范一靈，George C.Paoli，宋明輝，史賢明，楊美成*

（1 國家藥品監(jiān)督管理局微生物檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院 上海201203 2 美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究局東部研究中心 美國賓夕法尼亞州19038 3 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 中美食品安全聯(lián)合研究中心 微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海200240）

單核細(xì)胞增生李斯特菌 （Listeria monocytogenes）是食品中重要的致病性微生物[1]，也是李斯特菌屬內(nèi)能引起腸胃炎、敗血病、腦膜炎和李斯特菌病等最主要的病原體[2-3]，致死率達(dá)30%，對免疫缺陷人群危害嚴(yán)重[4]。該菌廣泛存在于乳制品、肉制品、蔬菜水果和海產(chǎn)品等各類食品中，能在pH 4.0、高鹽和4 ℃環(huán)境中存活并繁殖[5-8]。

單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長易被其同屬內(nèi)的其它細(xì)菌（如英諾克李斯特菌等）掩蓋，較難在培養(yǎng)后分離獲得目標(biāo)菌，導(dǎo)致假陰性檢測結(jié)果[9]。免疫磁珠捕獲技術(shù) （Immuno-magnetic beads technology，IMBs）可在復(fù)雜體系中特異性地捕獲目標(biāo)微生物，獲得活菌體[10-12]。IMBs 的特異性依賴于所用抗體的性能，而抗體受制于生產(chǎn)工藝，其質(zhì)量與產(chǎn)量都不穩(wěn)定[11，13]。與傳統(tǒng)免疫血清、雜交瘤等抗體制備技術(shù)相比，噬菌體展示技術(shù) （phagedisplay techniques）通過噬菌體庫與目標(biāo)菌的特異性結(jié)合，篩選獲得高特異性的表面單鏈抗體片段（single-chain antibody fragments，scFvs）[14]。將表達(dá)特性蛋白的基因轉(zhuǎn)移至質(zhì)粒內(nèi)，可穩(wěn)定保存并大規(guī)模生產(chǎn)具有相同特性的單鏈抗體。

前期有研究報(bào)道一種對單核細(xì)胞增生李斯特菌具有高特異性的噬菌體展示單鏈抗體片段的制備方法[13，15-16]。本研究基于該片段的特異性，制備親和素偶聯(lián)的scFv 免疫磁珠（scFv-IMBs）。通過在多種增菌培養(yǎng)體系中的定性、定量檢測，考察scFv-IMBs 對不同李斯特菌屬細(xì)菌的特異性捕獲情況，評價(jià)scFv-IMBs 在人工污染的法蘭克福香腸中分離單核細(xì)胞增生李斯特菌和英諾克李斯特菌的能力。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)條件

試驗(yàn)使用了14 株單核細(xì)胞增生李斯特菌和9 株其它李斯特菌屬細(xì)菌（表1）。菌種復(fù)蘇于腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基（BD Diagnostics，Sparks，MD）中，置37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，振蕩速度為250 r/min。選擇RAPID L.Mono Agar（Bio-Rad，CA）作為李斯特菌顯色培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基上單核細(xì)胞增生李斯特菌顯藍(lán)紫色，伊氏李斯特菌顯藍(lán)綠色，英諾克等其它李斯特菌顯白色。市售李斯特菌免疫磁珠Dynabeads anti-Listeria（Dyna-IMBs），購自Thermo Scientific。

表1 試驗(yàn)所用菌株及備選PCR 檢測引物特異性評價(jià)結(jié)果Table 1 Bacterial strains used and the results of PCR primers tested in this study

1.2 抗體磁珠的制備

按已報(bào)道的方法采用含pBAD：A8 質(zhì)粒的大腸埃希菌 （E.coli AVB100）制備生物素標(biāo)記的scFv 抗體[15]。以含0.3%的L-阿拉伯糖和1 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，用弗氏細(xì)胞破碎儀獲得裂解液，經(jīng)離心、層析和過濾純化得到含生物素標(biāo)記的scFv 清液[13]。

