王龍，樊婕，魏暢，李鴿子，張靜靜，焦秋娟，陳果，孫孌姿，柳海濤*

（1.河南農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，河南 鄭州450002；2.河南農業(yè)大學農學院，河南 鄭州450046；3.成都理工大學生態(tài)環(huán)境學院，四川 成都610059；4.西北農林科技大學草業(yè)與草原學院，陜西 咸陽712100）

隨著現(xiàn)代冶金業(yè)和農業(yè)生產(chǎn)的不斷發(fā)展，含銅（Cu）殺蟲劑和除草劑的大量使用以及工業(yè)“三廢”的隨意傾倒，使得土壤與水體中積累了相當數(shù)量的Cu元素，其中很大一部分受污染的土壤是農田，對農業(yè)的安全生產(chǎn)造成嚴重影響。農田土壤中積累過多的Cu不僅會降低農作物的產(chǎn)量及品質，還會通過食物鏈向高營養(yǎng)級的生物體傳遞，最終威脅人體健康［1］。根據(jù)2014年發(fā)布的《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，我國土壤總的點位超標率為16.1%，其中Cu污染點位超標率占2.1%，位居第4［2］，因此，農田土壤的Cu污染問題已成為目前不可忽視的環(huán)境問題之一。Cu作為植物生長發(fā)育所必需的微量元素之一，參與植物體內多種生理生化反應以及多種代謝過程［3］，對植物生長發(fā)育起著重要作用。然而，當植物體積累的Cu超過一定閾值時則表現(xiàn)為毒害作用［4］，如降低光合作用、干擾細胞正常的代謝、生長發(fā)育受抑制等。研究表明，Cu對植物的抑制作用一方面是通過抑制其他礦質離子的吸收，表現(xiàn)為“缺素”反應［5］；另一方面，通過取代酶或蛋白質的活性中心，使其活性降低或變性，引發(fā)代謝紊亂［6］。

植物修復具有成本低、修復面積大、環(huán)境友好的特點，是目前土壤污染修復中常用的一種方法［7-8］。牧草作為常用的土壤修復植物，因其具有易于栽培、生長速度快、生物量大、重金屬吸收量多等優(yōu)點而受到研究人員的廣泛青睞。迄今為止，常見用于土壤重金屬污染修復的牧草有10余種，如黑麥草（Lolium perenne）、苜蓿（Medicago sativa）、菊苣（Cichorium intybus）等［7］。其中，菊苣作為一種多年生草本植物，具有適應性廣、抗逆性強、再生快、營養(yǎng)豐富、適口性好、產(chǎn)草量高等優(yōu)良特性，被作為高檔蔬菜和優(yōu)質牧草栽培利用［9-10］；同時，研究發(fā)現(xiàn)菊苣根提取物具有較強的抗氧化性［11-12］，并且對重金屬具有較高的吸收能力，是一種具有重要經(jīng)濟價值和開發(fā)潛力的新興作物［13-14］。研究表明，在外界無脅迫情況下，植物自身能夠產(chǎn)生較低水平的活性氧（reactive oxygen species，ROS），不會對植物體造成損傷，當受到外界Cu脅迫時，植物體內細胞的穩(wěn)態(tài)水平被破壞，細胞中積累過量的ROS，對植物體造成氧化損傷，如破壞細胞膜結構和光合系統(tǒng)［15-16］。為了抵御外界Cu脅迫，植物體會啟動自身的抗氧化防御系統(tǒng)（包括酶類抗氧化系統(tǒng)和非酶類抗氧化系統(tǒng)）清除過多的ROS，以維持細胞的正常功能。

抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）作為植物體內一種重要的小分子非酶抗氧化物，通過對外界刺激的識別、信號傳遞、基因表達和代謝調節(jié)等一系列過程激發(fā)植物自身的防御機制，清除體內過多的ROS，緩解環(huán)境脅迫對植物的毒害作用。還有研究表明，AsA具有促進植物生長發(fā)育和增產(chǎn)的作用［17-18］。近年來，利用外源AsA提高植物抵御外界脅迫方面有了一定的研究和應用，如減輕Al3+脅迫對水稻（Oryza sativa）幼苗的氧化損傷［19-20］，緩解蠶豆（Vicia faba）根尖細胞由于Pb2+、Hg2+脅迫而引起的遺傳毒性效應［21］，增加燕麥（Avena sativa）幼苗對鹽脅迫的抗性［22］，提高鹽脅迫小麥（Triticum aestivum）的光合作用特征參數(shù)等［23］。

