徐登峰 ，張素輝 ，余遠(yuǎn)迪 ，許國洋 ，趙揚(yáng)揚(yáng) ，付利芝 ，沈克飛

1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶402460；2.重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，重慶402460

近年，三峽庫區(qū)山羊體表和臟器發(fā)生膿腫現(xiàn)象較為普遍，一定程度上影響了該地區(qū)的養(yǎng)羊經(jīng)濟(jì)效益。山羊體表和臟器膿腫一般由多種化膿菌混合感染引起，其中對山羊危害嚴(yán)重的是化膿性肺炎等感染，該病在國內(nèi)多地流行，化膿隱秘桿菌（Trueperella pyogenes）是其病原菌之一［1-4］?；撾[秘桿菌是一種動物黏膜的共生菌，通常寄生于呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，是牛羊多種動物的一種條件性致病菌，可經(jīng)皮膚、黏膜破損處入侵而引起體表、組織、器官的膿腫［3-4］。

化膿隱秘桿菌感染導(dǎo)致山羊呼吸道疾病引起的危害正逐漸引起重視，該病常演變成慢性消耗性疾病，且為混合感染，臨床診斷困難［5］。早發(fā)現(xiàn)是防控化膿隱秘桿菌感染的重要環(huán)節(jié)，因此簡便、準(zhǔn)確的診斷方法尤為重要。目前，檢測和診斷化膿隱秘桿菌感染的方法主要有病原菌分離培養(yǎng)和核酸檢測等［5］，這些方法適用于體表感染和病危被剖檢的動物，不適用于還有經(jīng)濟(jì)價值的臟器感染動物。間接ELISA 法可用于后者的檢測和診斷，但目前尚無針對檢測山羊化膿隱秘桿菌抗體的間接ELISA 法。溶血素（pyolysin，PLO）是化膿隱秘桿菌分離株分泌的唯一外毒素，是其一種重要的抗原，可作為血清學(xué)診斷用抗原［6-7］。本實(shí)驗(yàn)采用E.coli 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組溶血素（recombinant pyolysin，rPLO）的 37 ～ 281 位氨基酸，并建立化膿隱秘桿菌感染的間接ELISA 檢測法，以期用于山羊化膿隱秘桿菌感染的快速診斷。

1 材料與方法

1.1 菌株 含pET-28a-plo 的重組菌株E.coli BL21（DE3）由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)獸藥研究所保存及提供。

1.2 血清 E.coli、鏈球菌和偽結(jié)核棒狀桿菌陽性血清、化膿隱秘桿菌陽性山羊抗血清及化膿隱秘桿菌陰性山羊血清（30 份）由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)獸藥研究所保存及提供；15 份化膿隱秘桿菌自然感染的山羊血清（經(jīng)細(xì)菌分離鑒定［1］和 PCR 法［5］確診）、360 份無明顯呼吸道疾病臨床癥狀的山羊血清樣本采自重慶地區(qū)山羊養(yǎng)殖場，由該研究所保存。

1.3 主要試劑及儀器 IPTG 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；Ni-NTA 填料購自美國GE 公司；堿性磷酸酶標(biāo)記的驢抗山羊IgG 購自美國Abcam公司；BCTP ／ NBT 購自生工生物工程（上海）股份有限公司；HRP 標(biāo)記的兔抗山羊IgG 購自美國Earthx公司；咪唑購自成都市科隆化學(xué)品有限公司；96 孔板購自美國Costar 公司。

