黃 苓，孫 震，曾小群*，潘道東，何 俊，沈建良

（1 省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室 浙江寧波315211 2 浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院 浙江寧波315211 3 浙江卓旺農(nóng)業(yè)科技有限公司 浙江湖州313014）

臘肉是我國一種傳統(tǒng)自然發(fā)酵肉制品，其色澤明艷、風(fēng)味獨特，易加工貯藏而深受大眾喜愛。然而，目前中國傳統(tǒng)腌臘制品的生產(chǎn)面臨許多問題，主要包括：腌制配方不合理，食鹽和亞硝酸鹽添加量過高[1]；加工工藝落后，設(shè)備簡陋，生產(chǎn)周期長[2]；保鮮技術(shù)單一，完全依賴高鹽、低水分的保藏方法，使產(chǎn)品質(zhì)地干硬，口感偏咸等[3]，其中以亞硝酸鹽含量過高尤為突出。雖然亞硝酸鹽在肉制品中具有呈色、抑菌、改善風(fēng)味口感、抗氧化等作用[4]，然而，經(jīng)常攝入會引起中毒及致癌風(fēng)險，人體一次攝入0.3～0.5 g 亞硝酸鹽即可引起中毒，5 g 便導(dǎo)致死亡[5]。很多研究人員致力于低鹽、低硝臘肉加工工藝的改進工作[6-7]，然而，目前的工藝所生產(chǎn)的臘肉與傳統(tǒng)臘肉相比風(fēng)味欠佳。風(fēng)味是影響肉制品質(zhì)量的重要因素之一，臘肉的加工不再以貯藏為首要目的，其安全性、獨特風(fēng)味等成為人們的關(guān)注點，制備安全、高品質(zhì)和風(fēng)味好的零添加亞硝酸鹽臘肉為當(dāng)務(wù)之急。

本研究通過添加發(fā)酵乳桿菌RC4 （能高效降解亞硝酸鹽，以體積分?jǐn)?shù)0.2%的接種量接種于亞硝酸鹽含量為150 mg/L MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，亞硝酸鹽的降解率高達96.49%，其中降解速率最快能達13.88 mg/h[8]）和植物乳桿菌B6（對致病性金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門菌、單核細胞性李斯特菌、熒光假單胞菌和大腸桿菌均有顯著的抑制效果[9]）的復(fù)配發(fā)酵劑、紅曲紅和甜菜紅組合的復(fù)配天然發(fā)色劑、Nisin、維生素E 以及各種調(diào)味物質(zhì)，替代亞硝酸鹽制得零添加亞硝酸鹽臘肉。通過對零添加亞硝酸鹽臘肉、只添加食鹽腌制的臘肉、添加食鹽和亞硝酸鹽腌制的臘肉的感官評價、亞硝酸鹽含量、總體氣味和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行分析，得到本試驗制得的零添加亞硝酸鹽臘肉的風(fēng)味特征，評價其制備方法，為零添加亞硝酸鹽腌臘制品的規(guī)模化生產(chǎn)及品質(zhì)優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵乳桿菌 （Lactobacillus fermentum）RC4、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）B6，兩者都分離自新疆酸馬奶，實驗室保存；新鮮后腿肉，購于加貝超市；亞硝酸鹽快速檢測試劑盒，南京建成科技有限公司；其它化學(xué)試劑（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite 200 pro 全波長掃描多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan 公司；7890B-7000C 氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；PEN 3 型電子鼻，德國Airsense 公司；50 μm PDMS/DVB （聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯）型萃取頭，美國Supelco 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備 零添加亞硝酸鹽臘肉（試驗組）制備工藝流程：選取新鮮的后腿肉→處理豬肉（1 寸厚，7 寸長）→腌制液的制備→腌制（4℃，12 h）→風(fēng)干（10 ℃，12 h）→接種復(fù)合菌種發(fā)酵（19 ℃，25 h）→烘干（50 ℃，24 h）→噴灑乳酸鏈球菌素→冷卻后真空包裝→成品。

腌制液成分：食鹽3%、生抽5%、黃酒2%、白砂糖2%、花椒粉1%、大蒜1%、檸檬汁1%、茴香粉0.75%、八角粉0.6%、生姜粉0.6%、桂皮粉0.6%、維生素E 0.03%、0.2 g/kg 的紅曲紅和24 mg/kg 的甜菜紅（所有輔料添加的百分含量均以肉重計）。