取鏈霉親和素標(biāo)記的Dynabeads M280 磁珠100 μL（Thermo Scientific），加入PBS 緩沖液（20 mmol/L 磷酸鹽，150 mmol/L NaCl，pH 7.4）900 μL，混勻。置磁力架上振搖收集磁珠，棄去液體。將磁珠分散于含0.1%牛血清蛋白的PBS 緩沖液（以下簡稱PBS 緩沖液）中活化。取約10 μg 生物素標(biāo)記的scFv 抗體，加入活化的磁珠體系中（濃度約為7×109～9×109個(gè)/mL），室溫振蕩1 h。在磁力架上穩(wěn)定3 min，用PBS 緩沖液反復(fù)清洗4 次，分散于1 mL PBS 緩沖液中，制備成scFv 結(jié)合的免疫磁珠（scFv-IMBs），置4 ℃保存。

1.3 細(xì)菌基因組DNA 提取及PCR 檢測

DNA 提取選用DNeasy Blood and Tissue Kit試劑盒（QIAGEN，Maryland，US），按說明書操作。DNA 溶解于100 μL TE 緩沖液中，-20 ℃保存。

從5 對備選李斯特菌特異性PCR 引物（表2）中篩選單核細(xì)胞增生李斯特菌特異性擴(kuò)增引物。反應(yīng)體系為：模板溶液1 μL，DNA 聚合酶1 U（GoTaq DNA polymerase，Promega，WI），1×PCR緩沖液，MgCl2濃度1.5 mmol/L，dNTP 濃度各0.25 mmol/L，上下游引物各50 nmol/L，加純水至25 μL。用iQ5 實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)（Bio-Rad，CA），反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，51℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。以1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL，在150 V 電壓的1×TAE 緩沖液（Trisacetate-EDTA buffer）中電泳20 min，用10 μg/mL EB 染料（ethidium bromide）染色15 min 后，置紫外凝膠成像儀（MultiImage Light Cabinet，Alphalmager）觀察。標(biāo)準(zhǔn)DNA 分子質(zhì)量采用ExactGene（low Range DNA ladder，F(xiàn)isher BioReagents，NY），以單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCC 19115 基因組DNA 為陽性對照，純水為空白對照。

表2 試驗(yàn)所用備選PCR 檢測引物序列信息Table 2 The information of optional PCR primers tested in this study

1.4 法蘭克福香腸人工污染單核細(xì)胞增生李斯特菌

取同批號待檢法蘭克福香腸6～7 袋，搓揉外包裝，使內(nèi)容物與液體充分接觸。無菌開啟包裝，取浸出液40 mL（每袋約6 mL），混勻，作為待測樣[22]，置4 ℃保存。人工污染前，取1 mL 浸出液通過增菌培養(yǎng)法檢測待測樣。選擇未受李斯特菌屬污染的待測樣，接種新鮮培養(yǎng)的單核細(xì)胞增生李斯特菌（ATCC 19115），使其終濃度約為＜1 CFU/mL、1 CFU/mL、10 CFU/mL 和100 CFU/mL。污染后將樣品置4 ℃穩(wěn)定24 h，模擬食用前的微生物存活狀態(tài)。

1.5 法蘭克福香腸人工污染單核細(xì)胞增生李斯特菌和英諾克李斯特菌

取40 mL 待測樣，分別接種新鮮培養(yǎng)的單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCC 19115（LM）和英諾克李斯特菌ATCC 51742（LI）。菌液終濃度LM/LI 的比例分別為1/1，1/10，1/100，1/1 000，10/10，10/100，10/1 000，100/10，100/100 和100/1 000。污染后將樣品置4 ℃穩(wěn)定24 h。

1.6 目標(biāo)菌的磁珠捕獲與菌落計(jì)數(shù)

