王良波 李 堅(jiān) 文紹吉

四川省巴中市中心醫(yī)院普外科，四川巴中 636000

原發(fā)性肝癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，具有惡性度高、治愈率低及預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。原發(fā)性肝癌臨床癥狀主要有肝區(qū)疼痛或伴有一定消化系統(tǒng)癥狀，晚期可出現(xiàn)上消化道出血、肝昏迷等癥狀，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡[2]。大部分原發(fā)性肝癌患者確診時(shí)往往是中晚期，治療效果較差，因此，探索原發(fā)性肝癌發(fā)生的分子機(jī)制，盡早診斷與治療對(duì)患者生存具有至關(guān)重要的意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一組長(zhǎng)度為18～22 個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，它可以結(jié)合靶基因的3’-非翻譯區(qū)的互補(bǔ)位點(diǎn)，從而誘導(dǎo)基因抑制和蛋白質(zhì)降解等過(guò)程[3-4]。有研究顯示[5]，miRNA 在人類癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，無(wú)論是致癌基因還是抑癌基因。如miR-363 在肝癌患者血清中呈低表達(dá)狀態(tài)，通過(guò)靶向調(diào)控E2F3 調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，表明miRNA 可能通過(guò)調(diào)控原發(fā)性肝癌發(fā)展過(guò)程中相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)節(jié)原發(fā)性肝癌的進(jìn)展[6]。miR-127 是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，與miR-136、miR-432 同屬于1 個(gè)miRNA 簇，miR-127-3p 為其前體基因[7]。miR-127-3p 在多種腫瘤組織中均呈高表達(dá)狀態(tài)，如乳腺癌、胃癌等[8-9]，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但其在原發(fā)性肝癌中的具體作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者血清miR-127-3p 的相對(duì)表達(dá)量，初步探討其作用機(jī)制及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年6 月—2019 年5 月四川省巴中市中心醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）住院治療的原發(fā)性肝癌患者93 例為原發(fā)性肝癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查明確診斷為原發(fā)性肝癌；②首次確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有心、腦等重要臟器疾病；②有嚴(yán)重感染疾??；③接受過(guò)抗腫瘤治療。其中男66 例，女27 例；平均年齡（55.3±2.2）歲；≥55 歲48 例，＜55 歲45 例；低中分化51 例，高分化42 例；TNM 分期：Ⅰ期64 例，Ⅱ期16 例，Ⅲ期8 例，Ⅳ期5 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53 例；腫瘤直徑＜2.5 cm 47 例，≥2.5cm 46 例。TNM分期及病理分化程度參考第八版美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[10]。另選取我院同期體檢的健康志愿者60 名為對(duì)照組，其中男30 例，女30 例；平均年齡（50.24±2.06）歲。兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

所有受試者晨起空腹抽取靜脈血約4 mL，加入到促凝血管中，3000 r/min 離心10min，分離血清。提取總RNA（試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司），將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為：25℃10 min，50℃45 min，85℃5 min。再對(duì)cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，引物：miR-663，F(xiàn)：5’-TCGGATCCGTCTGAGCTTGGCT-3’，R：5’-CCAAGCTCAGACGGATCCGATT-3’。內(nèi)參基因U6 作為對(duì)照，F(xiàn)：5’-GGTTAGAAGTCATACG-3’，R：5’-TGTCATGAATGATCC-3’。反應(yīng)體系為：10 μL BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix（2×），2 μL cDNA 模板，1 μL上下游引物和6 μL H2O。產(chǎn)物擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性5 min，95℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt來(lái)計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)化miR-127-3p 的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)價(jià)miR-127-3p 在原發(fā)性肝癌中的診斷效能。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-127-3p 相對(duì)表達(dá)量比較

原發(fā)性肝癌組miR-127-3p 的相對(duì)表達(dá)量為（0.301±0.010），低于對(duì)照組的（0.623±0.018），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=126.540，P ＜0.001）。

