尚鳳琴，李曉瑞，余卓營(yíng)，張野，石冰潔，王建勛

北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京102488

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種以克隆性漿細(xì)胞積聚為特征的惡性腫瘤［1］，目前MM 的治療主要依靠四類(lèi)藥物，即蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、單抗類(lèi)藥物以及糖皮質(zhì)激素。近年來(lái)雖然蛋白酶體抑制劑硼替佐米與免疫調(diào)節(jié)劑來(lái)那度胺聯(lián)合治療MM 已經(jīng)取得了較好的效果，但仍無(wú)法改善患者的預(yù)后［2-4］。B 細(xì)胞成熟抗原（BCMA）是腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族成員，選擇性表達(dá)于終末分化的包括MM腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的 B 淋巴細(xì)胞表面［5］。BCMA 主要在漿細(xì)胞上表達(dá)，在人體主要器官的細(xì)胞上基本不表達(dá)［6-9］。嵌合抗原受體（CAR）是結(jié)合抗原識(shí)別域、共刺激域和 T 細(xì)胞激活域的一種蛋白［10-11］。BCMA 是CAR-T 細(xì)胞治療MM 的一個(gè)理想靶抗原，經(jīng)過(guò)改造的CAR-T 細(xì)胞能夠特異性識(shí)別并消除表達(dá)靶向抗原的腫瘤細(xì)胞［9］。2019年3月—2020年1月，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新型靶向人源BCMA 的CAR 分子，采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)健康志愿者的T 細(xì)胞，成功制備Anti-BCMA-CAR-T 細(xì)胞，并觀察其對(duì)BCMA 陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：逆病毒包裝細(xì)胞系以及人慢性髓系白血病細(xì)胞K562、人BCMA 陽(yáng)性 K562（K562-hB?CMA）細(xì)胞、食蟹猴BCMA 陽(yáng)性K562（K562-cBCMA）細(xì)胞、人骨髓瘤B 細(xì)胞RPMI-8226 細(xì)胞系均購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)。主要試劑：RPMI 1640 培養(yǎng)基、AIM-Ⅴ培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）及PBS 緩沖液均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，熒光素酶底物、FuGene HD 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Promega 公司，淋巴細(xì)胞分離液、細(xì)胞凋亡試劑盒均購(gòu)自北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司，白細(xì)胞介素2（IL-2）、OKT-3 購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司，干擾素γ（IFN-γ）ELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó) R&D 公司，Myc-PE、BCMA-BV421、CD3-APC等抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 靶向人源BCMA 的CAR（BCMA-CAR）分子構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選出親和力較強(qiáng)的Anti-BCMA-CAR，再由通用生物公司合成BCMA ScFv 序列，由此構(gòu)建靶向人源BCMA 的CAR分子，其結(jié)構(gòu)為經(jīng)典第二代CAR 分子結(jié)構(gòu)，將BC?MA ScFv、CD8 鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD28 胞內(nèi)區(qū)和CD3ζ胞內(nèi)區(qū)依次串聯(lián)，具體分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 CAR分子結(jié)構(gòu)示意圖

1.3 pMFG-Myc-BCMA-CAR 質(zhì)粒載體構(gòu)建 合成BCMA ScFv 序列后，將序列與載體由XhoⅠ/NotⅠ雙酶切，凝膠電泳的方式回收酶切后的目的片段與載體并純化，16 ℃條件下將純化后的目的片段與載體用T4 連接酶連接1 h。用DH-5α 感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取單克隆加入有氨芐抗性的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃搖床孵育12～16 h。提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定正確后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒載體被命名為pMFG-Myc-BCMA-CAR。

1.4 T細(xì)胞制備及分組轉(zhuǎn)導(dǎo) 抽取3位健康志愿者外周血各20 mL，采用Ficoll 密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），重懸于AIM-Ⅴ完全培養(yǎng)基（添加10% FBS 和1%青—鏈霉素溶液），同時(shí)加入終濃度為100 ng/mL OKT-3和100 U/mL IL-2刺激T細(xì)胞增殖，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中無(wú)菌培養(yǎng)。收集培養(yǎng)后的細(xì)胞即為人原代T 細(xì)胞，分為觀察組和對(duì)照組。觀察組將pMFG-Myc-BCMA-CAR 質(zhì)粒載體包裝為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)照組不做轉(zhuǎn)導(dǎo)處理。轉(zhuǎn)導(dǎo)48 h 后用Myc-PE 抗體通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Myc抗原表達(dá)，計(jì)算轉(zhuǎn)導(dǎo)效率（即Myc表達(dá)率）。轉(zhuǎn)導(dǎo)效率＝Myc-PE 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總活細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 細(xì)胞增殖能力觀察 取兩組細(xì)胞，以提取PBMC 當(dāng)天記為第 0 天，之后每2 天（48 h）計(jì)數(shù)傳代1 次，維持細(xì)胞密度為 1×106/mL、IL-2 終濃度為 100 U/mL。單次生長(zhǎng)倍數(shù)為計(jì)數(shù)時(shí)細(xì)胞密度與上次處理時(shí)細(xì)胞終密度的比值，生長(zhǎng)倍數(shù)為單次生長(zhǎng)倍數(shù)的乘積，第0 天單次生長(zhǎng)倍數(shù)和生長(zhǎng)倍數(shù)均定為1。分別計(jì)算兩組培養(yǎng)0～18 d的生長(zhǎng)倍數(shù)對(duì)數(shù)值，并繪制增殖曲線。

