封繼宏 譚旺曉 張 碩 金世元 畢明達 秦云普 趙 坤

1.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，天津 300150；2.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 300193；3.北京市衛(wèi)生學校，北京 100053；4.海南中盛合美生物制藥有限公司，海南?？?570100

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）是指感染2019 新型冠狀病毒（SARSCoV-2）引起的肺炎，主要癥狀為發(fā)熱、咳嗽、肌痛或疲勞，主要通過呼吸道飛沫和接觸傳播[1]。其迅速蔓延至全國及世界其他地區(qū)，對人民的生命財產及社會的穩(wěn)定造成了嚴重的影響[2]。目前全球疫情仍未得到有效控制，尚無針對COVID-19 的特效藥，而我國中西結合療效顯著，為全球提供了中醫(yī)藥抗疫經驗[3]。

射麻口服液是在《傷寒雜病論》麻杏石甘湯的基礎上加減而成，由麻黃、膽南星、石膏、桑白皮、射干、萊菔子、苦杏仁、白前、黃芩、五味子組成，具有清肺化痰、止咳平喘的功效。在抗擊COVID-19 疫情中，《福建省新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)診療專家共識》[4]、《北京市新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)藥防治方案（試行第四版）》[5]均將射麻口服液列為推薦中成藥。因此，研究射麻口服液治療COVID-19 的作用機制對指導其臨床應用具有重要意義。

本研究基于網絡藥理學的方法初步探討射麻口服液治療COVID-19 可能的作用機制，為其更廣泛地用于治療COVID-19 提供理論依據，并為更加深入地理解中醫(yī)藥防治COVID-19 提供科學指導。

1 資料與方法

1.1 資料

中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、人類基因數據庫GeneCards（https：//www.genecards.org/）、STRING 數據庫（https：//string-db.org/）和蛋白質靶點數據庫Uniprot（http：//www.uniprot.org/）；網絡分析工具Cytoscape 3.7.2 和IPA 分析軟件（http：// www.ingenuity.com）。

1.2 射麻口服液活性成分及作用靶點篩選

利用TCMSP 檢索射麻口服液中麻黃、天南星、石膏、桑白皮、射干、萊菔子、苦杏仁、白前、黃芩、五味子的化學成分，檢索時間截至2020 年3 月25 日；并以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為參數篩選活性化合物。通過TCMSP 數據查詢活性化合物的作用靶點，借助Uniprot 數據庫對靶點進行標準化。

1.3 疾病靶點收集

基于GeneCards 數據庫，以“novel coronavirus pneumonia”為關鍵詞進行檢索，獲取COVID-19 相關的靶基因，檢索時間截至2020 年4 月2 日。

1.4 射麻口服液治療COVID-19 的潛在作用靶點預測

將射麻口服液的作用靶點和COVID-19 的靶點進行映射，篩選出共同靶點，作為射麻口服液治療COVID-19 的潛在作用靶點。

1.5 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建

將“1.4”中得到的潛在作用靶點及其相對應的活性成分和成分對應的中藥導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構建藥物-成分-靶點-疾病相互作用網絡，采用Network Analyzer 功能對網絡進行分析。

1.6 蛋白相互作用（PPI）網絡構建及分析

在STRING 數據庫中輸入射麻口服液治療COVID-19 的潛在作用靶點，進行PPI 分析，利用Cytoscape 3.7.2 軟件進行網絡構建，并通過CytoHubba 功能對節(jié)點的度值（Degree 值）進行分析，提取關鍵子網絡。

1.7 靶點功能及通路富集分析

將靶點上傳至IPA 進行Core Analysis，采用STRING 數據庫對潛在作用靶點進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析。

2 結果

2.1 射麻口服液的活性成分及作用靶點

通過TCMSP 數據庫檢索射麻口服液中10 味中藥的化學成分，根據OB≥30%、DL≥0.18 篩選出活性化合物148 個，見圖1A。去重后得到106 個活性成分，按照OB 值排名前20 的活性成分見表1。通過TCMSP數據庫匹配到853 個作用靶點，每味中藥對應靶點數見圖1B。靶點去重并進行標準化后得到265 個靶點。

