劉 琳，王偉佳，楊寓迪，康靖飛，王冬雪

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

血管性認(rèn)知障礙主要由腦缺血缺氧損害所引起，是致老年性癡呆的重大原因，且分類較多，按病因可分成：神經(jīng)病變性急性、腦血管病、代謝障礙疾病等，其發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病，是腦血管病后產(chǎn)生的進(jìn)行性智能障礙綜合征[1].現(xiàn)今相關(guān)研究愈來(lái)愈熱，其中大鼠模型是最為常見(jiàn)的，但其存在模型建立周期長(zhǎng)費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)[2].斑馬魚(yú)作為一種新型模式生物，以其胚胎和幼魚(yú)透明易觀察、個(gè)體小易于飼養(yǎng)、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、卵子體外受精和發(fā)育、對(duì)藥物敏感、適合高通量藥物的篩選等優(yōu)點(diǎn)，目前廣泛用于人類疾病的研究中，已成為疾病研究的最佳模式生物之一[3].目前建立血管性認(rèn)知障礙模型方法主要有2-VO法、3-VO法、低壓缺氧法、化學(xué)試劑法、急性重復(fù)缺氧法等[4].而現(xiàn)今對(duì)斑馬魚(yú)的缺氧癡呆模型探究較少，鑒于實(shí)驗(yàn)室前期成功建立阿爾茨海默癥模型基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)采用鼓泡法的方式摸索斑馬魚(yú)在不同條件下造成癡呆的程度，通過(guò)氮?dú)夤呐莘ń⑷毖跄Ｐ?，并檢測(cè)其T迷宮、社交行為、神經(jīng)生化指標(biāo)來(lái)探究其發(fā)病過(guò)程，這樣可以更加有效的了解人發(fā)病的情況，為實(shí)驗(yàn)室后續(xù)研究提供依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

野生型 AB 系成年斑馬魚(yú) 120條，購(gòu)自武漢國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心，野生健康紅色斑馬魚(yú) 20 條，購(gòu)自 ×× 花鳥(niǎo)魚(yú)市場(chǎng).所有斑馬魚(yú)均 6～8 月齡，體長(zhǎng) 2.5～3.5 cm，飼養(yǎng)于獨(dú)立的循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)，水溫恒定在 (28±0.5)℃，pH 值為 6.8～7.5，電導(dǎo)率為 450～550 μS/cm，光照/黑暗周期為 14h∶10h，每日定時(shí)喂食 2 次冰凍豐年蝦.將120條野生型 AB 系成年斑馬魚(yú)隨機(jī)分為對(duì)照組(n=60)、氮?dú)饽Ｐ徒M(n=60).

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備

酶標(biāo)分析儀(RAYTO公司)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司)，斑馬魚(yú) T 迷宮(View Point 公司)，斑馬魚(yú)社交箱(View Point 公司)，紅外線照明系統(tǒng) 50 cm(View Point 公司)，斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)(上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，凈化供水單元(RO 純水機(jī))(上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，筆試溶氧儀(上海亞榮生化儀器廠).

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

零氧試劑，總蛋白(TP)測(cè)定試劑盒，總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒，微量丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)，過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氮?dú)饽Ｐ?/p>

1)氮?dú)饽Ｐ徒?/p>

在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將高純氮?dú)庖源罅魉俪淙胙b有 500 mL純凈水的廣口瓶中，實(shí)時(shí)用溶氧儀檢測(cè)水中的溶氧量直至降到 0.5 mg/L 以下，達(dá)到斑馬魚(yú)缺氧環(huán)境.將模型組放入廣口瓶中，并繼續(xù)以200 mL/min 的流速向裝有模型組的廣口瓶中充入高純氮?dú)? min，計(jì)時(shí)結(jié)束后將氣管拿出并用保鮮膜密封放置，8 h 后再一次進(jìn)行氮?dú)馊毖?，每天相同時(shí)間點(diǎn)，每天 2 次，連續(xù)充 60 d.

2)氮?dú)饽Ｐ腿苎趿?/p>

溶氧含量是指水中氧氣的溶解量，斑馬魚(yú)是通過(guò)溶解在水中的氧氣呼吸生存的，溶氧量在水中生存的重要指標(biāo)之一.溶氧儀可以用來(lái)檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)被測(cè)樣品水溶液內(nèi)的溶氧含量，通過(guò)溶氧電極將產(chǎn)生氧化反應(yīng)，由此生成的擴(kuò)散電流和溶液中的氧呈一定關(guān)系的原理制作，用于測(cè)量水中氧氣含量，根據(jù)測(cè)量數(shù)據(jù)指標(biāo)可以更直觀有效的看到斑馬魚(yú)是否達(dá)到低氧、缺氧指標(biāo).因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用溶氧儀檢測(cè)每次氮?dú)夤呐輰?shí)驗(yàn)前后水中的溶氧含量，從而更直觀有效的觀察斑馬魚(yú)所處的環(huán)境是否達(dá)到低氧，缺氧的指標(biāo).