1.6 兩組細(xì)胞與RPMI-8226 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的體外增殖能力觀察 采用CFSE 染色的T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。從液氮中取出并復(fù)蘇RPMI-8226 細(xì)胞，以1×106/mL接種于RPMI 1640 完全培養(yǎng)基（添加10%FBS 和1%青—鏈霉素溶液），37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中無(wú)菌培養(yǎng)。每隔48 h 計(jì)數(shù)傳代1 次，觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)RPMI-8226細(xì)胞存活率達(dá)到80%以上時(shí)表示細(xì)胞狀態(tài)良好，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將RPMI-8226 細(xì)胞用AIM-Ⅴ完全培養(yǎng)基（含IL-2）稀釋至4×104/100 μL，取100μL接種于96孔板實(shí)驗(yàn)孔。取兩組細(xì)胞，采用CFSE（用AIM-Ⅴ培養(yǎng)基稀釋成10 μmol/mL）37 ℃水浴避光染色處理；調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/100μL，取100μL 加在鋪有RPMI-8226 細(xì)胞的孔中，即效靶比為1∶4。放入培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)72 h，上流式細(xì)胞儀，CD3-APC染色標(biāo)記T細(xì)胞，以CFSE現(xiàn)染（0 h）的T細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)CFSE 信號(hào)強(qiáng)弱比較兩組共培養(yǎng)后的細(xì)胞增殖情況，CFSE 信號(hào)越弱（左移越明顯）表明其增殖能力越強(qiáng)。

1.7 兩組細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力觀察

1.7.1 兩組細(xì)胞對(duì)BCMA 陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的殺傷能力觀察 ①采用流式細(xì)胞術(shù)。參照1.6 的方法培養(yǎng)RPMI-8226、K562細(xì)胞，用BCMA-BV421抗體通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其細(xì)胞表面BCMA 陽(yáng)性率，結(jié)果顯示分別為44.7%、0.4%，選擇RPMI-8226 作為細(xì)胞殺傷的靶細(xì)胞。將兩組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，參照1.6的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)鋪板，與RPMI-8226 細(xì)胞以不同效靶比（1∶4、1∶1、4∶1，4×104/100 μL 靶細(xì)胞為 1∶1）共孵育（作為殺傷孔），并以?xún)H有RPMI-8226 細(xì)胞的孔作為未殺傷孔；12 h 后300 g 離心5 min，收集細(xì)胞。染色緩沖液（含10% FBS 的PBS 緩沖液）沖洗1 遍，CD3-APC染色60 min，沖洗后重懸于配好的Annexin-Ⅴ-FITC緩沖液中，45 min后終止染色。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)靶細(xì)胞凋亡率，其中APC 陰性（靶細(xì)胞）且FITC 陽(yáng)性（凋亡細(xì)胞）區(qū)域細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。殺傷效率=殺傷孔靶細(xì)胞凋亡率-未殺傷孔靶細(xì)胞凋亡率。②采用熒光素酶化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)。將兩組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，參照1.6 的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)鋪板，與RPMI-8226 細(xì)胞以不同效靶比（1∶4、1∶1、4∶1，4×104/100μL 靶細(xì)胞為1∶1）共孵育（作為實(shí)驗(yàn)孔），以?xún)H有RPMI-8226 細(xì)胞的孔作為最大釋放孔，以只有培養(yǎng)基的孔作為空白孔。12 h 后300 g 離心5min 去除上清，1×PBS緩沖液沖洗掉效應(yīng)細(xì)胞，加入配制好的ONE-GloTM試劑，室溫避光放置5 min。設(shè)置化學(xué)發(fā)光模式（LUM）、全白酶標(biāo)板、震板10 s、PMT=500。計(jì)算殺傷效率，殺傷效率=1-（實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞凋亡率-空白孔細(xì)胞凋亡率）/（最大釋放孔細(xì)胞凋亡率-空白孔細(xì)胞凋亡率）×100%。