修復被重金屬污染的土壤一直是國內外研究的熱點。目前對于菊苣用于重金屬修復的研究大多是關于鎘（Cd）污染，對于Cu污染的研究相對較少，除此之外，關于重金屬脅迫對菊苣生長發(fā)育的影響研究多數(shù)集中在種子萌發(fā)階段，對于幼苗生長階段的研究還很缺乏，尤其對于外源AsA增強菊苣抗Cu性能的生理響應機制尚不明確。因此，本研究以普那菊苣為試驗材料，采用營養(yǎng)液培養(yǎng)法研究外源AsA對Cu脅迫菊苣幼苗生長特征、細胞膜穩(wěn)定性及光合效率和抗氧化酶活性的影響，闡明外源AsA對銅脅迫菊苣幼苗的緩解效應，為AsA應用于緩解植物Cu毒害及豐富菊苣耐Cu機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 幼苗培養(yǎng)與處理

本試驗選用的品種為普那菊苣（C.intybuscv.Puna）。育苗前，挑選顆粒飽滿、均勻一致的種子，用5%的過氧化氫溶液浸泡15 min，隨后用去離子水反復沖洗干凈，并用吸水紙吸干種子表面的水分，將其均勻灑在鋪有少量濕潤細沙的培養(yǎng)皿中，放入植物光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待種子長出兩葉一心后，選取長勢一致的幼苗用海綿固定移栽到體積為2 L的水培盆（長34 cm、寬25 cm、高12 cm）中繼續(xù)培養(yǎng)。為防止燒苗，移栽后先用1/8 Hoagland營養(yǎng)液進行培養(yǎng)，待幼苗適應后，改1/4 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，依次逐漸增加至完全濃度的營養(yǎng)液，每3 d更換一次培養(yǎng)液，減少營養(yǎng)元素的損失對試驗造成的誤差，水培幼苗生長至四葉一心時，開始進行處理。

設置兩因素兩水平（Cu：0和50μmol·L-1；AsA：0和200μmol·L-1）的水培試驗，共設置4個處理：0μmol·L-1Cu+0μmol·L-1AsA（即對照組，只添加營養(yǎng)液）、50μmol·L-1Cu+0μmol·L-1AsA、0μmol·L-1Cu+200μmol·L-1AsA、50μmol·L-1Cu+200μmol·L-1AsA，分別記作CK、Cu50、AsA200、Cu50+AsA200，該試驗濃度是依據(jù)李賀勤等［24］和Sharma等［25］的研究結果以及本試驗前期的預試驗進行綜合選擇。其中Cu供體以CuCl2·2H2O的形式添加入營養(yǎng)液中，AsA的供體以L-抗壞血酸的形式加入營養(yǎng)液中，對于復合處理，Cu溶液與AsA溶液同時加入營養(yǎng)液中。每個處理設5次重復。培養(yǎng)期間，每3 d更換一次處理液，并用0.1 mol·L-1HCl和0.1 mol·L-1NaOH調節(jié)pH值為6.5［26］，每次更換處理液時隨機移動培養(yǎng)盆的位置，以保證外界條件的一致性。所有試驗均在模擬自然狀態(tài)的人工氣候室內進行，白天（25±2）℃，光照16 h，光照強度400μmol·m-2·s-1；夜間（20±2）℃，8 h黑暗，濕度控制在60%左右。

處理2周（14 d）后進行采樣，此時幼苗出現(xiàn)明顯銅毒害癥狀。在采樣前先利用便攜式光合儀（LI-6400，美國）測定植株的光合速率、蒸騰作用等氣體交換參數(shù)；隨后，將植株根系和地上部分離，將根系浸泡于20 mmol·L-1的Na2-EDTA溶液中15 min，然后用去離子水清洗，去掉根系表面殘留的Cu2+；地上部分直接用去離子水清洗，用吸水紙吸干表面水分，一部分鮮樣裝入牛皮紙袋中，置于烘箱中105℃殺青20 min，再于75℃下烘至恒重，用于測定根系與地上部的生物量；另一部分鮮樣進行液氮處理并于超低溫冰箱-80℃保存，用于各種抗氧化酶活性、滲透調節(jié)物質等生理生化指標的測量。