對照組1：添加3%的食鹽腌制的后腿肉；對照組2：添加3%的食鹽和0.01%亞硝酸鹽腌制的后腿肉：上述兩組臘肉在19 ℃的條件下自然發(fā)酵且不經(jīng)過噴灑抑菌素處理。其余加工過程與試驗組相同。

1.3.2 感官評定 感官評價小組由20 人組成，包括教師、研究生、本科生，男女比例1∶1，年齡18～45 周歲，均有1年以上的腌臘肉制品感官評定經(jīng)驗。具體實施方法參照GB/T 22210-2008《肉與肉制品感官評定規(guī)范》[10]。所有的樣品從外觀、味道、氣味、質(zhì)地和總體可接受性5 個方面進行打分，評分范圍0～100，取其平均值繪制感官評價雷達圖。

1.3.3 亞硝酸鹽含量的測定 亞硝酸鹽含量采用南京建成快速檢測試劑盒進行測定。

1.3.4 電子鼻檢測 參考李迎楠等[11]的方法測定，分別稱取5 g 切碎的臘肉樣品到樣品瓶中，壓蓋密封，在25 ℃條件下水浴10 min 后用于電子鼻檢測。

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定及分析 色譜條件：Vocol 毛細管色譜柱 （柱長60 m，內(nèi)徑0.32 mm，膜厚0.18 μm）；載氣He 流速為2.25 mL/min；進樣口溫度210 ℃，不分流進樣模式；采用程序升溫，初始溫度為35 ℃，保持3 min，以3 ℃/min 上升到40 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min 上升到200℃，保持20 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源；接口溫度230 ℃；電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍設(shè)定為40～600 u；采用全掃描模式。

定性分析：質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計算機檢索，與NIST14 標(biāo)準(zhǔn)譜庫相匹配，僅報道得分大于80（總分為100）的鑒定結(jié)果。

定量分析：各揮發(fā)性成分的含量按下式計算[21]（內(nèi)標(biāo)物為2-甲基-3-庚酮）。

式中：CX——未知揮發(fā)性化合物含量，μg/kg；C0——內(nèi)標(biāo)化合物質(zhì)量濃度，μg/μL；V0——內(nèi)標(biāo)化合物進樣體積，μL；SX——未知揮發(fā)性化合物峰面積，AU·min；S0——添加內(nèi)標(biāo)化合物峰面積，AU·min；m——試樣質(zhì)量，kg。

1.3.6 OAV 分析 采用OAV 評價各化合物對臘肉總體風(fēng)味的貢獻；0.1＜OAV＜1，說明該物質(zhì)對總體風(fēng)味有修飾作用；OAV＞1，說明該物質(zhì)可能對總體風(fēng)味有直接影響；在一定范圍內(nèi)，OAV 越大說明該物質(zhì)對總體風(fēng)味貢獻越大。OAV 按下式進行計算[12]：

式中：C——物質(zhì)含量，μg/kg；T——感覺閾值，μg/kg。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 采用電子鼻自帶軟件Winmuster 對原始數(shù)據(jù)進行處理和作圖，使用IBM SPSS Statistics 21 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用±s 表示，使用Duncan’s Multiple Range Test 進行多組樣本間顯著性差異分析，差異顯著水平設(shè)置為P＜0.05。試驗結(jié)果采用Origin 8.5 作圖。所有指標(biāo)均重復(fù)測定5次。

2 結(jié)果與討論

2.1 感官評價

如圖1所示，試驗組的感官評分顯著高于其它組（P＜0.05），其總體可接受度評分高達90.5。與對照組相比，試驗組臘肉內(nèi)外顏色均勻鮮艷，富有食欲，外觀接受度最高，顯著優(yōu)于其它組臘肉；對照組1 和對照組2 的外部顏色均偏黃，內(nèi)部分別泛白和偏粉紅，顏色不均一，視覺可接受度不佳；市售組醬油色過重，外部偏褐色，內(nèi)部呈粉紅色。因此3 組臘肉的外觀感官評分結(jié)果顯示：試驗組＞對照組2＞對照組1。在口感方面，試驗組咸淡適中，咀嚼的過程中夾雜著香辛料所散發(fā)的香氣，不油不膩，硬軟適中；對照組1 和對照組2 口感略低于試驗組，咀嚼后味偏咸，其中對照組1 肉香味不濃郁，對照組2 雖肉香味適中，但缺少香辛料所賦予的獨特色香氣。

