吳 懼，李 賀，岳 坤，程 楠，徐 鍵，尹 敏，尹家俊，余 杰

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 肝膽胰腹腔鏡外科病房，遼寧 大連116001)

肝細(xì)胞癌(HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，是與癌癥相關(guān)死亡的第二大病因[1]。盡管目前在肝癌的診斷和治療方面已取得一定的進(jìn)展，但該疾病導(dǎo)致的高死亡率以及不良預(yù)后仍然是困擾著醫(yī)學(xué)界的一大難題[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸(nt)的非編碼RNA[3]。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNA參與了多種細(xì)胞過(guò)程的調(diào)控，包括細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，細(xì)胞凋亡和代謝[4-5]。轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)，是一個(gè)進(jìn)化高度保守的lncRNA基因，由8 000 nt組成，位于染色體11q13[6]。最近研究發(fā)現(xiàn)MALAT1可調(diào)節(jié)多種癌癥中的細(xì)胞遷移，增殖，侵襲和凋亡，例如乳腺癌[7]，大腸癌[8]和胃癌[9]等。本研究旨在探討MALAT1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖，遷移以及體外成瘤的影響，并探討其發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh-7及正常肝細(xì)胞L-O2均由中國(guó)科學(xué)院(上海)細(xì)胞類型培養(yǎng)研究所購(gòu)得。Akt,PI3K一抗購(gòu)自美國(guó)abcam公司;MEM和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司;MALAT1 siRNA 干擾序列購(gòu)自GenePharma(上海吉瑪公司);轉(zhuǎn)染試劑GP-transfect-Mate購(gòu)自GenePharma(上海吉瑪公司);引物由大連寶生物科技有限公司設(shè)計(jì)以及合成;RT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染及分組

L-O2和Huh-7細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2-1∶3 的比例傳代。HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗的MEM培養(yǎng)基，同樣置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2-1∶3的比例傳代。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。取肝癌細(xì)胞系培養(yǎng)后隨機(jī)分為三組：肝細(xì)胞癌組(Blank 組)，陰性轉(zhuǎn)染組(si-NC組)，MALAT1siRNA組(si-MALAT1組)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和Huh-7細(xì)胞以轉(zhuǎn)染前一天2×105接種到6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%-80%通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑GP-transfect-Mate ，按照說(shuō)明書方法分別轉(zhuǎn)染,4-6小時(shí)后查看轉(zhuǎn)染效率(圖1)。48 h后用于提取RNA，72 h后用于提取蛋白。

圖1 Huh-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 (A：轉(zhuǎn)染前 B：轉(zhuǎn)染后)

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染后24 h收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按密度為1×103/孔接種于96孔板中。細(xì)胞在37℃孵育0 h、24 h、48 h和72 h，在指定的時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μL CCK-8試劑，在37°C孵育2 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)光密度值(OD值)，整理統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，綜合分析數(shù)據(jù)，得出結(jié)果。

1.5 集落形成試驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞體外成瘤轉(zhuǎn)染后24 h收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，機(jī)械懸浮成單個(gè)細(xì)胞懸液。然后，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞計(jì)數(shù)并接種到6孔板中，平均每孔2000個(gè)細(xì)胞。在37℃、5%CO2的潮濕氣氛中孵育2周后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3遍，無(wú)水甲醇固定20 min，結(jié)晶紫染色15 min，用PBS洗滌3遍，然后空氣中干燥。在光學(xué)顯微鏡下拍攝染色細(xì)胞并計(jì)數(shù)，每孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野。

1.6 劃痕愈合檢測(cè)肝癌細(xì)胞遷移HCC細(xì)胞以5×106細(xì)胞/孔的密度接種在六孔板。長(zhǎng)滿后，用槍頭沿直尺垂直劃痕，每孔3條劃痕，再用PBS清洗3遍，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基， 放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0 h，24 h，48 h取樣，拍照。