1.2 生理生化指標測定

采用便攜式光合儀（LI-6400，美國）進行葉片氣體參數(shù)的測定，測定時使用開放氣路，溫度控制在25℃，光照強度控制在1000μmol·m-2·s-1。測量指標包括光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、氣孔導度（stomatal conductance，Gs）、胞間CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci）、蒸騰速率（transpiration rate，Tr）。采用乙醇提取法測定葉綠素含量［27］；采用考馬斯亮藍染料結合比色法測定可溶性蛋白含量［28］；參照Chen等［29］的方法測定內源AsA含量。采用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量［30-31］；采用氮藍四唑（NBT）還原法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性［31］；采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性［31］；參照Aebi［32］的方法測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性；參照Nakano等［33］的方法測定抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性。

1.3 Cu含量的測定

將0.25 g烘干后的樣品與10 mL混酸（高氯酸∶硝酸=1∶3，v/v）搖勻后過夜，用電熱板加熱消煮，待溶液顏色澄清透明后，用去離子水趕酸至體積為1 mL左右，隨后用去離子水定容到25 mL，待測。用原子吸收光譜儀-石墨爐法（AAS，ZEEnit 700，Analytikjena，德國）測定Cu含量［25］，每次測定有3個讀數(shù)值，取其平均值作為最終結果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用IBM SPSS statistics 22.0進行方差分析（ANOVA）。用最小顯著極差法進行多重比較（LSD，P＜0.05），分析結果以平均數(shù)±標準差表示，并用Origin 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗生物量和耐受指數(shù)的影響

與對照組（CK）相比，Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉的長度均顯著降低（P＜0.05），分別降低了29.32%和38.27%（表1）；從植株的干物質積累量可以看出，與CK相比，Cu脅迫下根系和莖葉分別降低了44.44%和45.36%，說明Cu脅迫對菊苣幼苗的根系和莖葉均呈不同程度的抑制作用，Cu脅迫下幼苗的側根變少、根長變短、葉片的顏色較淺、植株生長明顯受抑制。與幼苗根系相比，莖葉的耐受指數(shù)更低，說明莖葉對Cu脅迫的變化更敏感。

外源AsA的添加也降低了菊苣幼苗根系和莖葉的生長，均未達到顯著水平，說明AsA200處理對菊苣幼苗植株的生長能夠產(chǎn)生抑制作用，并且對莖葉的抑制程度要高于根系。當Cu和AsA同時添加時，與單一的Cu脅迫組相比，菊苣幼苗根系和莖葉的長度和生物量均增加，并且未達到顯著水平，但仍低于單一的AsA處理。耐受指數(shù)能夠反映植株在逆境環(huán)境中生長的抑制程度［24］，從耐受指數(shù)上可以看出（表1），Cu和AsA同時存在時對根系和莖葉的抑制率分別為27.78%和29.90%（與CK相比），介于單一的Cu處理（44.44%和45.36%）和AsA處理（11.11%和20.62%）之間。這些結果說明外源AsA對Cu脅迫下的菊苣幼苗有一定的緩解作用。

表1 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗生物量和耐受指數(shù)的影響Table 1 Effect of exogenous AsA on the biomass and tolerance index of chicory seedling under Cu stress

2.2 外源AsA對Cu脅迫菊苣幼苗葉片光合參數(shù)和葉綠素含量的影響

光合作用是植物進行有機物合成的主要途徑，植物的光合作用在受到逆境脅迫時會受到阻礙（表2）。與CK相比，Cu脅迫下菊苣幼苗葉片凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度及蒸騰速率分別降低了49.37%、70.00%、37.13%和49.42%（P＜0.05），說明Cu脅迫下菊苣幼苗葉片的光合作用受到抑制。與Cu脅迫相比，外源AsA的添加能夠不同程度地提高Cu脅迫下菊苣幼苗葉片的Pn、Gs、Ci、Tr參數(shù)，分別提高了43.93%、66.67%、24.28%、68.00%。該結果也說明外源AsA處理能夠有效緩解Cu脅迫對菊苣幼苗葉片光合作用的抑制。

葉片光合色素含量是反映外界脅迫程度的重要指標之一。與CK相比，Cu脅迫下葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素及類胡蘿卜素的含量均顯著降低（P＜0.05），分別下降了41.94%、26.48%、34.09%、31.38%。外源AsA添加后，光合色素含量較Cu脅迫組均有所升高，其中葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素達顯著水平，分別比Cu脅迫下增加了63.89%、17.20%、30.23%。說明外源AsA能夠提高菊苣幼苗莖葉的光合色素含量，從而緩解Cu脅迫引發(fā)的損傷。