1.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將含pET-28a-plo 的重組菌株 E.coli BL21（DE3）接種至 LB 培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r ／ min 振搖培養(yǎng)至 A600約 0.6 時，加入終濃度0.1 mmol ／ L 的 IPTG，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá) 3 h，5 000 × g離心10 min，收集菌體。菌體用Tris-HCl（pH 8.0）重懸，冰水浴中超聲裂解菌體（超聲功率為300 W，工作4 s，間歇5 s，超聲裂解15 min）。取1 mL 菌體裂解液，12 000 × g 離心1 min，分別取上清和沉淀，經(jīng)12% SDS-PAGE 分離蛋白后，轉(zhuǎn)移至NC 膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h；TBST 洗滌3 次，加入山羊化膿隱秘桿菌抗血清（1 ∶100 稀釋），37 ℃孵育 1 h；TBST 洗滌3 次，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的驢抗山羊IgG（1 ∶1 500 稀釋），37 ℃孵育 1 h；TBST 洗滌 3 次，置 BCTP ／ NBT 中顯色。

1.5 重組蛋白的純化 將誘導(dǎo)表達(dá)菌液經(jīng)12000 × g 離心10 min，裂解（同1.4 項(xiàng)）后收集沉淀，用0.05 mol／L Tris-HCl（0.5 mol ／ L NaCl、0.01 mol ／ L EDTA 和2% Triton X-100，pH 8.0）洗滌 1 次，加入 8 mol ／ L尿素溶解包含體；12 000 × g 離心 10 min，收集上清，經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾，上樣 Ni-NTA 層析柱，用0.02 mol／L Tris-HCl（20 mmol／L 咪唑，0.5 mol／L NaCl，8 mol ／ L 尿素，pH 8.0）洗去雜蛋白，用 0.02 mol ／ L的Tris-HCl（150 mmol ／ L 咪唑，0.5 mol ／ L NaCl，8 mol ／ L 尿素，pH 8.0）洗脫。純化產(chǎn)物進(jìn)行 12%SDS-PAGE 分析。

1.6 方法的建立及優(yōu)化 用純化的rPLO 包被96孔板，4 ℃包被過夜；2%明膠封閉液于37 ℃封閉2 h；加入待檢血清（1 ∶100 稀釋），37 ℃反應(yīng) 30 min；用PBST 洗滌3 次，加入HRP 標(biāo)記的兔抗山羊IgG，37 ℃反應(yīng)60 min；四甲基聯(lián)苯胺顯色10 min，用酶標(biāo)儀測定A450值。采用方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度（3.5、0.7、0.14 和 0.05 μg ／ mL）及最佳二抗稀釋度（1 ∶10 000、1 ∶20 000、1 ∶40 000）。每種條件分別檢測3 份陽性血清和3 份陰性血清，以陽性血清A450值 ＞1，且陽性血清A450均值與陰性血清A450均值比值（P／N 值）最大的反應(yīng)條件為最佳。

1.7 臨界值的確定 采用優(yōu)化的間接ELISA 法檢測30 份已知化膿隱秘桿菌陰性血清，計(jì)算陰性血清 A450的平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），根據(jù) X + 3 SD值確定臨界值，樣本的A450＞X + 3 SD 時判為陽性，A450≤ X + 3 SD 時判為陰性［8］。

1.8 方法的驗(yàn)證

1.8.1 特異性 用優(yōu)化的間接ELISA 法檢測E.coli、鏈球菌和偽結(jié)核棒狀桿菌陽性血清，并設(shè)山羊化膿隱秘桿菌陽性血清和陰性血清對照，每份樣本設(shè)3 個重復(fù)。

1.8.2 靈敏性 將3 份化膿隱秘桿菌陽性血清進(jìn)行倍比稀釋（1 ∶100 ～ 1 ∶1 600），用優(yōu)化的間接 ELISA法進(jìn)行檢測，并設(shè)山羊化膿隱秘桿菌陰性血清對照。

1.8.3 精密性 以同批表達(dá)純化的rPLO 包被96孔板，檢測化膿隱秘桿菌陽性、陰性血清各3 份，每份血清設(shè)3 個重復(fù)，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)（CV）。以不同批表達(dá)純化的rPLO 分別包被3 批96 孔板，檢測陽性、陰性血清各3 份，每份血清做3 個重復(fù)，計(jì)算批間CV。批內(nèi)和批間CV 均應(yīng)＜10%。

