xué)的變化

顯微鏡下見人脂肪細(xì)胞中脂滴豐富，約85%以上的細(xì)胞分化成熟，提示本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)分化方案切實(shí)可行。見圖1。

圖1 人脂肪細(xì)胞分化形態(tài)圖（200×）

2.2 人脂肪細(xì)胞分化過程中miR-506 的表達(dá)情況

qRT-PCR 結(jié)果顯示，分化成熟脂肪細(xì)胞中miR-506 表達(dá)量高于前體脂肪細(xì)胞，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.07，P <0.01）。見圖2。

圖2 人脂肪細(xì)胞分化過程中miR-506 的表達(dá)情況

2.3 TNF-α 作用時(shí)間及濃度變化對(duì)人脂肪細(xì)胞miR-506表達(dá)水平的影響

10 ng/mL 的TNF-α 干預(yù)成熟人脂肪細(xì)胞4、8、24 h miR-506 表達(dá)量與干預(yù)0 h 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。30 ng/mL 的TNF-α 干預(yù)成熟人脂肪細(xì)胞24 h miR-506 表達(dá)量高于干預(yù)0 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.42，P <0.05）。見圖3。

2.4 IL-6 作用時(shí)間及濃度變化對(duì)人脂肪細(xì)胞miR-506 表達(dá)水平的影響

圖3 TNF-α 作用時(shí)間及濃度變化對(duì)人脂肪細(xì)胞miR-506 表達(dá)水平的影響

10 ng/mL 的IL-6 干預(yù)成熟人脂肪細(xì)胞4、8、24 h miR-506 表達(dá)量與干預(yù)0 h 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。30 ng/mL 的IL-6 干預(yù)成熟人脂肪細(xì)胞24 h miR-506 表達(dá)量高于干預(yù)0 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.91，P <0.05）。見圖4。

3 討論

圖4 IL-6 作用時(shí)間及濃度變化對(duì)人脂肪細(xì)胞miR-506 表達(dá)水平的影響

肥胖癥是由于長(zhǎng)期能量攝入超過機(jī)體消耗，導(dǎo)致體內(nèi)脂肪過度異常積聚的一種常見的營(yíng)養(yǎng)障礙性疾病。研究顯示[5,12-13]，肥胖時(shí)脂肪組織分泌的TNF-α、IL-6 等細(xì)胞因子介導(dǎo)的慢性炎癥是引起肥胖相關(guān)胰島素抵抗、代謝綜合征等相關(guān)疾病的重要因素。肥胖及其相關(guān)疾病病因機(jī)制復(fù)雜，近年來諸多研究顯示，肥胖、胰島素抵抗及miRNA 之間有著密切的聯(lián)系[6-8,14]。

miRNA 是真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類高度保守且具有調(diào)控功能的非編碼RNA 分子。有文獻(xiàn)綜述顯示[14]，與正常對(duì)照組比較，肥胖患者循環(huán)中有33 個(gè)miRNA表達(dá)異常，進(jìn)一步生物信息學(xué)分析顯示這些miRNA相關(guān)靶基因功能涉及脂肪酸的代謝以及胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)。Cui 等[15]篩選了肥胖兒童及2 型糖尿病成年患者循環(huán)中數(shù)個(gè)差異表達(dá)的miRNA 并在肥胖及胰島素抵抗模型小鼠中進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，miR-486、miR-146b、miR-15b 可作為預(yù)測(cè)肥胖兒童成年后發(fā)生2 型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物。本研究小組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-506 在肥胖患者脂肪組織中差異表達(dá)，進(jìn)一步細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成熟人脂肪細(xì)胞中miR-506 表達(dá)明顯高于前體脂肪細(xì)胞；且靶基因富集分析顯示，miR-506與胰島素抵抗、脂肪細(xì)胞因子等多個(gè)信號(hào)通路有關(guān)，提示其可能與肥胖及肥胖相關(guān)胰島素抵抗有關(guān)。本研究擬探討脂源性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6）刺激誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下miR-506 的表達(dá)情況。

人體脂肪組織是促炎細(xì)胞因子的主要來源之一，在肥胖及胰島素抵抗個(gè)體中TNF-α、IL-6 水平明顯升高，且與肥胖和胰島素抵抗的程度相關(guān)[16-18]。TNF-α可直接抑制胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白胰島素受體底物-1（IRS-1）的酪氨酸磷酸化水平[19]、降低胰島素敏感細(xì)胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 的表達(dá)水平[12]，或間接抑制PI3K-AKT 胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[20]，最終導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。如分別以10、20 ng/mL 的TNF-α 干預(yù)96 h[12]和24 h[21]，可引起3T3-L1 脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的發(fā)生。以TNF-α 干預(yù)成熟人脂肪細(xì)胞也可引起胰島素抵抗相關(guān)miRNA 的表達(dá)異常[22-23]。綜上，本研究以10、30 ng/mL 的TNF-α 干預(yù)成熟人脂肪細(xì)胞結(jié)果顯示，10 ng/mL 的TNF-α 干預(yù)成熟人脂肪細(xì)胞4、8、24 h miR-506 表達(dá)量與干預(yù)0 h 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）；30 ng/mL 的TNF-α干預(yù)成熟人脂肪細(xì)胞24 h miR-506 表達(dá)量高于干預(yù)0 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。IL-6 也是肥胖相關(guān)胰島素抵抗發(fā)生的重要細(xì)胞因子，IL-6 慢性失衡可引起胰島素受體及IRS-1 的磷酸化受損，或激活炎癥信號(hào)通路交互抑制胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)[13,24]。如20 ng/mL 的IL-6 處理脂肪細(xì)胞24 h 明顯降低胰島素刺激后IRS-1 酪氨酸磷酸化活性[19]；亦有研究顯示[25],100～200 ng/mL 的IL-6 可直接調(diào)控脂肪細(xì)胞中胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞因子抑制因子3 的表達(dá)，通過多種直接或間接途徑影響胰島素靶細(xì)胞正常發(fā)揮作用，從而引發(fā)胰島素抵抗。30 ng/mL 的IL-6干預(yù)人脂肪細(xì)胞48 h 可通過調(diào)控相關(guān)miRNA 的表達(dá)來影響脂肪細(xì)胞胰島素的敏感性[23]。本研究進(jìn)一步以10、30 ng/mL 的IL-6 干預(yù)成熟人脂肪細(xì)胞，結(jié)果顯示，10 ng/mL 的IL-6 干預(yù)成熟人脂肪細(xì)胞4、8、24 h miR-506 表達(dá)量與干預(yù)0 h 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）；30 ng/mL 的IL-6 干預(yù)成熟人脂肪細(xì)胞24 h miR-506 表達(dá)量高于干預(yù)0 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。本研究結(jié)果提示miR-506 表達(dá)水平的變化可能與TNF-α、IL-6 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗有關(guān)，為miR-506 進(jìn)一步的功能研究提供理論依據(jù)。

肥胖與胰島素抵抗密切相關(guān)，脂肪組織的慢性炎癥是肥胖和胰島素抵抗的中間橋梁。本研究結(jié)果初步提示，miR-506 的表達(dá)受到多種肥胖和胰島素抵抗相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)控，可能與肥胖相關(guān)胰島素抵抗的發(fā)生有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。