1.6.1 BHI 培養(yǎng)基中磁珠的捕獲效率 分別將3株單核細(xì)胞增生李斯特菌和6 株其它李斯特菌屬細(xì)菌接種至BHI 培養(yǎng)基中培養(yǎng)（表3），制成約105CFU/mL 菌液。取上述菌液1 mL，分別加入20 μL免疫磁珠溶液，4 ℃輕微振蕩1 h。用PBS 緩沖液在磁力架上清洗3 次，用1 mL 相同的緩沖液重懸，必要時(shí)進(jìn)行10 倍系列稀釋。以6×6 滴板計(jì)數(shù)法[23]（每滴10 μL）在BHI 瓊脂培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)，比較磁珠捕獲前后微生物的數(shù)量變化。

1.6.2 法蘭克福香腸中單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測 以USDA-FSIS 檢測方法為基礎(chǔ)（Microbiology Laboratory Guidebook，MLG 8.1），結(jié)合磁珠捕獲和PCR 確認(rèn)技術(shù)，檢測法蘭克福香腸中的單核細(xì)胞增生李斯特菌。取第1 次增菌的UVM 培養(yǎng)基 （Modified university of vermont broth）90 mL，加入10 mL 人工污染浸出液，置 （30±2）℃振蕩160 r/min 培養(yǎng)（22±2）h。分別取0.1 mL UVM 培養(yǎng)物至第2 次增菌的10 mL FB 培養(yǎng)基（Fraser broth）和10 mL MOPS-BLEB 培養(yǎng)基（Morpholinepropanesulfonic acid buffered listeria enrichment broth）中，置（35±2）℃振蕩250 r/min 培養(yǎng)（26±2）h。取上述UVM、FB 和MOPS-BLEB 培養(yǎng)物各1 mL，分別加入scFv-IMBs 和Dyna-IMBs 溶液20 μL，按1.6.1 節(jié)的方法分別在BHI 瓊脂和顯色瓊脂上計(jì)數(shù)。剩余的磁珠捕獲液用于顯色培養(yǎng)基劃線和細(xì)菌基因組DNA 提取。

2 結(jié)果

2.1 BHI 培養(yǎng)基中磁珠的捕獲效率

采用9 株細(xì)菌考察BHI 培養(yǎng)基中兩種磁珠的特異性（表3）。scFv-IMBs 對3 株單核細(xì)胞增生李斯特菌的捕獲率在15%～55%之間，高于同種培養(yǎng)基中Dyna-IMBs 的0.85%～1.27%捕獲率。scFv-IMBs 除對斯氏李斯特菌和伊氏李斯特菌的捕獲率略高于Dyna-IMBs 外，對李斯特菌屬中非單核細(xì)胞增生李斯特菌的捕獲率均低于0.61%。在BHI 純培養(yǎng)系統(tǒng)中，scFv-IMBs 顯示出良好的特異性和較高的捕獲率。

表3 在BHI 培養(yǎng)基中scFV-IMBs 和Dyna-IMBs 對李斯特菌屬細(xì)菌的捕獲率Table 3 The capture efficiency of scFV-IMBs and Dyna-IMBs for Listeria spp.in BHI broth

2.2 備選PCR 引物的驗(yàn)證

為了從5 種備選的引物中選擇出單核細(xì)胞增生李斯特菌特異性PCR 檢測引物，針對23 株待測微生物進(jìn)行PCR 引物驗(yàn)證。引物L(fēng)mo0733 具有李斯特菌屬水平特異性；格式李斯特菌干擾引物Aznar 的檢測；威爾斯李斯特菌、格式李斯特菌和部分英諾克李斯特菌干擾引物Jaton 的檢測。經(jīng)試驗(yàn)確認(rèn)的單核細(xì)胞增生李斯特菌種水平的特異性為引物Fluit 和Nied（表1），這兩對引物目標(biāo)靶點(diǎn)是對李斯特菌溶血素O 基因 （hlyA）。由于引物Nied 在51 ℃退火時(shí)具有較高的檢測靈敏度，可檢測到約2.86 pg 的單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組（數(shù)據(jù)未列出），被用于后續(xù)試驗(yàn)的PCR 檢測中。