圖1 射麻口服液活性成分及對應靶點數量

表1 射麻口服液中OB 值前20 的活性成分基本信息

2.2 射麻口服液治療COVID-19 的潛在作用靶點

通過GeneCards 數據庫檢索得到COVID-19 相關靶點259 個，將其與射麻口服液的作用靶點取交集，得到53 個共同靶點。見圖2。

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡

采用Cytoscape 3.7.2 軟件構建藥物-成分-靶點-疾病網絡，見圖3。采用Network Analyzer 對網絡進行分析，按照Degree 值定義節(jié)點的大小，如圖3 所示，其中槲皮素（MOL000098）、β-谷甾醇（MOL000358）、木犀草素（MOL000006）、山奈酚（MOL000422）、漢黃芩素（MOL000173）、豆甾醇（MOL000449）、柚皮素（MOL004328）、金合歡素（MOL001689）、黃芩素（MOL 002714）均能與10 個以上的靶點連接，而在53 個潛在作用靶點中，PTGS2、PTGS1、NOS2、DDP4、PIK3CG、CASP3、BCL2、MAPK14、RELA 等靶點又能與10 個以上的成分連接。

2.4 PPI 網絡

圖2 射麻口服液作用靶點和COVID-19 靶點交集

圖3 藥物-成分-靶點-疾病網絡圖

使用STRING 平臺對53 個潛在作用靶點進行分析，用Cytoscape3.7.2 軟件構建PPI 網絡圖，見圖4（封三）。圖中節(jié)點面積、顏色表示靶點的Degree 值大小，面積越大、顏色越趨于暖色的節(jié)點對應靶蛋白的Degree 值越高；邊的粗細、顏色表示連接評分，邊越粗、顏色越趨于冷色評分越高，關系越密切，節(jié)點之間的邊數越多表示靶點之間的關聯度越大。同時運用CytoHubba 插件對靶點的Degree 值進行排序，篩選出Degree 值≥30 的靶蛋白14 個，包括MAPK3、TP53、TNF、IL -6、MAPK8、CASP3、MAPK1、IL -10、CXCL8、CCL2、MAPK14、PTGS2、IL-1B、IL-4，并提取關鍵子網絡，見圖5。Degree 值大的靶點在網絡中起著關鍵作用，說明這14 個靶蛋白是PPI 網絡的核心靶點。

圖4 蛋白相互作用網絡圖

圖5 蛋白相互作用關鍵子網絡

2.5 靶點功能分析

IPA 分析得到500 條靶點相關的疾病和生物學功能信息，按照P 值排序，主要涉及細胞死亡和存活（cell death and survival）、機體損傷和異常（organismal injury and abnormalities）、炎癥反應（inflammatory response）、免疫細胞轉運（immune cell trafficking）等。見圖6。

圖6 射麻口服液治療COVID-19 潛在靶點的疾病與生物功能熱圖

2.6 靶點通路分析

KEGG 富集分析得到169 條信號通路，主要涉及微生物感染、炎癥應答、氧化還原等生物過程。前20 條通路中共有14 條通路與免疫炎癥、病毒感染、細菌和寄生蟲感染相關，主要涉及白細胞介素-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、甲型流感（influenza A）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、肺結核（tuberculosis）等信號通路，此外還涉及缺氧誘導因子-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、凋亡通路（Apoptosis）及癌癥相關通路，見圖7（封三），其中綠色字體為免疫炎癥相關通路。