1.2.2 T迷宮行為學(xué)檢測(cè)

以實(shí)驗(yàn)室前期建立的T迷宮實(shí)驗(yàn)方法為標(biāo)準(zhǔn)[5]，于建立模型后的 30、45、60 d 進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè).1)適應(yīng)性訓(xùn)練：將整組斑馬魚(yú)放入 T 迷宮中自由活動(dòng)，不設(shè)置 EC 區(qū)，每組適應(yīng)1 h .2)實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)前向迷宮中注入斑馬魚(yú)養(yǎng)殖水直到短臂相比于其他位置水位高6 cm ，短臂的兩端分別用紅色、綠色卡紙包住，左臂用綠色卡紙包住后設(shè)置為目標(biāo)臂并在底部鋪滿白色砂石，臂中加入人工綠植.3)訓(xùn)練及測(cè)試期：每天早上 8∶00 在相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將 1 條斑馬魚(yú)放到通道起點(diǎn)處，觀察并記錄魚(yú)在6 min 內(nèi)從起點(diǎn)到第 1 次進(jìn)入 EC 區(qū)的潛伏期(當(dāng)魚(yú)找到并停留30 s 后才算進(jìn)入了 EC 區(qū))，并在 EC 區(qū)內(nèi)給予食物獎(jiǎng)賞.未找到 EC 區(qū)的魚(yú)，6 min 后引導(dǎo)其進(jìn)入 EC 區(qū)并停留30 s，同樣給予食物獎(jiǎng)勵(lì).每天魚(yú)都有一個(gè)對(duì)應(yīng)編號(hào)的獨(dú)立小魚(yú)缸，測(cè)試完后放回原組中.每天1次，每天訓(xùn)練 6 min ，連續(xù)訓(xùn)練 4 次，第 5 次為測(cè)試期.實(shí)驗(yàn)期間在夏天進(jìn)行，并保證T迷宮未受室內(nèi)光源光照的影響，周?chē)獠凯h(huán)境安靜.

1.2.3 社交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

于建立模型后 30、45、60 d 測(cè)試斑馬魚(yú)社交行為[6]，全程在社交箱中進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1 h將整組斑馬魚(yú)分別在獨(dú)立小魚(yú)缸進(jìn)行被測(cè)魚(yú)單獨(dú)隔離，避免實(shí)驗(yàn)時(shí)激發(fā)出更多社交行為.社交行為箱中注入養(yǎng)殖水直至水位在8 cm，隔離完畢后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)，將社交魚(yú)(野生紅色斑馬魚(yú))放入社交箱后，再取模型組中1條被測(cè)魚(yú)放入，讓2條魚(yú)適應(yīng)并進(jìn)行社交，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為7 min ，前5 min 適應(yīng)熟悉并記錄后2 min 的接觸時(shí)間及次數(shù)，被測(cè)魚(yú)追逐社交魚(yú)時(shí)接觸記為追逐、社交魚(yú)追逐被測(cè)魚(yú)時(shí)接觸記為被追逐、2條魚(yú)互相交流接觸時(shí)記為互相，為避免社交魚(yú)出現(xiàn)社交疲乏狀態(tài)，同1條社交魚(yú)跟3條被測(cè)魚(yú)進(jìn)行社交行為測(cè)試，也可保證其實(shí)驗(yàn)的隨機(jī)性，測(cè)試后放回原組中，每天1次，連續(xù)4次.實(shí)驗(yàn)期間確保實(shí)驗(yàn)室內(nèi)燈光、物品等空間參照物位置擺放不變，其他實(shí)驗(yàn)人員不得發(fā)出噪聲及進(jìn)行走動(dòng).

1.2.4 神經(jīng)生化指標(biāo)檢測(cè)

1)樣品采集處理

模型建立后 60 d ，將對(duì)照組氮?dú)饨M進(jìn)行樣品采集.將魚(yú)置于冰上，待魚(yú)麻醉后快速取腦，準(zhǔn)確稱重，按照質(zhì)量(g)：體積(mL)=1∶9的比例制備10%勻漿，采用低溫高速離心機(jī)在2 500 r/min 離心10 min，取上清液用于生化指標(biāo)的檢測(cè).

2)檢測(cè)指標(biāo)

按照總蛋白(TP)測(cè)定試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒、微量丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒并按照說(shuō)明說(shuō)同比例稀釋后測(cè)定.

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 氮?dú)饽Ｐ腿苎趿繖z測(cè)

采用溶氧儀分別在氮?dú)夤呐輰?shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行連續(xù)60 d 監(jiān)測(cè).在氮?dú)夤呐莺蟮娜苎趿坑幸欢ú▌?dòng)，數(shù)據(jù)顯示明顯比實(shí)驗(yàn)前低，并且較穩(wěn)定的保持在低氧狀態(tài)下，見(jiàn)圖1.

圖1 60 d 內(nèi)溶氧量變化

2.2 氮?dú)饽Ｐ蚑迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

T迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，氮?dú)饨M 45、60 d 均出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)；與30 d相比，對(duì)照組在60 d出現(xiàn)非常顯著性差異(P<0.01)，氮?dú)饨M在45 d為時(shí)間轉(zhuǎn)折點(diǎn)出現(xiàn)非常顯著性差異直至60 d(P<0.01).