1.9 方法的初步應(yīng)用 分別采用瓊脂糖凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)和優(yōu)化的間接ELISA 法檢測15 份化膿隱秘桿菌自然感染的山羊血清，計(jì)算兩者的符合率。同時采用優(yōu)化的間接ELISA 法檢測360 份臨床山羊血清樣本，以了解重慶地區(qū)山羊化膿隱秘桿菌的基本流行情況。

2 結(jié) 果

2.1 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)重組菌培養(yǎng)物的裂解液沉淀于相對分子質(zhì)量約34 000 處可見目的蛋白條帶，大小與預(yù)期相符，裂解產(chǎn)物上清未見明顯條帶，見圖1；且產(chǎn)物與山羊化膿隱秘桿菌抗血清可發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，于相對分子質(zhì)量約34 000處可見特異性結(jié)合條帶，裂解產(chǎn)物上清未見明顯條帶，見圖2。表明rPLO 以包涵體形式表達(dá)。

2.2 純化產(chǎn)物的鑒定 純化產(chǎn)物于相對分子質(zhì)量約34 000 處可見目的蛋白條帶，大小與預(yù)期相符，純度達(dá)90%，見圖3。

2.3 間接ELISA 法的最佳反應(yīng)條件 抗原包被濃度為 0.14 μg ／mL，二抗稀釋度為 1 ∶40 000 時，P ／ N值）最大，見表1。因此確定該條件為間接ELISA 法的最佳反應(yīng)條件。

2.4 臨界值 山羊化膿隱秘桿菌30 份陰性血清A450的 X 為 0.305，SD 為 0.056，X + 3 SD ＝ 0.305 +3 × 0.056 = 0.473，即當(dāng)樣本 A450＞ 0.473 時判為陽性，A450≤0.473 時判為陰性。

圖1 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE profile of expressed product

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot 分析Fig.2 Western blotting of expressed product

圖3 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE profile of purified product

2.5 方法的驗(yàn)證

2.5.1 特異性 E.coli、鏈球菌、偽結(jié)核棒狀桿菌陽性血清、化膿隱秘桿菌陰、陽性血清A450分別為0.249±0.071、0.222 ± 0.065、0.213 ± 0.019、0.214 ± 0.020和1.273±0.027。除化膿隱秘桿菌陽性血清外，其他A450均＜0.473，判為陰性；化膿隱秘桿菌陰、陽性血清A450均符合陰、陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。表明該方法特異性良好。

2.5.2 靈敏性 當(dāng)化膿隱秘桿菌陽性血清稀釋至1 ∶800 時，3 份陽性血清 A450仍高于臨界值，檢測為陽性，見表2。表明該方法靈敏性良好。

表1 間接ELISA 法抗原包被濃度及二抗稀釋度的優(yōu)化Tab.1 Optimization of concentration of antigen coating and dilution of secondary antibody in indirect ELISA

2.5.3 精密性 化膿隱秘桿菌陽性、陰性血清檢測結(jié)果的批內(nèi)CV 均值分別為6.33%和3.73%，批間CV均值分別為5.90%和4.57%，均 ＜10%，見表3 和表4。表明該方法具有良好的精密性。

2.6 方法的初步應(yīng)用 兩種方法檢測化膿隱秘桿菌自然感染的15 份山羊血清，陽性檢出率均為100%，符合率100%，但瓊脂糖擴(kuò)散試驗(yàn)的檢測靈敏度較低，僅有4 份血清在1 ∶2 稀釋時可見沉淀線，見圖4，其他11 份血清在不稀釋的情況下可見沉淀線（圖略）。表明優(yōu)化的間接ELISA 方法可用于臨床樣品檢測。采用優(yōu)化方法檢測360 份山羊血清的陽性率為24.1%（87／360），初步得出重慶地區(qū)山羊化膿隱秘桿菌感染率較高。