1.7.2 兩組細(xì)胞對(duì)人BCMA 陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷能力觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。將K562-cBC?MA、K562-hBCMA 細(xì)胞接種于 RPMI 1640 培養(yǎng)基（添加10% FBS 和1%青—鏈霉素溶液），調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中無(wú)菌培養(yǎng)。參照1.7.1 用BCMA-BV421 抗體通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)K562-cBCMA、K562-hBCMA 細(xì)胞表面人BCMA 陽(yáng)性率，結(jié)果顯示分別為0.2%、73.9%。將兩組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，分別與K562-cBCMA、K562-hBCMA 細(xì)胞以不同效靶比（1∶4、1∶1、4∶1，4×104/100 μL 靶細(xì)胞為1∶1）共孵育12 h。參照1.7.1采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)殺傷效率。

1.8 兩組細(xì)胞殺傷BCMA 陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞后上清IFN-γ 水平檢測(cè) 采用ELISA 法。將兩組細(xì)胞與RPMI-8226、K562-hBCMA 兩種 BCMA 陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞分別共培養(yǎng)12 h，效靶比為4∶1（4×104/100 μL靶細(xì)胞為 1∶1）。收集細(xì)胞后 300 g 離心 5 min，吸取細(xì)胞上清，采用ELISA法檢測(cè)上清IFN-γ 水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比較 觀察組和對(duì)照組轉(zhuǎn)導(dǎo)效率分別為44.83%、0.03%。見(jiàn)圖2。

2.2 兩組細(xì)胞增殖能力比較 兩組培養(yǎng)0～18 d的生長(zhǎng)倍數(shù)對(duì)數(shù)值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)圖3。

2.3 兩組細(xì)胞與RPMI-8226 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的體外增殖能力比較 與對(duì)照組比較，觀察組FITC 信號(hào)明顯左移。見(jiàn)圖4。

2.4 兩組細(xì)胞在不同效靶比時(shí)對(duì)RPMI-8226 細(xì)胞的殺傷效率比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，相同效靶比時(shí)，觀察組殺傷效率均高于對(duì)照組（P均＜0.05）。熒光素酶化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，效靶比為1∶1、4∶1 時(shí)，觀察組殺傷效率均高于對(duì)照組（P均＜0.05）；效靶比為1∶4 時(shí)，觀察組與對(duì)照組殺傷效率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

圖2 Anti-BCMA-CAR-T細(xì)胞與普通T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率圖

圖3 兩組培養(yǎng)0～18 d細(xì)胞增殖曲線

圖4 兩組細(xì)胞與RPMI-8226細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的體外增殖情況

表1 兩組細(xì)胞在不同效靶比時(shí)對(duì)RPMI-8226細(xì)胞的殺傷效率比較（%，±s）

表1 兩組細(xì)胞在不同效靶比時(shí)對(duì)RPMI-8226細(xì)胞的殺傷效率比較（%，±s）

注：與對(duì)照組相同效靶比比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別觀察組效靶比1∶4效靶比1∶1效靶比4∶1對(duì)照組效靶比1∶4效靶比1∶1效靶比4∶1殺傷效率流式細(xì)胞術(shù)16.67±12.24*41.90± 5.42**65.05±12.06**2.53± 1.35 6.50± 3.34 17.21± 7.88熒光素酶化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)39.45±12.94 74.04±10.87**97.63± 2.57**21.01±14.43 26.65±15.90 49.98±11.48

2.5 兩組細(xì)胞在不同效靶比時(shí)對(duì)K562-cBCMA、K562-hBCMA 細(xì)胞的殺傷效率比較 效靶比為1∶4時(shí)，兩組細(xì)胞對(duì)K562-cBCMA、K562-hBCMA 細(xì)胞的殺傷效率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；效靶比為 1∶1、4∶1 時(shí)，觀察組細(xì)胞對(duì) K562-hBCMA 細(xì)胞的殺傷效率明顯高于同組K562-cBCMA 及對(duì)照組對(duì)K562-hBCMA的殺傷效率（P均＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.6 兩組細(xì)胞殺傷RPMI-8226、K562-hBCMA 細(xì)胞后上清IFN-γ 水平檢測(cè) 在殺傷相同BCMA 陽(yáng)性靶細(xì)胞后，觀察組上清IFN-γ水平均高于對(duì)照組（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 兩組細(xì)胞在不同效靶比時(shí)對(duì)K562-cBCMA、K562-hBCMA細(xì)胞的殺傷效率比較（%，±s）