2.3 法蘭克福香腸中單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測

在BHI 和顯色培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)的菌落數(shù)（或典型菌落數(shù)）分別代表了樣品經(jīng)UVM、FB 或MOPS-BLEB 培養(yǎng)基培養(yǎng)后，所有微生物的總數(shù)和單核細(xì)胞增生李斯特菌的數(shù)量。法蘭克福香腸浸出液經(jīng)增菌培養(yǎng)后，背景菌的濃度可達(dá)到107～108CFU/mL，而單核細(xì)胞增生李斯特菌的濃度約為102～104CFU/mL，背景菌在培養(yǎng)物中占據(jù)主導(dǎo)地位（表4）。由于高濃度背景微生物影響磁珠與目標(biāo)微生物的結(jié)合，導(dǎo)致在第一步UVM 培養(yǎng)基中兩種磁珠的捕獲率均低于5%，甚至無法在瓊脂平板上分離獲得目標(biāo)菌。經(jīng)FB 和MOPS-BLEB 培養(yǎng)基二次增菌后，單核細(xì)胞增生李斯特菌的比例由第1次增菌前不足0.01%（濃度小于104CFU/mL）迅速提升到20%～80%（濃度約為106～108CFU/mL），而背景菌的數(shù)量未見顯著增加 （表4）。其中，經(jīng)MOPS-BLEB 培養(yǎng)后李斯特菌屬細(xì)菌的終濃度會高于FB 培養(yǎng)基，并成為體系內(nèi)優(yōu)勢菌，具有較好的選擇培養(yǎng)性。

采用scFv-IMBs 和Dyna-IMBs 兩種磁珠捕獲后，通過顯色培養(yǎng)基和PCR 檢測證實(shí)，磁珠捕獲方法對單核細(xì)胞增生李斯特菌的靈敏度可達(dá)1 CFU/mL。兩種磁珠在MOPS-BLEB 培養(yǎng)基中的捕獲率（62%～88%）明顯高于UVM 培養(yǎng)基（＜5%）和FB 培養(yǎng)基（＜53%）中的捕獲率。

表4 IMBs 捕獲法蘭克福香腸中單核細(xì)胞增生李斯特菌的平板計(jì)數(shù)和PCR 檢測結(jié)果Table 4 The IMBs detection results of frankfurters spiked with L.monocytogenes using plating and PCR method

2.4 法蘭克福香腸中單核細(xì)胞增生李斯特菌和英諾克李斯特菌的檢測

在不同濃度英諾克李斯特菌存在的情況下，人工污染法蘭克福香腸浸出液經(jīng)增菌培養(yǎng)后，采用平板涂布法均能檢測到單核細(xì)胞增生李斯特菌。但隨著英諾克李斯特菌污染濃度的提高，單核細(xì)胞增生李斯特菌在第一步增菌中的終濃度顯著下降。當(dāng)LM/LI=1∶1 000 時(shí)，即使經(jīng)FB 和MOPSBLEB 培養(yǎng)基二次增菌，單核細(xì)胞增生李斯特菌的終濃度也僅能達(dá)到103CFU/mL，其生長受到明顯的抑制。

采用IBM SPSS Statistics 19 統(tǒng)計(jì)軟件對不同磁珠捕獲前后獲得的菌落數(shù)進(jìn)行配對T 檢驗(yàn)分析（表5）。人工污染樣品經(jīng)磁珠處理后，單核細(xì)胞增生李斯特菌與英諾克李斯特菌在顯色培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比例存在顯著性差異（P=0.023＜0.05），經(jīng)scFv-IMBs 捕獲后顯色平板上的單增李斯特菌的菌落數(shù)比例顯著提高。經(jīng)UVM 和FB 培養(yǎng)基培養(yǎng)后，scFv-IMBs 和Dyna-IMBs 捕獲兩種李斯特菌的菌落數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.886 和P=0.340），而經(jīng)MOPS-BLEB 培養(yǎng)后，scFv-IMBs 的選擇性顯著高于Dyna-IMBs 磁珠（P＜0.01）。

