魏田利，周立雪，張苗苗，祝天陽，段 寧，肖 楠，趙秀英

(清華大學(xué)附屬北京清華長庚醫(yī)院·清華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)科,北京102218)

急性膽道感染是消化系統(tǒng)常見的急危重癥，主要包括急性膽囊炎和急性膽管炎，多與膽石癥共同存在，互為因果，嚴(yán)重時會導(dǎo)致多個器官功能受損，危及生命[1]。因此，規(guī)范急性膽道感染的診斷和治療，減少急性膽道感染不良事件的發(fā)生，具有重要意義。目前，對急性膽道感染的治療一般是經(jīng)驗(yàn)性用藥，國內(nèi)不同地區(qū)、不同醫(yī)院引起膽道感染的致病菌存在差異，且對抗菌藥物的敏感性亦各具特點(diǎn)[2]，了解引起膽道感染的主要致病菌種類及其耐藥狀況，對臨床經(jīng)驗(yàn)性治療膽道感染時選擇抗菌藥物具有重要意義。本研究回顧性分析了本院近5年所收治的急性膽道感染患者的膽汁培養(yǎng)病原菌及藥敏試驗(yàn)結(jié)果，以期為臨床合理選用抗菌藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

回顧性分析2015年1月-2019年12月在清華長庚醫(yī)院肝膽外科住院的確診并有完整病原學(xué)資料的急性膽道感染患者共189例，其中男性98例，女性91例；年齡范圍20-93歲，平均年齡為(60.1±16.4)歲。其中感染伴發(fā)結(jié)石的患者總共有135例，男性70例，女性65例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會外科學(xué)分會膽道外科學(xué)組急性膽道系統(tǒng)感染的診斷和治療指南(2011年版)所規(guī)定的膽道感染標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.2 試劑與儀器

培養(yǎng)基：血平板，麥康凱平板，沙保羅平板，水解酪蛋白瓊脂(M-H)平板。鑒定和藥敏：VITEK-2 Compact 全自動細(xì)菌鑒定與藥敏儀配套的GN陰性菌鑒定卡、GP陽性菌鑒定卡、AST藥敏卡，紙片擴(kuò)散法(K-B法)藥敏紙片。主要儀器設(shè)備：接種用具，比濁儀，二氧化碳培養(yǎng)箱，真菌培養(yǎng)箱，生物安全柜，顯微鏡，VITEK-2 Compact 全自動細(xì)菌鑒定與藥敏儀(bioMerieux，VITEK-2 Compact 60)，Bruker全自動快速生物質(zhì)譜儀(Bruker，Microflex LT)。

1.3 質(zhì)控菌株

霍氏腸桿菌ATCC700323、宋內(nèi)志賀菌ATCC25931、肺炎鏈球菌ATCC49619、腐生葡萄球菌ATCCBAA750、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC29213、糞腸球菌ATCC29212。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

標(biāo)本采集由經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師進(jìn)行，術(shù)前各項(xiàng)設(shè)備及儀器都經(jīng)嚴(yán)格消毒，術(shù)中穿刺留取膽汁3-5 mL注入無菌培養(yǎng)管中，立即送本院微生物室進(jìn)行接種。培養(yǎng)：嚴(yán)格依據(jù)《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[4]，將送檢標(biāo)本接種于血平板、麥康凱平板或沙保羅平板，放于35℃ 二氧化碳培養(yǎng)箱或真菌培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。鑒定：挑取純的單個菌落，主要采用VITEK-2 Compact全自動細(xì)菌鑒定與藥敏儀進(jìn)行鑒定，補(bǔ)充方法采用Bruker全自動快速生物質(zhì)譜儀鑒定。藥敏試驗(yàn)：主要采用VITEK-2 Compact全自動細(xì)菌鑒定與藥敏儀進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，補(bǔ)充采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)做頭孢哌酮/舒巴坦的藥敏試驗(yàn)。藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)判讀[5]。數(shù)據(jù)采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，剔除重復(fù)菌株，對同一患者多次分離到同一種細(xì)菌者僅納入首次分離株。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

2015年1月-2019年12月肝膽外科急性膽道感染患者共189例，送檢的膽汁培養(yǎng)陽性150例，陽性率79.4%，其中有51.3%(77/150)的病例為混合感染(膽汁培養(yǎng)出2種及以上致病菌)。189例住院患者中，男性98例，女性91例，培養(yǎng)的陽性率分別為83.7%(82/98)和74.7%(68/91)。

2.2 膽汁培養(yǎng)病原菌分布

從培養(yǎng)陽性的膽汁中共分離出298株致病菌，半數(shù)的分離致病菌為腸桿菌科細(xì)菌占50%(149/298)，腸球菌屬占第二位為24.8%(74/298)，非發(fā)酵菌屬占第三位為13.1%(39/298)，其他還包括弧菌與氣單胞菌屬，葡萄球菌屬和真菌等，值得注意的是還分離出3株專性厭氧菌(分別為變形梭桿菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌，放線菌)。菌屬構(gòu)成比見表1。298株致病菌中革蘭陰性菌207株，占69.5%；革蘭陽性菌84株，占28.2%；真菌7株，占2.3%。引起膽道感染的革蘭陰性菌主要是大腸埃希菌，肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌，占陰性菌的66.2%(137/207)；革蘭陽性菌主要是糞腸球菌和屎腸球菌，占陽性菌的64.3%(54/84)；真菌均為念珠菌，以白色念珠菌(57.1%)多見。298株致病菌中排名前5位的致病菌依次為大腸埃希菌68株(22.8%)，肺炎克雷伯菌44株(14.8%)，屎腸球菌36株(12.1%)，銅綠假單胞菌25株(8.4%)，糞腸球菌18株(6.0%)。病原菌分布與構(gòu)成見表2。