表2 兩組細(xì)胞在不同效靶比時(shí)對(duì)K562-cBCMA、K562-hBCMA細(xì)胞的殺傷效率比較（%，±s）

注：與同組相同效靶比殺傷K562-cBCMA比較，*P＜0.05；與對(duì)照組相同效靶比殺傷相同靶細(xì)胞比較，#P＜0.05。

組別觀察組效靶比1∶4效靶比1∶1效靶比4∶1對(duì)照組效靶比1∶4效靶比1∶1效靶比4∶1殺傷效率K562-cBCMA 0.52±2.69 2.86±1.94 3.29±3.85 1.45±0.92 2.24±1.11 5.70±4.84 K562-hBCMA 2.51±0.59 11.82±3.47*#34.03±8.63*#0.27±1.43 1.17±1.37 4.48±1.50

表3 兩組細(xì)胞殺傷RPMI-8226、K562-hBCMA細(xì)胞后上清IFN-γ水平（pg/mL，-x± s）

3 討論

MM 是一種以克隆性漿細(xì)胞積聚為特征的惡性腫瘤［1］，主要表現(xiàn)為骨髓中漿細(xì)胞惡性增生、分泌大量單克隆免疫球蛋白（M 蛋白），并最終導(dǎo)致靶器官損害［12］。近年來(lái)，自體造血干細(xì)胞移植的方法得到推廣，患者生存率也得到了顯著提升，但是目前MM仍是一種不可治愈的疾?。?3］。幾乎所有的MM 患者最終都會(huì)復(fù)發(fā)或產(chǎn)生耐藥性，而MM 的藥物治療效果會(huì)隨著病情的反復(fù)而逐漸減弱。隨著CAR-T 細(xì)胞在急性淋巴細(xì)胞白血病治療中獲得成功，其在MM 中的研究也陸續(xù)開(kāi)展。目前運(yùn)用CAR-T 細(xì)胞治療 MM 的主要靶點(diǎn)有 CD38、BCMA、CS1（SLAMF7）等［14］，其中 BCMA 基本上只在漿細(xì)胞上表達(dá)，是CAR-T 細(xì)胞治療 MM 的理想靶抗原［9］。靶向 BCMA的CAR-T 細(xì)胞bb2121 已在MM 的治療中得到應(yīng)用［15］。

目前，Anti-BCMA-CAR-T 細(xì)胞靶向治療 MM 已經(jīng)取得了一定進(jìn)展［16-17］。本研究采用的CAR 分子結(jié)構(gòu)為第二代結(jié)構(gòu)，共刺激分子為CD28，用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行包裝并成功轉(zhuǎn)染人原代T 細(xì)胞，成功構(gòu)建Anti-BCMA-CAR-T 細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，兩組培養(yǎng)0～18 d 的生長(zhǎng)倍數(shù)對(duì)數(shù)值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，體外增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示觀察組FITC 信號(hào)明顯左移；提示Anti-BCMA-CAR 在轉(zhuǎn)染T 細(xì)胞后對(duì)T細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯影響，但是與RPMI-8226 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的體外增殖能力明顯升高，表明我們構(gòu)建的CAR分子可以有效增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖能力。為了驗(yàn)證Anti-BCMA-CAR-T細(xì)胞殺傷BCMA陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的能力和特異性，本研究選用了多種BCMA 陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞模型，即RPMI-8226、K562-hBCMA、K562-cBCMA 等。結(jié)果顯示，效靶比為 1∶1、4∶1 時(shí)，觀察組對(duì)RPMI-8226、K562-hBCMA 細(xì)胞的殺傷效率均高于對(duì)照組，但兩組細(xì)胞在相同效靶比時(shí)對(duì)K562-cBCMA 細(xì)胞的殺傷效率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示Anti-BCMA-CAR-T 細(xì)胞可特異性殺傷BCMA 陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，且對(duì)人BCMA 陽(yáng)性靶細(xì)胞具有殺傷特異性。

T 細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵特征是效應(yīng)分子的釋放，其中就包括促炎癥細(xì)胞因子IFN-γ 的釋放［18］。因此，檢測(cè) IFN-γ 的分泌情況可以從側(cè)面驗(yàn)證T 細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率。本研究結(jié)果顯示，在殺傷相同BCMA 陽(yáng)性靶細(xì)胞后，觀察組上清IFN-γ 水平均高于對(duì)照組，觀察組上清 IFN-γ 為 200～1 500 pg/mL；說(shuō)明我們構(gòu)建的Anti-BCMA-CAR-T 細(xì)胞的殺傷能力可以被BCMA抗原激活，并釋放大量殺傷性相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了一種新型靶向人源BCMA 的CAR-T 細(xì)胞，該細(xì)胞能夠有效且特異性殺傷人BCMA 陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，下一步擬進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Anti-BCMA-CAR-T 細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。