1.7 Western blot檢測(cè)PI3K、Akt蛋白表達(dá)量提取轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，用TBST清洗2遍，加一抗(PI3K1∶1 000，Akt1∶1 000，Beta-actin1∶500)，4℃孵育過(guò)夜后用TBST洗滌3遍，加二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，用TBST清洗3遍，用 ECL 法化學(xué)發(fā)光，用 ImageJ分析掃描灰度值，Beta-actin設(shè)置為內(nèi)參照，分析蛋白表達(dá)水平。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，并用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，三組間比較選用方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA MALAT1 在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果

運(yùn)用PCR技術(shù)檢測(cè)正常肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞中的MALAT1表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞(L-O2)相比，肝癌細(xì)胞(HepG2和Huh-7)中MALAT1的表達(dá)水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，圖2A；轉(zhuǎn)染后，肝癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MALAT1的表達(dá)水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，圖2B。

圖2A lncRNA MALAT1在肝癌細(xì)胞系及正常肝細(xì)胞系中的表達(dá)，*P<0.05，**P<0.05.

圖2B siRNA轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞lncRNA MALAT1的表達(dá)，#P<0.05

2.2 下調(diào)lncRNA MALAT1表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測(cè)三組肝癌細(xì)胞增殖情況，與Blank 組(5.212±0.132)相比，si-NC組細(xì)胞增殖率(4.741±0.211)無(wú)明顯差異(t=2.976,P>0.05)，si-MALAT1組細(xì)胞增殖率(2.785±0.174)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.016,P<0.05)，圖3A,圖3B。

圖3A Blank 組、si-NC組、si-MALAT1組細(xì)胞增殖曲線,

圖3B Blank 組、si-NC組、si-MALAT1組細(xì)胞增殖率，

2.3 下調(diào)lncRNA MALAT1表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Blank 組(63.477±4.324)%相比，si-NC組細(xì)胞遷移愈合率(58.108±5.341)%無(wú)明顯差異(t=1.897P>0.05)，si-MALAT1組細(xì)胞遷移愈合率(31.420±6.235)%明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.316P<0.05)，圖4A,圖4B。

2.4 下調(diào)lncRNA MALAT1表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞體外成瘤能力的影響

集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Blank 組細(xì)胞集落形成率(52.141±5.320)%相比，si-NC組細(xì)胞集落形成率(46.880±4.571)%無(wú)明顯差異(t=1.774,P>0.05)，si-MALAT1組細(xì)胞集落形成率(22.753±6.382)%明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.962,P<0.05)，圖5A,圖5B。

圖4A Huh-7 細(xì)胞在200倍視野下0 h、48 h的遷移愈合情況

圖4B Blank 組、si-NC組、si-MALAT1組細(xì)胞遷移愈合率，#P<0.05

圖5A Huh-7細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)

圖5B Blank 組、si-NC組、si-MALAT1組細(xì)胞集落形成率，#P<0.05

2.5 下調(diào)lncRNA MALAT1對(duì)肝癌細(xì)胞PI3K、Akt蛋白表達(dá)的影響

蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞PI3K、Akt蛋白表達(dá)情況，與Blank組相比，si-NC組各蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)，si-MALAT1組肝癌細(xì)胞內(nèi)PI3K、Akt蛋白表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，圖6A,圖6B1,B2。

圖6A 蛋白免疫印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)細(xì)胞PI3K、Akt表達(dá)的影響