2.3 感染與伴發(fā)結(jié)石的分析

189例急性膽道感染患者中伴發(fā)結(jié)石的有135例，占總例數(shù)的71.4%，膽汁培養(yǎng)陽性106例，陽性率78.5%。不伴發(fā)結(jié)石的膽道感染患者54例，培養(yǎng)陽性44例，膽汁培養(yǎng)陽性率81.4%，兩組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組的膽汁培養(yǎng)病原菌排在前5位的依次是大腸埃希菌，肺炎克雷伯菌，屎腸球菌，銅綠假單胞菌，糞腸球菌。

2.4 致病菌耐藥表型分析

分析主要致病菌的耐藥表型：大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)檢出率分別為60.3%(41/68)和47.7%(21/44)，占所有腸桿菌科細(xì)菌的41.6%(62/149)。檢出耐碳青霉烯酶(CRE)的大腸埃希菌3株和肺炎克雷伯菌5株，占所有腸桿菌科細(xì)菌的5.4%(8/149)。檢出耐碳青霉烯酶的銅綠假單胞菌(CRPA)5株，占所有銅綠假單胞菌的20%(5/25)。耐萬古霉素的屎腸球菌(VRE)檢出1株。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，頭孢菌素類藥物兩者都以頭孢替坦敏感性最優(yōu)；從β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑來看，哌拉西林/他唑巴坦的抑菌活性最優(yōu)，耐藥率分別為5.9%和13.6%，其次是頭孢哌酮/舒巴坦。對于肺炎克雷伯菌，喹諾酮類抗生素的抑菌活性好于大腸埃希菌。碳青霉烯類抗生素對兩者都表現(xiàn)出較好的抑菌活性，不同的是，相對于大腸埃希菌，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率稍高。大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率分別為4.4%和11.4%。膽汁分離的非發(fā)酵菌以銅綠假單胞菌最為多見。銅綠假單胞菌對常見抗生素普遍敏感，對氨基糖苷類藥物、喹諾酮類藥物的體外測試均全部敏感。對頭孢類藥物和碳青霉烯類藥物的耐藥率均低于25%。詳見表3。

對青霉素類和左氧氟沙星藥物的耐藥率，屎腸球菌普遍高于糞腸球菌。對兩種腸球菌敏感性都較好的是萬古霉素和利奈唑胺，檢出耐萬古霉素的屎腸球菌1株，未檢出耐萬古霉素的糞腸球菌。屎腸球菌和糞腸球菌均未檢出對利奈唑胺耐藥。詳見表4。

3 討論

一般情況下，正常人的膽汁是無菌的，但是由于膽汁流通路徑均為細(xì)長型管道，其解剖位置、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及生理特性使其極易發(fā)生感染。眾多因素可引起急性膽道感染，如各種因素造成的膽道梗阻、膽道損傷等。膽石癥與膽道感染的關(guān)系極為密切，二者互為因果，相互作用。膽道感染患者中60%-70%患有膽石癥[6]，主要原因是結(jié)石易引起膽汁排泄不暢，進(jìn)而導(dǎo)致腸道內(nèi)細(xì)菌逆行至膽道系統(tǒng)，當(dāng)侵入膽道的病原菌在膽道內(nèi)異常增殖時則可引起膽道感染[7]。本研究中，189例急性膽道感染患者中伴發(fā)結(jié)石的有135例，占總例數(shù)的71.4%，與往年數(shù)據(jù)基本接近，膽汁培養(yǎng)陽性率78.5%；但是不伴發(fā)結(jié)石的急性膽道感染患者膽汁培養(yǎng)陽性率81.4%，略高于伴發(fā)結(jié)石組，這與武志熊等人的研究報道相一致[8]。急性非結(jié)石性膽道感染的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，包括解剖性和功能性因素引起的膽囊缺血、膽汁排泄障礙和繼發(fā)細(xì)菌感染[9]。

表4 膽汁培養(yǎng)主要革蘭陽性菌對常用抗菌藥物的耐藥情況

有研究顯示，膽汁細(xì)菌培養(yǎng)陽性率為22.6%-75.1%，差異較大[10]。本研究所選樣本為本院近5年肝膽外科急性膽道感染患者，送檢的膽汁細(xì)菌培養(yǎng)陽性率為79.4%，培養(yǎng)陽性率較其他報道偏高[11]。由于膽道與腸道相通，膽道感染時致病菌主要來自于腸道細(xì)菌的逆行性感染，因而膽汁中分離所得致病菌譜與腸道內(nèi)正常菌譜大致吻合[12]，革蘭陰性菌以大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等為主，革蘭陽性菌以糞腸球菌、屎腸球菌等為主[13]，與以往研究結(jié)果相似。