表5 人工污染法蘭克福香腸中兩種李斯特菌經(jīng)磁珠捕獲后在顯色培養(yǎng)基上的菌落數(shù)百分比（%）Table 5 The percentage of colonies in RAPID L.Mono Agar from frankfurters spiked with L.monocytogenes and L.innocua after IMBs capture （%）

以配對T 檢驗(yàn)比較和分析不同LM/LI 比例分別經(jīng)3 種增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，單核細(xì)胞增生李斯特菌和英諾克李斯特菌的回收情況見表6。對單核細(xì)胞增生李斯特菌的回收進(jìn)行比較，scFv-IMBs與Dyna-IMBs 的回收率相比有極顯著性差異（P＜0.01）。分別統(tǒng)計(jì)每一種培養(yǎng)基經(jīng)磁珠處理后的回收率，在UVM 和FB 培養(yǎng)基中scFv-IMBs 和Dyna-IMBs 的回收率有極顯著性差異 （P＜0.01），但在MOPS-BLEB 培養(yǎng)基中兩種磁珠之間無顯著性差異（P=0.37＞0.05）。對英諾克李斯特菌的回收率進(jìn)行比較，scFv-IMBs 在每一種培養(yǎng)基中的回收率均顯著低于Dyna-IMBs（P＜0.01），scFv-IMBs 顯示出較好的單核細(xì)胞增生李斯特菌特異性，可以在混合體系中顯著降低英諾克李斯特菌的干擾。

二次增菌培養(yǎng)后經(jīng)磁珠處理的培養(yǎng)物在顯色平板上劃線。結(jié)果顯示，經(jīng)scFv-IMBs 處理后在FB（LM/LI=1/1 000）培養(yǎng)基（LM/LI=1/100 和1/1 000）的增菌液中，未能獲得單核細(xì)胞增生李斯特菌的單菌落。而經(jīng)Dyna-IMBs 處理后，LM/LI 多數(shù)組合中FB 和MOPS-BLEB 培養(yǎng)基的培養(yǎng)物無法分離獲得目標(biāo)微生物的單菌落，甚至無法檢測到單核細(xì)胞增生李斯特菌的典型菌落 （表7）。scFv-IMBs 的高特異性可以較容易的從高濃度英諾克李斯特菌培養(yǎng)體系中分離單核細(xì)胞增生李斯特菌。與之相對的，Dyna-IMBs 對單核細(xì)胞增生李斯特菌的特異性低于scFv-IMBs，在顯色培養(yǎng)基上引入了更多的背景干擾菌，尤其是高濃度的英諾克李斯特菌。在LM/LI=1/1 000 時(shí)，僅能通過靈敏度更高的PCR 方法檢測到目標(biāo)菌的存在，在選擇性平板上也無法有效分離目標(biāo)菌。采用PCR 檢測可在除LM/LI=1/100 和1/1 000 外的試驗(yàn)組合中成功檢測到目標(biāo)菌，考慮到免疫磁珠的捕獲效率在1.0%～20.0%之間，食品樣品中大量的英諾克李斯特菌將對單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測產(chǎn)生較大的影響。

表6 兩種免疫磁珠捕獲人工污染法蘭克福香腸中李斯特菌的回收率（%）Table 6 The recovery ratio of L.monocytogenes and L.innocua after IMBs capture from spiked frankfurters （%）

表7 采用磁珠結(jié)合平板劃線與PCR 方法檢測人工污染法蘭克福香腸中的單核細(xì)胞增生李斯特菌Table 7 The detection results of L.monocytogenes from spiked frankfurters using IMBs combined with plating and PCR method