2.2 亞硝酸鹽含量

如圖2所示，試驗組、對照組1、對照組2 中的亞硝酸鹽含量具有顯著差異（P＜0.05），分別為0.64，1.31，22.93 mg/kg。其中，對照組2 的含量最高，這是由于其外源添加了亞硝酸鹽所致。亞硝酸鹽含量超標(biāo)是腌臘肉制品中首要的安全性問題，除了食物腌制過程中外源添加的亞硝酸鹽外，微生物的胺化和硝化作用也能將肉制品中的含氮物質(zhì)轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽。試驗組和對照組1 中也存在亞硝酸鹽，但試驗組中的亞硝酸鹽含量顯著低于對照組1（P＜0.05），這與臘肉加工過程中使用復(fù)配菌株發(fā)酵有關(guān)。Esmaeilzadeh 等[13]將植物乳桿菌PTCC 1058，發(fā)酵乳桿菌PTTC 1638 及兩株菌組成混合發(fā)酵劑接種到發(fā)酵香腸上，發(fā)現(xiàn)香腸中殘留亞硝酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)別降低86.6%，76.1%，81.9%。此外，Kilic 等[14]研究表明pH 值與亞硝酸鹽殘留量呈正相關(guān)。在B6 和RC4 發(fā)酵產(chǎn)酸的條件下，RC4 能夠快速降解亞硝酸鹽從而降低臘肉中亞硝酸鹽殘留量。

2.3 電子鼻測定結(jié)果與分析

圖3為3 種臘肉的電子鼻主成分分析結(jié)果圖。第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為99.41%，0.45%，累計貢獻率達到99.86%，接近100%，這說明第一主成分和第二主成分已經(jīng)解釋了幾乎全部的變異，可用來分析3 種臘肉制品的總體氣味。在由第一主成分和第二主成分組成的平面上，試驗組在第一主成分上的貢獻明顯大于對照組1 和對照組2；而在第二主成分上無明顯差異。這說明試驗組與對照組1、對照組2 的總體氣味差距較大。此外，對照組1 和對照組2 在第一主成分和第二主成分上的貢獻均僅有微小差異。說明對照組1 和對照組2 的總體氣味較為相似。為進一步探究3 種臘肉氣味成分的差別，采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對3 種臘肉中的揮發(fā)性成分進行鑒定。

圖1 3 種臘肉感官評價雷達圖Fig.1 The sensory evaluation radar chart of three kinds of cured meat

圖2 3 種臘肉中亞硝酸鹽含量Fig.2 The nitrite content of three kinds of cured meat

圖3 3 種臘肉電子鼻主成分結(jié)果圖Fig.3 Principal component result of electronic nose of three kinds of cured meat

2.4 3 種臘肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對3種臘肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行鑒定，各組臘肉中揮發(fā)性成分的組成和含量如表1所示。3 組臘肉中共鑒定出揮發(fā)性成分73 種，包括烴類12 種、酸類5 種、酯類14 種、醛類13 種、酮類10 種、醇類11 種、酚類2 種、醚類2 種、其它類4 種。

