崔璨璨，何成彥，郭 賀，李曉歐

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科;b.體檢中心，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林省腫瘤醫(yī)院 檢驗(yàn)科)

近年來(lái)，腎癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)[1]，在泌尿系統(tǒng)腫瘤中僅次于前列腺癌和膀胱癌。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)腎癌組織和癌旁組織中的蛋白進(jìn)行定性定量研究[2]，是尋找腎癌腫瘤標(biāo)志物的關(guān)鍵。本研究探討NPM1在腎癌組織中的表達(dá)量，為腎癌的早期診斷和篩查提供方向。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究共納入了18例經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)診斷為TNMIII期、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且組織學(xué)亞型為腎透明細(xì)胞癌的患者作為研究對(duì)象。樣本在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院2018年1月-2018年12月期間采集，采集前研究對(duì)象均未接受任何臨床干預(yù)治療并簽署了相關(guān)的知情同意書，樣本包括腎癌組織和癌旁組織，完成采集后，進(jìn)行液氮速凍，并存于-80℃的冰箱中備用。

1.2 儀器和試劑

Easy-nlc1000超高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)、Orbitrap Fusion Lumos-tribrid質(zhì)譜儀(美國(guó)SCIEX公司)、毛細(xì)管液相色譜柱(美國(guó)RESTEK)、電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。PBS、考馬斯亮藍(lán)G250、二硫代蘇糖醇(DTT)、NH4HCO3、碘代乙酰胺(IAM)、FA及CAN均購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司。RIPA裂解緩沖液、RNA酶、DNA酶、測(cè)序級(jí)胰蛋白酶及NPM1單克隆抗體均購(gòu)自Cambridge Isotope Laboratories公司。

1.3 方法

1.3.1提取及測(cè)定樣本總蛋白 將采集的樣本于-80℃的冰箱中取出，PBS充分清洗、液氮研磨成粉末狀后，加入適量的RIPA裂解緩沖液、RNA酶和DNA酶。應(yīng)用離心機(jī)，在4℃下，對(duì)樣本以12 000 rpm 轉(zhuǎn)速進(jìn)行15 min離心，上清液即可視為樣品的總蛋白。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)對(duì)全部樣本的總蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，并依據(jù)結(jié)果繪制相關(guān)的蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2蛋白質(zhì)多肽混合物的制備 室溫下，自然融化存放于冰箱中的樣本。對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行溶解稀釋，先加入樣本體積5倍且濃度為50 mmol/L的NH4HCO3溶液，后加入濃度為1 mol/L的DTT，使樣本能夠調(diào)定至20 mmol/L。完成上述步驟后，將樣本放置于黑暗條件下，56℃靜置1 h。樣本嚴(yán)格冷卻至室溫，加入1 mol/L的IAM，確保濃度最終調(diào)定為50 mmol/L，并于黑暗條件下再次靜置1 h。樣本加入胰蛋白酶(比例為50∶1)，在37℃水浴箱中進(jìn)行12 h的培養(yǎng)，蛋白質(zhì)多肽混合物制備成功后將其全部?jī)龃嬗?80℃的冰箱中，以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.3二維高pH反相高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù) 應(yīng)用反相色譜柱進(jìn)行樣本色譜的分離和分析，時(shí)限為1 h，洗脫梯度為5%-30%的緩沖液(0.1%FA，99.9%CAN；流速0.3 mL/min)，每分鐘以一個(gè)分?jǐn)?shù)收集洗脫肽，通過串聯(lián)TripleTOF5600質(zhì)譜儀(全掃描分辨率40000，二級(jí)掃描分辨率20000)進(jìn)行相關(guān)的質(zhì)譜分析，鑒定多肽混合物，確保每個(gè)樣本完成三次掃描。結(jié)果上傳至iProx數(shù)據(jù)庫(kù)中。

1.3.4免疫印跡試驗(yàn) 使用免疫印跡試驗(yàn)分析NPM1在18例樣本中的表達(dá)量，以驗(yàn)證NPM1在高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)中的結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NPM1二維高pH反相高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)分析結(jié)果