3 討論

一般情況下，法蘭克福香腸中單核細(xì)胞增生李斯特菌的分離率可達(dá)2%至8%，是極易引發(fā)李斯特菌食物中毒的一種即食食品[24-25]。但因其組成復(fù)雜、基質(zhì)干擾大，給單核細(xì)胞增生李斯特菌的分離帶來很大影響。在自然環(huán)境中，單核細(xì)胞增生李斯特菌常與其它李斯特菌伴生，并易被掩蓋[9，26-27]。尤其是英諾克李斯特菌的存在顯著影響平板分離的效果，即便LM/LI 比例在1/1 的情況下，仍有很大干擾（表7）。

在培養(yǎng)過程中，損傷修復(fù)功能被認(rèn)為有助于提升目標(biāo)菌的數(shù)量，但第2 次增菌時(shí)間超過24 h并不一定會顯著提升目標(biāo)菌數(shù)量[28]。經(jīng)增菌培養(yǎng)后，英諾克李斯特菌的生長速率一般會高于單核細(xì)胞增生李斯特菌，導(dǎo)致在選擇性瓊脂培養(yǎng)基上無法分離。因此，低濃度的單核細(xì)胞增生李斯特菌在食品中易被漏檢。借助免疫磁珠捕獲技術(shù)可在選擇性平板上更容易地發(fā)現(xiàn)目標(biāo)菌，并獲得單菌落。但由于免疫磁珠中抗體制備困難、非特異性結(jié)合和低捕獲率導(dǎo)致該方法的應(yīng)用受到限制[29]。有研究顯示，Dyna-IMBs 在單核細(xì)胞增生李斯特菌含量為103CFU/mL 的體系中捕獲率不足10%[30]，對其它李斯特屬細(xì)菌也有0.02%～3.42%的非特異性結(jié)合[13]。在本研究中，scFv-IMBs 對非單核細(xì)胞增生李斯特菌的結(jié)合率低于0.5%，具有較好的選擇特異性。

scFv 抗體只有一條輕鏈和一條重鏈，與完整抗體相比scFv 與抗原的結(jié)合力較弱，這可能是導(dǎo)致在增菌培養(yǎng)基中scFv-IMBs 捕獲效率略低于Dyna-IMBs 的原因。但scFv-IMBs 可以在高濃度英諾克李斯特菌存在的食品基質(zhì)中有效分離單核細(xì)胞增生李斯特菌，其檢測靈敏度可達(dá)到1 CFU/mL。在選擇性平板上經(jīng)scFv-IMBs 捕獲處理培養(yǎng)物中單核細(xì)胞增生李斯特菌的菌落數(shù)比例和分離情況明顯優(yōu)于Dyna-IMBs。

據(jù)報(bào)道，UVM 和FB 培養(yǎng)基會降低單核細(xì)胞增生李斯特菌表面抗原的表達(dá)，而MOPS-BLEB培養(yǎng)基中的BLEB 成分可提高單核細(xì)胞增生李斯特菌表面抗體的表達(dá)[31]。通過在不同培養(yǎng)基中比較免疫磁珠對目標(biāo)菌的分離率，也表明MOPSBLEB 培養(yǎng)基中磁珠捕獲效果明顯優(yōu)于UVM 和FB 培養(yǎng)基。因此，選用免疫磁珠捕獲時(shí)，應(yīng)充分考慮增菌培養(yǎng)基對磁珠捕獲效果的影響。

本研究制備了一種單核細(xì)胞增生李斯特菌特異性的單鏈抗體片段捕獲磁珠（scFv-IMBs），可從較高濃度背景微生物的法蘭克福香腸中，尤其是存在英諾克李斯特菌的情況下，有效地富集和分離單核細(xì)胞增生李斯特菌，與市售免疫磁珠產(chǎn)品相比具有更好的分離能力，可用于實(shí)際樣品的檢驗(yàn)檢測。