試驗組中共鑒定出揮發(fā)性成分71 種，總含量為2 939.68 μg/kg，其中醚類（982.22 μg/kg）、烴類（623.17 μg/kg）、醛類（456.53 μg/kg）為主要揮發(fā)性成分。對照組1 中共鑒定出揮發(fā)性成分64 種，總含量為1 636.28 μg/kg，其中酮類（479.50 μg/kg）、醛類（445.65 μg/kg）、醇類（316.46 μg/kg）為主要揮發(fā)性成分。對照組2 中共鑒定出揮發(fā)性成分66種，總含量為667.15 μg/kg，其中酮類（382.62 μg/kg）、醛類（92.23 μg/kg）、烴類（69.27 μg/kg）為主要揮發(fā)性成分。綜上可知，試驗組中揮發(fā)性成分的種類和總含量均為最高。Sidira 等[15]發(fā)現(xiàn)利用干酪乳桿菌ATCC 393 發(fā)酵香腸能顯著增加香腸揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類與含量；潘曉倩等[16]將植物乳桿菌10M-7 添加到風(fēng)干香腸中，顯著改善和增加風(fēng)干腸的風(fēng)味。這說明試驗組采用RC4 和B6 發(fā)酵能促進臘肉風(fēng)味物質(zhì)種類和含量的增加。此外，臘肉制作過程中腌制是必要環(huán)節(jié)，腌制過程可以起到抑菌防腐的功效，同時可以提高臘肉的保水性，增加臘肉制品的顏色和風(fēng)味[17]。試驗組腌制過程中添加的紅曲紅與甜菜紅，維生素E 和各種香辛料在替代亞硝酸鹽的同時，還能提升肉的風(fēng)味，提高產(chǎn)品的食用價值。

表1 3 種臘肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)比較Table 1 The volatile flavor compounds of 3 kinds of cured meat

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

2.5 OAV 分析

揮發(fā)性化合物含量與風(fēng)味特征并沒有直接關(guān)系，對總體風(fēng)味的貢獻由揮發(fā)性組分在風(fēng)味體系中的濃度和感覺閾值共同決定[18]。根據(jù)各揮發(fā)性成分的含量和嗅覺閾值計算出其氣味活度值（OAV），并選取OAV 大于等于1 的揮發(fā)性成分列于表2中。由表2可知，3 組臘肉中共篩選出主體揮發(fā)性成分（OAV≥1）20 種，包括烴類1 種、酯類2 種、醛類9 種、酮類2 種、醇類3 種、酚類1 種、醚類2 種，其中，試驗組、對照組1、對照組2 分別篩選出16，15，15 種主體揮發(fā)性成分，主要為醛類化合物。而試驗組中關(guān)鍵揮發(fā)性成分（OAV≥30）為D-檸檬烯、壬醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、茴香腦。

烴類化合物由飽和烴和不飽和烴組成，其中，飽和烴閾值較高，對風(fēng)味貢獻不大，不飽和烴閾值相對較低，對整體風(fēng)味具有一定的貢獻[19]。由表2可知，對照組1 和對照組2 中D-檸檬烯的OAV均小于1，試驗組中D-檸檬烯的OAV 較大，為52.87。這是試驗組腌制過程中添加了花椒的緣故[20]。D-檸檬烯具有檸檬香味，可賦予臘肉令人愉快的檸檬果香[21]。

酯類化合物由酸和醇經(jīng)酯化作用而成，通常具有果香，對臘肉制品的整體風(fēng)味有一定的貢獻。異丁酸甲酯、己酸乙烯酯為對臘肉整體風(fēng)味貢獻較大的酯類化合物。其中，異丁酸甲酯具有杏香。試驗組中其OAV 明顯大于對照組1 和對照組2。此外，己酸乙烯酯具有令人愉快的果香，3 組臘肉中，對照組1 OAV 最大，試驗組次之，對照組2 最小。

醛類化合物主要為脂質(zhì)氧化降解產(chǎn)物，Strecker 降解也能產(chǎn)生揮發(fā)性醛，閾值較低，具有較強的揮發(fā)性和脂肪香味，是臘肉制品中重要的風(fēng)味物質(zhì)[22-24]。由表2可知，3 組臘肉中OAV≥1的醛類化合物有9 種，包括2-甲基-丁醛、3-甲基-丁醛、戊醛、己醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、壬醛、（E）-2-壬烯醛、（E）-2-癸烯醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛。其中，3-甲基-丁醛主要來源于亮氨酸的降解[25]，具有黑巧克力味、堅果味[26]，對臘肉的風(fēng)味貢獻較大。3 組臘肉中，對照組2 的OAV 最大，對照組1 次之，試驗組最小。戊醛、己醛、壬醛、（E）-2-壬烯醛、（E）-2-癸烯醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛均為不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)物[27]，其中，己醛由亞油酸氧化產(chǎn)生，Mottram[28]認(rèn)為己醛會產(chǎn)生令人不愉快的、刺激性的、辛辣的氣味。謝凡[29]認(rèn)為己醛在高濃度時會散發(fā)出令人作嘔的氣味，在低濃度時具有令人愉快的青草香。與對照組1 相比，試驗組和對照組2 中己醛的OAV 均明顯減小。這說明試驗組和對照組2 中令人不愉快的氣味得到改善。壬醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛主要由油酸氧化產(chǎn)生，具有果香、新鮮的油脂香，與對照組1 和對照組2 相比，試驗組中壬醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛的OAV 明顯增大，分別達到194.19，770.99，這表明試驗組臘肉擁有更濃郁的油脂味。值得注意的是，與對照組1 相比，對照組2 中由脂質(zhì)氧化降解產(chǎn)生的醛類化合物的OAV 均有所減小。這是對照組2 中添加的亞硝酸鹽抑制了臘肉中的脂質(zhì)氧化所致[30]。

