劉 妍，張萍淑，2，吳宗武，王賀永，張淑青，元小冬，2*

(1.華北理工大學(xué)附屬開灤總醫(yī)院 a.神經(jīng)內(nèi)科;b.檢驗(yàn)科,河北 唐山063000;2.河北省神經(jīng)生物機(jī)能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山063000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)是引發(fā)各種類型院內(nèi)感染和社區(qū)獲得性感染最主要的病原菌，在病房環(huán)境中有著很強(qiáng)的傳播和定植能力[1-2]。研究指出肺炎克雷伯菌易于在抗菌藥物的選擇性壓力下產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)，而且產(chǎn)ESBLs的病菌質(zhì)粒上可以有喹諾酮類、氨基糖苷類等多種耐藥基因，對多種抗菌藥物產(chǎn)生多藥耐藥甚至泛藥耐藥性，并且可通過染色體垂直克隆及質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移等方式進(jìn)行傳播，引起相當(dāng)嚴(yán)重的醫(yī)院感染[3]。本研究擬通過肺炎克雷伯菌株染色體及質(zhì)粒中DNA攜帶的主要耐藥基因型檢測，同時(shí)結(jié)合抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，研究肺炎克雷伯菌攜帶的耐藥基因特征與臨床耐藥性的關(guān)系，從而明確耐藥基因的傳播特征，以指導(dǎo)臨床感染的防控及臨床抗菌藥物的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方法收集某三甲醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科重癥監(jiān)護(hù)病房(Neurological intensive care unit,NICU)中2015年1月-2018年12月住院的感染患者，對引發(fā)感染的KP病原菌以及此類感染患者居住病房的病床單位和空氣環(huán)境中肺炎克雷伯菌的分布狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測。同時(shí)，對于入選本項(xiàng)研究的NICU病房空氣環(huán)境的KP定植情況進(jìn)行常規(guī)監(jiān)測。

1.2 感染患者的樣本采集

NICU中診斷感染的患者，依照規(guī)范化實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)于24 h內(nèi)進(jìn)行病原學(xué)檢查，采集與感染部位相關(guān)的(血、尿、便、痰或其他分泌物)標(biāo)本送檢。

1.3 NICU環(huán)境監(jiān)測的樣本采集

1.3.1NICU感染患者病房環(huán)境的細(xì)菌學(xué)監(jiān)測 在患者確診感染后24 h內(nèi)對確認(rèn)感染患者的周圍空氣和包括床頭柜表面、病人的枕頭、被子表面的病床單位環(huán)境，按照規(guī)定程序使用采樣器進(jìn)行感染環(huán)境的樣本采集。

1.3.2NICU病房常規(guī)空氣環(huán)境的細(xì)菌學(xué)監(jiān)測 對于NICU病房的空氣環(huán)境，按照規(guī)定的操作流程于每個(gè)月第2和4周的周二上午9:00-10:00對病房(6人間、2人間各1個(gè)房間)空氣環(huán)境進(jìn)行常規(guī)的樣本采集。

1.4 細(xì)菌的培養(yǎng)、鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)

將NICU感染患者周圍環(huán)境、常規(guī)空氣環(huán)境中采集的標(biāo)本于37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，計(jì)算細(xì)菌菌落數(shù)，革蘭氏染色確定其革蘭氏屬性，對不同種類的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。分離培養(yǎng)的菌株用全自動細(xì)菌鑒定儀依據(jù)《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第三版)進(jìn)行菌種鑒定，收集感染患者臨床標(biāo)本中首次分離和環(huán)境中定植的KP菌株，在-80℃專用冰箱中保留備用。依據(jù)CLSI/NCCLS標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行K-B紙片法測定21種臨床常用抗菌藥物的敏感性并進(jìn)行ESBLs表型確證試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控菌株為ATCC700603。

1.5 KP的耐藥基因檢測

1.5.1細(xì)菌的染色體模板制備 將KP菌株的菌落搗碎懸浮于雙蒸水600 μL中,100℃煮沸15 min，12 000 rpm，離心5 min，吸取上清液作為模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2細(xì)菌的質(zhì)粒模板制備 KP菌株接種于9 mL LB肉湯培養(yǎng)液中，放于37℃水浴箱中避光震蕩培育18 h后，嚴(yán)格依據(jù)質(zhì)粒小提中量試劑盒(天根生物科技有公司)標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取質(zhì)粒DNA，得到的質(zhì)粒DNA經(jīng)瓊脂凝膠電泳法確證后，放置于-20℃冰箱中保留備用。

1.5.3目標(biāo)基因檢測 運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增法(PCR)，對β-內(nèi)酰胺類(SHV、TEM、CTX-M、IMP、KPC、OXA-1-like)、喹諾酮類[qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-Ib-cr]藥物的耐藥基因進(jìn)行檢測。(1)染色體DNA擴(kuò)增體系(共25 μL)：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,模板DNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 9.5 μL。(2)質(zhì)粒DNA擴(kuò)增體系(共25 μL)：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,模板DNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 8.5 μL。熱循環(huán)反應(yīng)程序：95℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 μL。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯現(xiàn)出與目的基因片段大小完全相同條帶者判定為陽性。引物序列及擴(kuò)增片段大小參照文獻(xiàn)[4]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2007建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NICU的病原學(xué)和病房環(huán)境采樣標(biāo)本的KP監(jiān)測結(jié)果