2.3 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗Cu含量和轉運系數(shù)的影響

正常處理條件下，菊苣幼苗根系和莖葉中的Cu含量分別為6.32和2.43μg·g-1DW，表明菊苣能夠吸收微量元素Cu，維持植株正常的生長發(fā)育。單一Cu脅迫下，菊苣幼苗根系的Cu含量是莖葉的4倍左右，但根系對Cu的積累量要小于莖葉（其轉運系數(shù)為1.39），說明菊苣吸收的Cu大部分都積累到莖葉中（表3），可通過多次刈割，實現(xiàn)修復Cu污染的目的。在Cu脅迫下，外源AsA的添加能夠降低根系和莖葉的Cu含量，分別降低了24.88%和34.65%，同時，外源AsA也降低了Cu的轉運系數(shù)（1.19），說明外源AsA不僅能夠降低菊苣幼苗對Cu的吸收，而且也降低了Cu向莖葉的轉運。

表2 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗光合參數(shù)和葉綠素含量的影響Table 2 Effect of exogenous AsA on the photosynthetic parameters and chlorophyll content of chicory seedling under Cu stress

表3 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗Cu含量和轉運系數(shù)的影響Table 3 Effect of exogenous AsA on the Cu content and translocation factor of chicory seedling under Cu stress

2.4 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗丙二醛、可溶性蛋白和抗壞血酸含量的影響

丙二醛（MDA）作為細胞膜脂質過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量的高低可以反映細胞膜過氧化的水平和受損的程度［34］。Cu脅迫下，菊苣幼苗根系和莖葉的MDA含量分別比CK顯著增加了231.30%和220.22%（P＜0.05）（圖1），說明菊苣幼苗根系和莖葉的細胞膜均受到了嚴重的Cu毒害作用，并且根系受Cu脅迫的毒害作用更大。單一外源AsA處理時，幼苗根系和莖葉的MDA含量與CK相比有所升高，但未達到顯著水平。當Cu和AsA同時添加時，外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉的細胞膜受損失程度具有明顯的緩解作用，其MDA含量分別降低了40.31%和33.26%，說明外源AsA能有效緩解Cu脅迫對菊苣幼苗細胞膜造成的損傷。

可溶性蛋白作為植物細胞內重要的滲透調節(jié)物質，參與體內多種穩(wěn)態(tài)平衡，并與植物的抗逆性關系密切。與CK相比，Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉的可溶性蛋白含量顯著降低（P＜0.05），分別降低了36.58%和36.88%（圖1），說明Cu脅迫處理影響了菊苣體內滲透調節(jié)系統(tǒng)的平衡。與Cu脅迫相比，外源AsA和Cu的添加能夠使菊苣幼苗根系和莖葉的可溶性蛋白含量顯著提高（P＜0.05），分別提高了20.68%和20.29%。該結果說明外源AsA能有效促進Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉滲透調節(jié)物質積累，以應對Cu脅迫對植物細胞造成的傷害。

抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)是存在于植物體內的重要的H2O2清除系統(tǒng)，主要通過谷胱甘肽和抗壞血酸的氧化還原來清除過量的H2O2，在維持H2O2的平衡中發(fā)揮著重要作用。Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉的AsA含量與CK相比顯著降低（P＜0.05），分別為CK的0.66和0.77倍。添加外源AsA和Cu，根系和莖葉的AsA含量與Cu脅迫相比均顯著升高，分別是Cu脅迫的1.90和2.11倍，根系和莖葉的AsA含量也高于CK，分別是CK的1.47和1.39倍。根系的AsA含量要高于莖葉。說明Cu脅迫能夠降低菊苣幼苗根系和莖葉內源AsA含量，添加外源AsA可提高根系和莖葉中內源AsA含量，對Cu毒害具有一定的緩解效應。

圖1 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗MDA、可溶性蛋白和AsA含量的影響Fig.1 Effect of exogenous AsA on the content of MDA，soluble protein and AsA of chicory seedling under Cu stress不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（P＜0.05），下同。Different lowercase letters above bars show the significant difference among different treatments at the level of 0.05.The same below.