圖2 30、45、60d氮?dú)饨M測(cè)試期結(jié)果

2.3 社交接觸時(shí)間

30 d社交接觸時(shí)間結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，氮?dú)饨M追逐時(shí)間有顯著性下降(P<0.01)、互相交流時(shí)間在第 2 次和第 4 次出現(xiàn)非常顯著性下降(P<0.01)；45 d社交接觸時(shí)間結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，氮?dú)饨M追逐時(shí)間非常顯著性下降(P<0.01)；60 d社交時(shí)間結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，氮?dú)饨M并無(wú)追逐接觸出現(xiàn)顯著性下降(P<0.01)、被追逐時(shí)間在第 3 次、第 4 次出現(xiàn)顯著性上升(P<0.01).見(jiàn)表1～3.

表1 30d 斑馬魚(yú)社交接觸時(shí)間

表2 45 d 斑馬魚(yú)社交接觸時(shí)間

表3 60 d 斑馬魚(yú)社交接觸時(shí)間

2.4 社交接觸次數(shù)結(jié)果

30d 社交接觸次數(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，氮?dú)饨M追逐次數(shù)顯著性下降(P<0.05)、互相交流時(shí)間在第 4 次出現(xiàn)非常顯著性下降(P<0.01)；45d 社交接觸次數(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，氮?dú)饨M追逐次數(shù)非常顯著性下降(P<0.01)；60d 社交接觸次數(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，氮?dú)饨M并無(wú)追逐接觸出現(xiàn)非常顯著性下降(P<0.01)，見(jiàn)表4～6.

表4 30 d 斑馬魚(yú)社交接觸次數(shù)次)

表5 45 d 斑馬魚(yú)社交接觸次數(shù)次)

表6 60 d斑馬魚(yú)社交接觸次數(shù)次)

2.5 含SOD、MDA量檢測(cè)結(jié)果

SOD活力是通過(guò)測(cè)定 SOD 抑制率得到，與對(duì)照組相比，氮?dú)饨M有顯著性下降(P<0.05)；含MDA 量測(cè)定通過(guò)與硫代巴比妥酸縮合，與對(duì)照組相比，氮?dú)饨M有顯著升高(P<0.05)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3.

與對(duì)照組相比，*P<0.05 顯著性差異

3 討 論

斑馬魚(yú)是一種小型熱帶淡水硬骨魚(yú)，具有體型小、易于飼養(yǎng)、管理且實(shí)驗(yàn)成本低、樣本小，可進(jìn)行體外受精和培養(yǎng)，胚胎透明，易于觀察，繁殖周期短，且一次有較大的產(chǎn)卵數(shù)量等特點(diǎn)[7-8].斑馬魚(yú)作為新型模式動(dòng)物，其篩選周期短，也是較其他生物、化學(xué)模型和體外細(xì)胞模型具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)[9-10].近年來(lái)在各類研究領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[11].目前，斑馬魚(yú)已被廣泛地用于藥理學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、海洋生物學(xué)、藥物學(xué)、毒理與環(huán)保等諸多方面的研究，一些重要的成果不斷涌現(xiàn)，為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)生命科學(xué)的發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)[12].T迷宮實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成為現(xiàn)今實(shí)驗(yàn)室最經(jīng)典、最常用評(píng)價(jià)斑馬魚(yú)學(xué)習(xí)記憶能力的檢測(cè)手段，可以檢測(cè)其斑馬魚(yú)學(xué)習(xí)及記憶能力，能提供較多的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)和參考[13].

本研究采用氮?dú)夤呐莘ń⒌獨(dú)馊毖跄Ｐ?，氮?dú)饽Ｐ土魉倏梢院芎玫哪M貼近人缺氧發(fā)病的過(guò)程，但是也有一定的缺點(diǎn)對(duì)于氮?dú)饬魉俚目刂戚^難把控，也是建立此模型的難點(diǎn).通過(guò)T迷宮、社交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力與社交實(shí)驗(yàn)?zāi)芰υ?0 d時(shí)出現(xiàn)認(rèn)知障礙并持續(xù)至60 d，隨時(shí)間加重也并未出現(xiàn)反復(fù).SOD能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，活性的高低反映了機(jī)體抗氧化能力大小，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶[14]，MDA是生物脂質(zhì)氧化的天然產(chǎn)物之一，含MDA量反映了機(jī)體細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度的嚴(yán)重[15].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示斑馬魚(yú)腦內(nèi)SOD活力降低，升高M(jìn)DA活力引起腦內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化.因此模型組斑馬魚(yú)SOD活力降低，MDA活力升高所引起的腦內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，有可能是造成斑馬魚(yú)血管認(rèn)知障礙的原因之一.

綜上所述，氮?dú)夤呐莘梢宰鳛橐环N行之有效的造模方法來(lái)建立斑馬魚(yú)的血管認(rèn)知障礙模型.使用該方法，能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)室后續(xù)對(duì)相關(guān)疾病的研究提供全新的選擇，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供重要的理論參考，由于模型處于建立初期，模型的形成原因還有待發(fā)掘，因此該模型依然有著巨大的改良空間.