共檢測到非重復(fù)KP菌株106株，來源于臨床病原學(xué)標(biāo)本93株(標(biāo)本類型為痰88份、血1份、陰道分泌物1份、尿液3份)、感染患者的周圍病房環(huán)境標(biāo)本11株(非KP類感染患者的周圍空氣環(huán)境監(jiān)測標(biāo)本3株、KP類感染患者的周圍空氣環(huán)境監(jiān)測標(biāo)本4株、非KP類感染患者的床頭柜監(jiān)測標(biāo)本1株、KP類感染患者的被子表面1株、非KP類感染患者的被子表面1株、KP類感染患者的枕頭表面1株)、病房空氣環(huán)境常規(guī)監(jiān)測標(biāo)本2株。

2.2 KP的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果(見表1)

全部KP中ESBLs(-)菌株包括84株患者感染的病原菌株和12株環(huán)境采集標(biāo)本菌株，呈現(xiàn)對氨芐西林100%耐藥，哌拉西林56.25%耐藥，而對其他抗菌藥物高度敏感。ESBLs(+)菌株包括9株患者感染的病原菌和1株環(huán)境中采集的菌株。

表1 KP菌株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果[n(%)]

2.3 KP的耐藥基因檢測結(jié)果

2.3.1病原性及環(huán)境定植KP染色體與質(zhì)粒中DNA的耐藥基因檢測結(jié)果比較 (1)病原性KP質(zhì)粒DNA組與染色體DNA組耐藥基因檢測結(jié)果比較β-內(nèi)酰胺類中CTX-M-2(χ2=5.534，P=0.019)具有差異；OXA-1-like(χ2=14.39，P=0.002)具有顯著差異；喹諾酮類中qnrA(χ2=12.9，P=0.003)、aac(6′)-Ib-cr(χ2=12.5，P<0.001)具有顯著差異。(2)環(huán)境定植KP染色體DNA耐藥基因與質(zhì)粒DNA組耐藥基因檢測結(jié)果比較β-內(nèi)酰胺類中KPC(χ2=11.424，P=0.007)、SHV(χ2=34.882，P<0.001)、TEM(χ2=22.012，P<0.001)、IMP(χ2=8.589，P=0.003)、CTX-M-1(χ2=11.424，P=0.007)具有顯著差異，CTX-M-2(χ2=5.307，P=0.021)具有差異；喹諾酮類qnrB(χ2=4.751，P=0.029)具有差異，aac(6′)-Ib-cr(χ2=8.589，P=0.003)具有顯著差異。見表2。

表2 病原性及環(huán)境定植KP染色體與質(zhì)粒中DNA的耐藥基因檢測結(jié)果[n(%)]

2.3.2產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs KP菌株染色體DNA攜帶耐藥基因與質(zhì)粒攜帶耐藥基因結(jié)果比較 (1)產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs KP菌株質(zhì)粒DNA耐藥基因攜帶陽性率結(jié)果相比β-內(nèi)酰胺類中KPC(χ2=8.665，P=0.003)、TEM(χ2=75.947，P<0.001)、IMP(χ2=27.121，P<0.001)、CTX-M-1(χ2=24.533，P<0.001)、CTX-M-9(χ2=90.133，P<0.001)具有顯著差異；喹諾酮類中qnrS(χ2=22.816，P<0.001) 、aac(6′)-Ib-cr(χ2=11.171，P<0.001)具有顯著差異；(2)產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs KP菌株染色體DNA耐藥基因攜帶陽性率結(jié)果相比β-內(nèi)酰胺類中KPC(χ2=8.665，P=0.003)、SHV(χ2=10.653，P=0.001)、TEM(χ2=54.319，P<0.001)、IMP(χ2=17.239，P<0.001)、CTX-M-9(χ2=104.637，P<0.001)具有顯著差異；CTX-M-2(χ2=5.534，P=0.019)具有差異；喹諾酮類中qnrA(χ2=8.665，P=0.003)、qnrS (χ2=39.046，P<0.001)、aac(6′)-Ib-cr(χ2=32.637，P<0.001)具有顯著差異。見表3。

表3 產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs KP菌株質(zhì)粒及染色體DNA耐藥基因攜帶陽性率結(jié)果[n(%)]

3 討論

KP是腸桿科菌中最常見的致病菌，同時(shí)也是神經(jīng)危重癥患者的主要治病菌之一，影響因素多，了解其臨床耐藥特征及其變化規(guī)律，控制其感染，成為臨床關(guān)注的重點(diǎn)[5-6]。通過對NICU中KP臨床耐藥性的監(jiān)測與分析，了解NICU中KP耐藥基因的遺傳機(jī)制、傳播特點(diǎn)，才能減少其臨床耐藥性產(chǎn)生，有效控制KP的傳播。