2.5 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗抗氧化酶活性的影響

正常生理條件下，植物通過自身的保護酶系統(tǒng)清除體內的ROS，保護細胞膜免受傷害；當受到外界脅迫時，會使得植物體內的保護酶系統(tǒng)失調，造成ROS積累，使細胞膜受到傷害?？寡趸福⊿OD、POD、CAT、APX）系統(tǒng)是植物體內重要的保護酶系統(tǒng)，它們相互協(xié)調清除植物體內過多的ROS，維持機體的穩(wěn)態(tài)。與CK相 比，50μmol·L-1Cu脅 迫 顯 著 降 低 了 菊苣幼苗根系和莖葉的SOD、POD、CAT、APX活性（P＜0.05），并且根系的抗氧化酶活性的損失大于莖葉（圖2）。對于根系各種抗氧化酶活性損失率的大小順序為：POD（57.48%）＞APX（53.11%）＞CAT（47.78%）＞SOD（46.71%），對于莖葉抗氧化酶活性損失率的大小順序為：APX（52.73%）＞POD（44.77%）＞SOD（43.62%）＞CAT（40.07%）。該結果說明50μmol·L-1Cu脅迫使菊苣幼苗清除ROS的能力降低，并且對根系的傷害作用強于莖葉。與Cu脅迫相比，當Cu和AsA同時存在時，外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉的SOD、POD、CAT、APX活性均有不同程度的增加，其中SOD和POD達到顯著水平。對于根系抗氧化酶活性來說，外源AsA處理對POD活性增加最大（81.99%），其次為SOD（68.36%），APX最少（32.31%），對莖葉來說，SOD活性增加最大（54.37%），其次為CAT（52.00%），APX最小（31.42%）。說明外源AsA對菊苣幼苗的Cu脅迫具有一定的緩解效應。

圖2 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of exogenous AsA on the activities of SOD，POD，CAT and APX of chicory seedling under Cu stress

3 討論

Cu作為植物生長發(fā)育所必需的微量元素，在一定范圍內對植物生長有益，當超過一定閾值時，則對植物的生長產(chǎn)生毒害作用，最終影響干物質量的積累。本研究中，Cu脅迫下菊苣幼苗表現(xiàn)出明顯的毒害現(xiàn)象，如植株矮小，根長變短、側根變少，莖葉數(shù)少且顏色發(fā)黃等。Cu脅迫嚴重限制了菊苣幼苗根系和莖葉干物質量的積累（表1），這與李賀勤等［24］、丁園等［35］、Raza等［36］的研究結果相一致。從葉綠素水平上能夠看出（表2），Cu脅迫降低了菊苣幼苗莖葉中葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素的含量，且葉綠素a下降幅度比葉綠素b大，使葉綠素a與葉綠素b的比值減少，降低了類囊體的垛疊程度，從而使菊苣幼苗葉片捕獲、轉化光能的能力下降，抑制了光合作用的進行［37-38］。從光合作用參數(shù)的結果來看，Cu脅迫菊苣幼苗葉片凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）和氣孔導度（Gs）均顯著降低（表2），說明Cu脅迫導致與光合作用直接相關的PSⅡ活性降低，使得葉綠體光合作用的生理過程受阻。該結果與前人所報道的結果相一致［39-40］。造成這種現(xiàn)象的原因是多方面的：一方面，Cu脅迫打破了植物體內正常的元素吸收、運輸以及滲透調節(jié)等方面的平衡，使代謝過程紊亂；另一方面，較多的Cu進入植株體后，不僅與核酸、蛋白質等大分子物質相結合，還可取代某些酶的活性位點，使其活性降低或喪失，導致生理功能發(fā)生紊亂［41-42］。

研究表明，外源AsA能夠有效緩解逆境脅迫對植物的抑制作用［25］。外源AsA的添加不僅提高了菊苣幼苗根系和莖葉的長度和生物量，而且在一定程度上提高了光合色素（葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素、類胡蘿卜素）的含量，增強了莖葉捕獲、轉化光能的效率（表1，2）。這可能是由于外源AsA抑制了有關葉綠素降解酶的活性［43］或者促進了與葉綠素生物合成相關酶的合成［44］，從而提高了莖葉的葉綠素含量，最終增加了生物量。也有研究表明，AsA作為抗氧化保護劑，保護了光合作用中的電子傳遞體免受傷害，從而提高了光化學電子的傳遞效率［45］。還有研究表明，類胡蘿卜素也可作為抗氧化劑參與到光保護過程［46］，外源AsA能夠通過增加類胡蘿卜素的含量以達到防止脂質過氧化以及保護細胞膜結構穩(wěn)定的目的。