圖7 射麻口服液治療新型冠狀病毒肺炎的KEGG 通路富集氣泡圖

為了進一步探究射麻口服液的作用機制，將與免疫炎癥、病毒感染、細菌和寄生蟲感染相關的14 條信號通路和對應的40 個靶蛋白導入Cytoscape 構建靶點-信號通路作用網絡，見圖8（封四）。根據Degree 值調節(jié)靶蛋白的大小和顏色，面積越大、顏色越深的靶蛋白Degree 值越大，即在網絡中的作用越重要。如圖所示，篩選出TNF、IL-6、RELA、MAPK8、MAPK3、MAPK1、MAPK14、IL1B、CXCL8 等9 個主要靶蛋白，均參與調節(jié)10 條以上的信號通路，并且均與白細胞介素-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路和NOD 樣受體信號通路有關。而在PPI 網絡中，MAPK3、TNF、IL6、TP53、CASP3、MAPK8、IL10、CXCL8、PTGS2、MAPK1、CCL2、IL1B、MAPK14、IL4 是網絡中的核心靶點，兩組靶點映射，推測除了PTGS2、PTGS1、NOS2、DDP4、PIK3CG、CASP3、BCL2、MAPK14、RELA 外，射麻口服液還可能通過調節(jié)MAPK3、TNF、IL6、MAPK8、CXCL8、MAPK1、IL1B 等靶點發(fā)揮治療COVID-19 的作用。

3 討論

中醫(yī)藥防治瘟疫具有悠久的歷史，總結了大量的臨床用藥經驗。自COVID-19 疫情發(fā)生以來，中醫(yī)藥治療效果顯著。射麻口服液作為福建、北京等地區(qū)防治方案的推薦用藥，可用于治療以咳嗽、痰多稠黏、胸悶憋氣等為主要癥狀的COVID-19 疫毒襲肺證。本研究基于網絡藥理學探究射麻口服液治療COVID-19的作用機制。

通過構建藥物-成分-靶點-疾病作用網絡分析發(fā)現，槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素、豆甾醇、黃芩素等在網絡中的關聯度較高。已有研究表明，槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、黃芩素均能與SARS-CoV-2 3CL 水解酶和血管緊張素轉化酶Ⅱ較好地結合，其結合能力與治療COVID-19的臨床推薦用化學藥瑞德西韋、利托那韋等相近，甚至優(yōu)于化學藥[6-7]，說明這些化合物可能是射麻口服液治療COVID-19 的潛在物質基礎。有研究表明槲皮素可降低炎癥因子IL-6 和IL-1β 的釋放[8]，改善肺纖維化[9]。木犀草素具有較強的體外抑制流感病毒的活性[10]，并可減輕LPS 誘導的支氣管肺炎損傷[11]。山奈酚可防治甲型流感病毒誘導的肺內屏障功能障礙[12]，而黃芩素和漢黃芩素可改善甲型流感病毒誘導的急性肺損傷[13]。以上研究結果提示，射麻口服液的活性成分具有抗病毒、抗炎、保護肺臟的作用，其可能通過多種成分的協同作用改善COVID-19 引起的炎癥反應及肺損傷。

PPI 網絡分析及深入的靶點-通路網絡分析發(fā)現，MAPK3、TNF、IL-6、MAPK8、CXCL8、MAPK1、IL-1B等靶點可能是射麻口服液作用的核心靶點。當機體感染微生物或受到其他外界強烈刺激后，免疫系統(tǒng)被過度激活，從而引起多種細胞因子迅速大量產生而誘發(fā)細胞因子風暴，即炎癥風暴[14]。研究發(fā)現，COVID-19患者體內存在強烈的免疫反應和細胞因子風暴，失控的炎癥風暴是造成肺損傷及肺炎發(fā)生發(fā)展的重要原因[15]。而促炎性細胞因子IL-6 是引發(fā)炎癥風暴的關鍵炎癥因子之一，重癥患者體內IL-6 的水平明顯升高[16-17]?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案（試行第七版）》[18]已將IL-6 作為重型、危重型COVID-19 患者的臨床預警指標。本研究發(fā)現IL-6 可能是射麻口服液治療COVID-19 的潛在作用靶點，木犀草素、槲皮素、漢黃芩素等成分均可作用于IL-6，提示射麻口服液可能通過抑制IL-6 進而阻斷炎癥風暴，從而阻止患者向重型、危重型轉變。TNF、IL-1B 等炎癥因子均參與細胞因子風暴的發(fā)生發(fā)展，臨床報道COVID-19 患者體內TNF-α、IL-1B 的水平也顯著升高[15]，提示抑制TNF-α、IL-1B 等炎癥因子的釋放亦是阻斷炎癥風暴的有效手段。因此，射麻口服液可能通過調節(jié)IL-6、TNF-α 等細胞因子的釋放，影響炎癥風暴的發(fā)生發(fā)展，從而發(fā)揮治療COVID-19 的作用。