對(duì)腎癌及癌旁組織進(jìn)行二維高pH反相高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)分析，結(jié)果顯示，樣本中共有差異表達(dá)蛋白23個(gè)，其均滿足蛋白譜圖數(shù)比值≥1和樣本譜圖數(shù)差值≥72這兩個(gè)條件。在23個(gè)腎癌組織差異表達(dá)的蛋白中共有15個(gè)上調(diào)蛋白和8個(gè)下調(diào)蛋白，詳細(xì)內(nèi)容如表1所示。NPM1為上調(diào)蛋白，質(zhì)譜圖結(jié)果見圖1。

表1 腎癌及癌旁組織差異表達(dá)蛋白

圖1 NPM1質(zhì)譜圖結(jié)果

2.2 NPM1免疫印跡試驗(yàn)分析結(jié)果

應(yīng)用免疫印跡試驗(yàn)對(duì)NPM1二維高pH反相高效液相色譜-質(zhì)譜的結(jié)果加以驗(yàn)證，試驗(yàn)表明NPM1的表達(dá)量顯著上調(diào)，明顯高于癌旁組織，如圖2所示。

3 討論

人類NPM基因家族蛋白共包括三種亞型：NPMl、NPM2以及NPM3，其中轉(zhuǎn)錄功能主要通過NPMl實(shí)現(xiàn)[3]，而其余兩種蛋白的轉(zhuǎn)錄和編碼功能尚不可知。NPMl是一種含有294 個(gè)氨基酸的核仁穿梭磷蛋白，快速穿梭功能決定了NPMl能夠參與到眾多細(xì)胞生物學(xué)過程中[4]，例如發(fā)揮組蛋白的分子伴侶功能、對(duì)前核糖體進(jìn)行調(diào)節(jié)的裝配功能、DNA修復(fù)功能、細(xì)胞凋亡功能以及協(xié)助中心體生物的合成功能等，除此之外，NPMl還能同時(shí)參與到腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中[5]，影響惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，既可充當(dāng)原癌基因又能成為抑癌基因。已有研究表明NPMl在突變或持續(xù)高表達(dá)的情況下，可致使急性髓系白血病的發(fā)生[6],為目前與之最具相關(guān)性的蛋白之一[7]。更有研究指出NPMl表觀遺傳的改變可增加前列腺癌的發(fā)病概率[8]。除此之外，NPMl還能通過介導(dǎo)大腸癌、膀胱癌、肺腺癌等癌癥的信號(hào)通路促發(fā)腫瘤耐藥機(jī)制的形成[9-10]，從而加重臨床治療的困難性。NPMl獨(dú)特的生物學(xué)特性，為其能夠成為更多癌癥的候選標(biāo)志物提供了前提。

圖2 NPM1在癌旁組織(A)、腎癌組織(B)中表達(dá)情況

近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展迅猛[11]，已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中檢測(cè)和分析大分子蛋白的重要手段之一[12]。二維高pH反相高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)不僅能夠分析大分子蛋白更能有效的識(shí)別濃度較低的小分子蛋白，特異性和靈敏度較高，具有高通量的特點(diǎn)，是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量的主要方法。

早期腎癌難以通過典型的臨床癥狀被發(fā)現(xiàn)[13]，部分患者在就診時(shí)已為晚期轉(zhuǎn)移性腎癌，即便進(jìn)行放射、化學(xué)治療，也無(wú)法達(dá)到臨床治愈，故新型腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)尤為重要[14]。本研究應(yīng)用二維高pH反相高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)分析18例患者的腎癌及癌旁組織差異表達(dá)蛋白，建立了相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜圖，共有差異表達(dá)蛋白23個(gè)， NPMl為顯著上調(diào)蛋白，然后利用免疫印跡試驗(yàn)對(duì)色譜-質(zhì)譜的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)配對(duì)的癌旁組織中NPMl的表達(dá)量顯著低于腎癌組織中的表達(dá)量，從而能夠說明NPMl可能成為診斷腎癌的新候選腫瘤標(biāo)志物，對(duì)腎癌的形成和發(fā)展具有一定的臨床意義。本研究樣本量較少，因此，在下一階段的工作中，研究組將擴(kuò)大樣本量，繼續(xù)深入探討NPMl在腎癌發(fā)生和發(fā)展中起到的具體機(jī)制，以期為腎癌的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。