產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌耐藥率高，耐藥形勢嚴(yán)峻，SHV是重要的基因分型[7-8]。本研究結(jié)果顯示全部KP均對氨芐西林耐藥，對哌拉西林的耐藥率也較高。染色體DNA上β-內(nèi)酰胺類SHV耐藥基因，在病原性KP中陽性率高達(dá)96%，在環(huán)境檢出KP中陽性率達(dá)77%；位于第二位的CTX-M-2耐藥基因，在病原性KP中陽性率為16%，在環(huán)境檢出KP中陽性率為23%；位于第三位的TEM和位于第四位的KPC，在病原性KP中陽性率為9.67%和8.6%，但是這兩種耐藥基因在環(huán)境檢出KP中均未檢測到。其他目標(biāo)基因的檢出率更低，甚至檢測不到。本研究結(jié)果與Ashayeri-Panah M的研究結(jié)果相似[9]。所以，KP染色體DNA上攜帶β-內(nèi)酰胺類SHV基因是其對氨芐西林、哌拉西林高度耐藥的重要原因。

質(zhì)粒是捕捉、傳播耐藥基因的重要載體，在耐藥基因水平傳播中發(fā)揮著重要作用[10-11]。本研究結(jié)果顯示病原性KP和環(huán)境檢出KP的質(zhì)粒中均有β-內(nèi)酰胺類SHV基因，也可檢測出KPC、CTX-M-2、CTX-M-9、OXA-1-like、TEM、CTX-M-1、IMP基因。并且，病原性KP質(zhì)粒上的OXA-1-like、CTX-M-2基因的陽性率與環(huán)境檢出KP質(zhì)粒中的陽性率無明顯差異，但卻明顯高于其染色體DNA該耐藥基因的陽性率。同時(shí)，在ESBLs(+)和(-)KP質(zhì)粒中也均檢測到這些基因。提示這些β-內(nèi)酰胺類基因在ESBLs(+)和(-)KP株中均與質(zhì)粒的水平傳播有關(guān)。病原性KP和環(huán)境檢出KP的質(zhì)粒中均沒有發(fā)現(xiàn)喹諾酮類qnrA基因，但是acc(6′)-Ib-cr基因在質(zhì)粒中的陽性率卻明顯高于染色體DNA，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)ESBLs(+)KP質(zhì)粒中acc(6′)-Ib-cr和qnrS基因的陽性率均明顯高于ESBLs(-)KP，說明喹諾酮類qnrA基因通常不通過質(zhì)粒在病房環(huán)境進(jìn)行水平傳播；而acc(6′)-Ib-cr等其他基因具有很強(qiáng)的質(zhì)粒水平傳播能力，是產(chǎn)生KP耐藥性及其傳播的重要途徑。研究表明ESBLs(+)KP的質(zhì)粒上喹諾酮類耐藥基因aac(6′)-Ib-cr檢出率很高，并且aac(6′)-Ib-cr耐藥基因可以通過質(zhì)粒水平傳播，造成KP的流行[12-13]。

研究表明產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌中最常見的ESBL耐藥基因是CTX-M[14-15]。本研究結(jié)果顯示染色體DNA上KPC耐藥基因在ESBLs(+)的KP中陽性率為20%，在ESBLs(-)的KP中陽性率為6.25%；β-內(nèi)酰胺類CTX-M-9耐藥基因在ESBLs(+)的KP中陽性率為70%，但在ESBLs(-)的KP中未檢測出。然而，喹諾酮類qnrS、acc(6′)-Ib-cr、qnrA耐藥基因在ESBLs(+)的KP中檢出率分別為60%、40%、20%，均明顯高于ESBLs(-)的KP菌株。所以，KP染色體DNA所攜帶的β-內(nèi)酰胺類CTX-M-9基因和喹諾酮類qnrS、acc(6′)-Ib-cr、qnrA等多種基因均與產(chǎn)ESBLs的垂直遺傳傳播有關(guān)。

由此可見，KP染色體DNA上攜帶β-內(nèi)酰胺類SHV基因是其對氨芐西林、哌拉西林高度耐藥的重要原因；產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的克隆播散與其攜帶的β-內(nèi)酰胺類KPC、CTX-M-9、TEM基因和喹諾酮類qnrA、acc(6′)-Ib-cr等基因有關(guān)；此外，無論病原性還是環(huán)境KP質(zhì)粒均有β-內(nèi)酰胺類基因，所以β-內(nèi)酰胺類的SHV、CTX-M-2、KPC、TEM、IMP、CTX-M-9和喹諾酮類acc(6′)-Ib-cr等基因還與質(zhì)粒水平播散有關(guān)。采取積極有效的NICU病房環(huán)境消毒滅菌方案、加強(qiáng)NICU接觸隔離措施，減少KP的水平傳播，是預(yù)防交叉感染和防控KP臨床耐藥性產(chǎn)生和傳播重要措施。