根系是植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官，也是感受外界脅迫的首要部位［47］。在正常條件下，菊苣幼苗能夠吸收微量元素Cu，維持植株正常的生長發(fā)育。Cu脅迫下，菊苣幼苗根系的Cu含量是莖葉的4倍左右（表3），但Cu脅迫下植株根冠細胞分裂及生長受抑制，使得根系的傷害要大于莖葉，導致莖葉中Cu的積累量要高于根系。從轉運系數(shù)（其值＞1）能夠看出，菊苣可以作為一種修復植物，通過對莖葉的多次刈割，達到修復Cu污染的目的，但由于菊苣積累的Cu大部分在莖葉中，當將其作為蔬菜食用時還需謹慎。當外源AsA添加后，根系和莖葉中的Cu含量和積累量都在降低，并且轉運系數(shù)也降低（表3），這可能是AsA改變了菊苣體內礦質元素的分布或者干擾了與Cu吸收相關基因的表達以及代謝通路，阻礙了植物對Cu的吸收［48］。

逆境脅迫能夠誘導植物產(chǎn)生大量的活性氧自由基（ROS），并在細胞中過量積累，破壞了細胞質膜的結構并干擾其正常的代謝過程，植物通過自身保護酶系統(tǒng)的協(xié)調配合，共同清除植物體內的ROS，以抵御外界脅迫［48-50］。研究表明，SOD是清除ROS的第一道防線，可歧化O2－生成H2O2和過氧化物，并減少更具毒性的羥基自由基（·OH）的形成；CAT、POD、APX共同作用把H2O2和過氧化物轉化為H2O與O2［51］，從而維持植物體內較低濃度的H2O2，減輕或解除質膜過氧化作用對細胞膜的損傷。丙二醛含量是表征細胞膜脂質過氧化程度的重要指標［52］。本研究中，Cu脅迫導致菊苣幼苗根系和莖葉中MDA含量大幅提高（圖1），說明Cu脅迫下ROS過量產(chǎn)生，嚴重破壞了細胞膜的完整性和穩(wěn)定性。另外，Cu脅迫顯著降低了菊苣幼苗的SOD、POD、CAT、APX活性，這與前人的結果相一致［53］，表明菊苣幼苗自身清除ROS的能力下降，這主要是由于高濃度的Cu使植物體內的蛋白結構被破壞，酶活性和代謝途徑受抑制。外源AsA添加后，菊苣幼苗根系和莖葉中MDA含量降低（圖1），而保護酶的活性卻升高（圖2），表明外源AsA通過提高菊苣幼苗的抗氧化酶活性，進而緩解Cu脅迫對細胞質膜的氧化損傷。

AsA-GSH循環(huán)是植物體內重要的H2O2清除系統(tǒng)，可以直接或者間接地清除體內產(chǎn)生的ROS，參與植物對環(huán)境脅迫的改善，促進植物生長發(fā)育和增產(chǎn)［52-53］。本研究中，Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉的AsA含量顯著降低，外源AsA的添加能夠顯著提高菊苣幼苗內源AsA含量（圖1）。同時，Cu脅迫下，菊苣幼苗根系和莖葉的滲透調節(jié)物質（如可溶性蛋白）含量顯著降低，外源AsA的添加能夠增加菊苣幼苗根系和莖葉中可溶性蛋白含量，這可能是由于AsA促進了Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉滲透調節(jié)物質積累，也可能是AsA的存在抑制了滲透調節(jié)物質的降解，以緩解Cu脅迫對植物細胞造成的傷害。

4 結論

綜上所述，Cu脅迫顯著抑制了菊苣幼苗根系生長、葉綠素含量和光合作用參數(shù)，同時也加劇了細胞膜脂質的過氧化程度，降低了抗氧化酶活性以及可溶性蛋白含量，導致根系和莖葉生物量顯著降低。Cu脅迫下，外源AsA能夠降低脂質過氧化對細胞膜的損傷，提高了抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量以及內源AsA含量，同時也降低了根系對Cu的吸收和轉運，保持較高的葉綠素含量和光合作用參數(shù)，最終表現(xiàn)為促進Cu脅迫下菊苣幼苗的生長和生物量的增加。因此，外源AsA通過調控抗氧化酶活性和滲透調節(jié)物質的含量，緩解了Cu脅迫對菊苣幼苗生長的毒害作用。