圖6B1 Blank 組、si-NC組、si-MALAT1組細(xì)胞PI3K蛋白表達(dá),#P<0.05

圖6B2 Blank 組、si-NC組、si-MALAT1組細(xì)胞Akt蛋白表達(dá),#P<0.05

3 討論

肝癌在臨床上是極其常見的惡性腫瘤[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)肝癌的病死率在腫瘤中排第二位[10]。許多危險(xiǎn)因素，包括酒精性肝病，非酒精性脂肪性肝病，肝硬化，HBV和HCV感染，均會(huì)影響肝癌發(fā)生與發(fā)展[11-12]。然而，肝癌的潛在發(fā)病機(jī)制目前尚未明確。盡管目前國(guó)內(nèi)外在肝癌的診斷和治療方面有了很大進(jìn)展，但是肝癌患者的治療效果以及遠(yuǎn)期預(yù)后仍不理想，其5年生存率僅為15%[13]。肝癌患者的不良預(yù)后主要?dú)w因于術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高，且缺乏有效的輔助治療[14]。近年來(lái)大量文獻(xiàn)表明，lncRNA在肝癌的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后中起到重要作用[15-16]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)是一種長(zhǎng)度超過(guò)200nt、缺乏編碼蛋白質(zhì)能力的RNA序列，起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具有生物學(xué)功能[17]。近年來(lái)研究表明，lncRNAs參與了多種細(xì)胞過(guò)程的調(diào)控，包括細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，細(xì)胞凋亡和代謝[4-5]。其在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝過(guò)程中作用日漸受到重視。MALAT1是一個(gè)進(jìn)化高度保守的lncRNA基因，由8000 nt組成，編碼基因定位于染色體11q13.1[6]。最早是在研究非小細(xì)胞肺癌中被發(fā)現(xiàn)[18]。Schmidt 等[19]對(duì)非小細(xì)胞肺癌的研究發(fā)現(xiàn),MALAT1 具有促進(jìn)肺癌形成的能力，且高表達(dá)的MALAT1與肺癌的預(yù)后不良有關(guān)。它在胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中均有不同程度的表達(dá)[7-9]。本研究結(jié)果顯示：與正常肝細(xì)胞(L-O2)相比，肝癌細(xì)胞中MALAT1表達(dá)升高；si-MALAT組的肝癌細(xì)胞的增殖、遷移率均低于空白對(duì)照組(Blank 組)，陰性對(duì)照組(si-NC組)。提示MALAT1在肝癌中高表達(dá)且與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

PI3K/Akt信號(hào)通路是重要的凋亡抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其在胃癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌、鼻咽癌等多種腫瘤生長(zhǎng)代謝中發(fā)揮重要作用[20]。PI3K 活化后可激活下游蛋白Akt，活化后的Akt可調(diào)節(jié)其下游多種凋亡相關(guān)基因，促進(jìn)凋亡基因失活，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。Zhang SH等人[21]研究證實(shí)，LncRNA-MALAT1介導(dǎo)PI3K/Akt 信號(hào)通路調(diào)控高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和血管生成。Jin Y 等人[22]研究表明，LncRNA-MALAT1介導(dǎo)PI3K/Akt 信號(hào)通路促進(jìn)卵巢癌上皮細(xì)胞增殖、代謝。本研究進(jìn)一步對(duì)MALAT1與PI3K、Akt之間的相互作用機(jī)制進(jìn)行探究，通過(guò)抑制MALAT1的表達(dá)，siRNA 組細(xì)胞 PI3K、Akt 蛋白表達(dá)量明顯下降;siRNA 陰性對(duì)照組無(wú)明顯變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:下調(diào) MALAT-1可以抑制 PI3K/Akt 信號(hào)通路上關(guān)鍵靶點(diǎn)PI3K與Akt的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和體外成瘤能力。

本研究仍然存在一些不足之處，如： MALAT1是如何對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)通路上關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行影響，MALAT1是否會(huì)改善肝癌患者的預(yù)后，都值得下一階段進(jìn)一步探究。

綜上所述，MALAT1 在肝癌中高表達(dá)，且MALAT1能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移以及體外成瘤能力。下調(diào)肝癌細(xì)胞中 MALAT1后，可抑制其生物學(xué)行為。其機(jī)制可能與其影響PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路上關(guān)鍵靶點(diǎn)的表達(dá)有關(guān)，為臨床上治療肝癌提供了新的思路。