2.2 原發(fā)性肝癌患者血清miR-127-3p 相對(duì)表達(dá)量與臨床資料之間的關(guān)系

不同細(xì)胞分化程度、TNM 分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性肝癌患者血清miR-127-3p 相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01）。見表1。

表1 原發(fā)性肝癌患者血清miR-127-3p 相對(duì)表達(dá)量與臨床資料之間的關(guān)系（）

表1 原發(fā)性肝癌患者血清miR-127-3p 相對(duì)表達(dá)量與臨床資料之間的關(guān)系（）

2.3 血清miR-127-3p 相對(duì)表達(dá)量對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷效能

結(jié)果顯示，血清miR-127-3p 相對(duì)表達(dá)量診斷原發(fā)性肝癌的截?cái)嘀禐?.420，AUC 為0.793（95%CI：0.758～0.816，P ＜0.001），約登指數(shù)為0.71，靈敏度、特異性分別為0.860、0.850。見圖1。

3 討論

圖1 血漿miR-127-3p 診斷原發(fā)性肝癌的ROC 曲線

原發(fā)性肝癌是目前全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，并且是全球第二大癌癥相關(guān)死亡原因[11]。其發(fā)病原因尚不清楚，可能與病毒性肝炎、酒精性肝炎、肝硬化及家族遺傳史有關(guān)[12]。原發(fā)性肝癌的治療手段包括手術(shù)切除、動(dòng)脈栓塞、射頻消融及放化療治療等[13]。近年來(lái)，盡管醫(yī)療水平不斷提高，但對(duì)早期原發(fā)性肝癌檢出效果并不理想，因此探尋靈敏的腫瘤標(biāo)志物已成為臨床學(xué)者研究的重點(diǎn)。

miRNA 是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，其可以通過(guò)影響mRNA的轉(zhuǎn)錄及翻譯來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，參與腫瘤組織的發(fā)生、增殖及代謝等[14-16]。異常表達(dá)的miRNA 可影響多種生物學(xué)過(guò)程，如血管形成、癌癥的發(fā)生及癌細(xì)胞的耐藥性等[17-23]。miR-127 位于人染色體區(qū)域14q32.31 上，miR-127-3p 是由miR-127 的前體轉(zhuǎn)錄而來(lái)，在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)分化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[24]。本研究結(jié)果顯示，原發(fā)性肝癌患者血清miR-127-3p 相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（P ＜0.05），且miR-127-3p 的表達(dá)與腫瘤分期、細(xì)胞分化等有關(guān)。Wang 等[25]研究發(fā)現(xiàn)miR-127-3p 可通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因ITGA6（整聯(lián)蛋白alpha-6）抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖分化及遷移過(guò)程，而本研究并未對(duì)miR-127-3p的具體分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行研究，但miR-127-3p 在原發(fā)性肝癌進(jìn)展中調(diào)控機(jī)制可能為：miR-127-3p 抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路表達(dá)，下調(diào)WNT7A（Wnt 家族成員7A）的表達(dá)水平，對(duì)DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄具有較強(qiáng)的抑制作用，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[26-27]；當(dāng)人為敲低WNT7A 的表達(dá)時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、遷移及侵襲過(guò)程有明顯的抑制作用[28-29]。此外，miR-127-3p 可抑制COA1（細(xì)胞色素C 氧化酶裝配因子1）的表達(dá)，阻礙細(xì)胞核酸及蛋白質(zhì)合成，進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞的形成及增殖過(guò)程[30-31]。ROC 結(jié)果顯示，AUC＞0.7，敏感度和特異性分別為0.860、0.850。提示miR-127-3p 的表達(dá)對(duì)原發(fā)性肝癌具有一定診斷價(jià)值，可作為診斷原發(fā)性肝癌診斷的分子標(biāo)志物。但本研究樣本量較小，有待多中心大批量標(biāo)本進(jìn)行后續(xù)研究。

綜上所述，原發(fā)性肝癌患者血清中miR-127-3p呈低表達(dá)，在不同腫瘤分期、細(xì)胞分化程度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在差異表達(dá)，可作為診斷原發(fā)性肝癌診斷的分子標(biāo)志物。