KEGG 富集分析得到169 條信號通路，主要涉及微生物感染、炎癥應答、氧化還原等生物過程。進一步分析發(fā)現，前20 條通路中，4 條通路與免疫炎癥相關，10 條通路與病毒感染、細菌和寄生蟲感染相關，說明射麻口服液在抗病毒感染、調節(jié)炎癥方面具有重要的作用，可能是其抗COVID-19 的原因。通過靶點-通路分析發(fā)現，核心靶點主要富集在IL-17、Toll 樣受體和NOD 樣受體信號通路。IL-17 對宿主的免疫反應至關重要[19]，膿毒癥誘導的急性肺損傷患者IL-17的含量明顯升高，阻斷IL-17 信號通路可以降低肺部炎癥反應改善肺損傷[20-21]。TNF 在維持細胞、組織和機體內環(huán)境平衡中起重要作用[22]，其中TNF-α 是急性病毒性疾病中關鍵的細胞因子，其可通過失控的炎癥反應加重冠狀病毒的致病性[14]，抑制TNF-α 信號，可緩解SARS 病毒感染小鼠的組織損傷[23]。在本研究中，TNF 信號通路與射麻口服液對應的IL-6、TNF、IL-1B等16 個靶蛋白相關。而Toll 樣受體信號通路在先天免疫應答和抗原特異性獲得免疫中發(fā)揮著重要作用，研究表明激活Toll 樣受體信號通路可以保護流感病毒的感染[24]。本研究結果顯示，IL-17、TNF 和Toll 樣受體信號通路是射麻口服液調節(jié)的重要免疫炎癥相關通路，涉及IL-6、TNF、MAPK8、CXCL8 等核心靶點，推測射麻口服液可能通過調節(jié)這些靶點進而調控IL-17、TNF、Toll 樣受體通路抑制免疫炎癥反應，進而改善SARS-CoV-2 感染引起的肺損傷。此外，COVID-19患者由于病毒感染引起的肺部炎癥容易導致機體血氧降低，嚴重則可引發(fā)低氧血癥[15]。當機體缺氧時HIF-1 被活化，介導缺氧代償性反應、血管新生、免疫反應等使機體更好地適應低氧環(huán)境[25]。有研究顯示HIF-1 信號通路在慢性阻塞性肺疾病患者中被激活，其可能是慢性阻塞性肺疾病治療的潛在靶點[26]。推測HIF-1 信號通路可能與COVID-19 患者的低氧血癥相關，射麻口服液可能通過調節(jié)HIF-1 信號通路減少缺氧對機體造成的損傷。由此可見，射麻口服液可能通過多種生物學通路，調節(jié)機體的免疫炎癥反應、缺氧損傷、細胞凋亡等病理過程，對抗病毒感染，起到治療COVID-19 的作用。

綜上，本研究運用網絡藥理學的研究方法初步探討了射麻口服液治療COVID-19 的作用機制，射麻口服液中的槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇等活性成分可能通過作用于IL-6、TNF、MAPK8、MAPK3、MAPK1、IL-1B 等靶點，進而調節(jié)IL-17、TNF、Toll 樣受體及HIF-1 信號通路等多條通路發(fā)揮抗病毒、抗炎、免疫調節(jié)、保護缺氧損傷等作用，治療COVID-19，體現了中藥多成分、多靶點、多途徑的整合調節(jié)作用。本研究為射麻口服液的臨床應用提供了科學依據，并為進一步的實驗研究奠定了基礎。