圖4 瓊脂糖凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)Fig.4 Agarose gel diffusion test

表2 靈敏性試驗(yàn)結(jié)果（A450，±s，n = 3）Tab.2 Result of sensitivity test（A450，±s，n = 3）

表2 靈敏性試驗(yàn)結(jié)果（A450，±s，n = 3）Tab.2 Result of sensitivity test（A450，±s，n = 3）

樣品樣品血清稀釋倍數(shù)1 ∶100 1 ∶200 1 ∶400 1 ∶800 1 ∶1 600第 1 份 1.485 ± 0.158 1.012 ± 0.117 0.778 ± 0.080 0.517 ± 0.061 0.361 ± 0.038第 2 份 1.770 ± 0.179 1.242 ± 0.137 0.885 ± 0.086 0.647 ± 0.065 0.401 ± 0.047第 3 份 1.196 ± 0.128 0.934 ± 0.117 0.728 ± 0.080 0.485 ± 0.050 0.339 ± 0.044

表3 批內(nèi)精密性試驗(yàn)結(jié)果（A450）Tab.3 Intra-assay of precision（A450）

表4 批內(nèi)精密性試驗(yàn)結(jié)果（A450）Tab.4 Intra-assay of precision（A450）

3 討 論

PLO 是化膿隱秘桿菌主要的毒力因子之一，其作用機(jī)理可能與細(xì)菌感染過程獲取宿主體內(nèi)的鐵有關(guān)［9］。plo 基因存在于不同動物源化膿隱秘桿菌分離株中，且高度保守，因此成為各種化膿隱秘桿菌基因檢測方法的首選靶基因［5］。PLO 序列中的前半部分存在B 細(xì)胞表位［10］，感染或免疫能刺激機(jī)體產(chǎn)生 PLO 特異性抗體［6］。

本研究以純化的rPLO 作為包被抗原，HRP 標(biāo)記的兔抗山羊IgG 抗體作為二抗，采用方陣滴定法對ELISA 反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定抗原包被濃度為 0.14 μg ／ mL，二抗稀釋度為 1 ∶40 000 時為最佳反應(yīng)條件。利用已知的化膿隱秘桿菌陰性血清確定了陰陽性臨界值，當(dāng)樣本A450＞0.473 時判為陽性，A450≤0.473 時判為陰性。在此基礎(chǔ)上，對方法的特異性、靈敏性和精密性進(jìn)行評估。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)化的間接ELISA 法對E.coli、鏈球菌和偽結(jié)核棒狀桿菌陽性血清無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。靈敏性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法能檢測到800 倍稀釋的陽性血清，靈敏性良好。在批內(nèi)、批間精密性試驗(yàn)中，CV 均＜10%，表明方法具有良好的精密性。對15 份陽性血清的檢測結(jié)果顯示，間接ELISA 方法和瓊脂糖凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)的陽性檢出符合率為100%，表明該方法可用于臨床樣品檢測。利用所建立的間接ELISA 方法檢測采自重慶地區(qū)的無明顯呼吸道疾病臨床癥狀的山羊血清樣本，陽性率為24.1%，表明化膿隱秘桿菌在重慶山羊中感染率較高，應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步防控。通過Western blot 技術(shù)證實(shí)，PLO 的抗原關(guān)鍵表位區(qū)域是第64 ～79 位氨基酸（即 VPVTKDQLKDGTYTVF）和第 58 ～ 75 位氨基酸（即 GESIENVPVTKDQLKDGT）［11-12］。本研究表達(dá)了除信號肽部分的前271 位氨基酸殘基的PLO 蛋白，結(jié)果顯示，rPLO 能被山羊化膿隱秘桿菌免疫的山羊抗血清識別，可用于建立化膿隱秘桿菌血清學(xué)檢測試劑盒。