本研究數(shù)據(jù)表明，急性膽道感染分離致病菌主要以革蘭陰性細(xì)菌為主，占69.5%，提示對臨床懷疑急性膽道感染的患者，經(jīng)驗(yàn)用藥宜選用針對革蘭陰性細(xì)菌者。革蘭陰性菌中，主要構(gòu)成是大腸埃希菌，肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌，占陰性菌的66.2%；革蘭陽性菌主要是腸球菌屬(占總數(shù)的24.8%)，以糞腸球菌和屎腸球菌為主，占陽性菌的64.3%；真菌感染以白色念株菌和熱帶念珠菌多見。膽汁培養(yǎng)陽性率和細(xì)菌構(gòu)成與以往研究大致趨勢相同，但也稍有差異[14-16]；這些差異也體現(xiàn)出膽道感染患者膽汁中的病原菌分布及構(gòu)成受地域、環(huán)境等因素的影響較為明顯[2]。值得注意的是膽道感染病原菌雖然仍以腸源性細(xì)菌為主，如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、屎腸球菌、糞腸球菌等，但醫(yī)院感染菌，如銅綠假單胞菌也占一定比例(占總數(shù)的8.4%)。銅綠假單胞菌等非發(fā)酵菌的檢出，可能與廣泛開展內(nèi)鏡、T 管引流等侵入性醫(yī)療操作從而導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)感染有關(guān)。厭氧菌檢出率較低，可能與本院送檢膽汁標(biāo)本多為需氧培養(yǎng)有關(guān)。如果涂片鏡檢有菌而普通需氧培養(yǎng)陰性，提示厭氧菌感染，應(yīng)引起重視。另外膽汁培養(yǎng)出兩種及以上病原菌例數(shù)占總例數(shù)的51.3%，提示膽道感染很大比例為混合感染，增加了病情的復(fù)雜性和難治性。

大腸埃希菌是膽汁培養(yǎng)中最常見的細(xì)菌，其藥物敏感性頗受關(guān)注。本次研究數(shù)據(jù)表明超過半數(shù)的大腸埃希菌對喹諾酮類抗生素耐藥，左氧氟沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為63.2%和64.7%，而張錕等的數(shù)據(jù)也表明腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥率從2011年到2014年呈逐年上升的趨勢[17]，這可能和喹諾酮類藥物的大量使用有關(guān)。另外需要臨床引起注意的是此次共檢出產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶的腸桿菌62株，占所有腸桿菌科細(xì)菌的41.6%。雖然目前碳青霉烯類耐藥菌株(CRE)數(shù)量不多(近5年共8株)，但一旦出現(xiàn)，治療困難，且患者病死率很高，應(yīng)引起高度重視。非發(fā)酵菌占膽汁分離菌的較少(占總數(shù)的13.1%)，其中最常見的是銅綠假單胞菌，對常見抗生素普遍敏感，本組中銅綠假單胞菌對頭孢類藥物、氨基糖苷類藥物、喹諾酮類藥物和碳青霉烯類藥物的耐藥率均低于25%。目前未檢出廣泛耐藥的銅綠假單胞菌(MDR-PA)，但臨床和感控部門也應(yīng)高度警惕，防止耐藥性強(qiáng)的銅綠假單胞菌的出現(xiàn)及院內(nèi)感染的流行。

近年來隨著抗菌藥物種類的不斷增加和廣泛應(yīng)用，腸球菌屬引起的膽道感染也日益增多[18]。在本研究中，膽道感染患者的膽汁中腸球菌屬同樣有較高的檢出率，達(dá)24.8%，與趙水娣等的文獻(xiàn)報道相似[19]。其中屎腸球菌最常見，其次是糞腸球菌。既往文獻(xiàn)報道腸球菌對頭孢類、 喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類藥物都存在一定的耐藥[17]，本研究提示屎腸球菌除萬古霉素、利奈唑胺保持較高的敏感性外，對青霉素、氨芐西林、左氧氟沙星等抗菌藥物的耐藥率明顯高于糞腸球菌。萬古霉素是目前臨床常用的被認(rèn)為對革蘭陽性菌最有效的抗生素之一，既往有研究提示其對膽道革蘭陽性菌的耐藥率低至0[20]，但近幾年文獻(xiàn)報道[14]和本次研究提示已有一定程度耐藥率，應(yīng)引起重視。

綜上所述，引起膽道感染的致病菌，仍以大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和腸球菌屬等腸源性細(xì)菌為主,非發(fā)酵菌如銅綠假單胞菌等易引起院內(nèi)感染的病原菌也占一定比例。耐藥性強(qiáng)的CRE 和VRE菌的出現(xiàn)增加了臨床治療的難度和復(fù)雜性。需要臨床醫(yī)師和檢驗(yàn)技師的配合，盡早明確致病菌，結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇恰當(dāng)?shù)目咕幬?，避免出現(xiàn)雙重感染或細(xì)菌耐藥。