酮類化合物主要來自于脂質(zhì)氧化和美拉德反應(yīng)，但閾值遠高于其同分異構(gòu)體的醛類，對整體風(fēng)味貢獻不大。3 組臘肉中對風(fēng)味貢獻較大的酮類化合物為3-羥基-2-丁酮，其主要來自于多不飽和脂肪酸的氧化降解，具有奶香、草莓香[31]。與對照組1 相比，試驗組和對照組2 中其OAV 均有所減小，這可能與試驗組中添加的香辛料和對照組2 中添加的亞硝酸鹽能夠抑制臘肉的脂質(zhì)氧化有關(guān)[30，32]。

表2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的OAV 分析Table 2 The OAV analysis of volatile flavor compounds of 3 kinds of cured meat

醇類可能由脂質(zhì)氧化酶對脂肪酸的作用、脂肪的氧化分解、羰基化合物還原生成，飽和醇閾值較高對風(fēng)味貢獻不大，不飽和醇閾值較低，對風(fēng)味貢獻較大[33]。1-辛烯-3-醇、1-辛炔-3-醇、芳樟醇為對臘肉風(fēng)味貢獻較大的醇類化合物，其中，1-辛烯-3-醇、1-辛炔-3-醇為亞油酸氫過氧化物的降解產(chǎn)物，具有蘑菇香味[34]。3 組臘肉中OAV 的比較結(jié)果與3-羥基-2-丁酮一致，可能是二者皆為脂質(zhì)氧化降解產(chǎn)物的緣故。此外，試驗組中芳樟醇的OAV 較大，為25.97，是對照組1 和對照組2 的10倍左右，這可能與試驗組中添加的香辛料有關(guān)[35]。

此外，茴香腦、二烯丙基二硫醚僅在試驗組中被鑒定出，二者均來自于添加的香辛料。如茴香腦為八角、茴香中的揮發(fā)性成分[36]，二烯丙基二硫醚為大蒜中的揮發(fā)性成分[37]。它們共同賦予臘肉茴香味、大蒜味，使臘肉的整體風(fēng)味更加醇厚。

3 結(jié)論

本研究通過使用發(fā)酵乳桿菌RC4、植物乳桿菌B6、紅曲紅、甜菜紅、維生素E、Nisin 以及各種調(diào)味物質(zhì)替代亞硝酸鹽制備零添加亞硝酸鹽臘肉。并以只添加食鹽腌制的臘肉、添加食鹽和亞硝酸鹽腌制的臘肉為對照組，通過對3 組臘肉亞硝酸鹽含量和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)零添加亞硝酸鹽臘肉中不僅亞硝酸鹽含量低，且其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量也較豐富，其關(guān)鍵揮發(fā)性成分為D-檸檬烯、壬醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、茴香腦；與對照組相比，零添加亞硝酸鹽臘肉增加了由香辛料引入的揮發(fā)性成分（D-檸檬烯、茴香腦），從而使臘肉的整體風(fēng)味更加濃郁、醇厚。開發(fā)零添加亞硝酸鹽臘肉制品，研究臘肉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，有助于推進臘肉制品風(fēng)味改善和品質(zhì)提升，對傳統(tǒng)臘肉產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級、結(jié)構(gòu)調(diào)整及人們的健康都有促進作用。