王 娜，孟利軍，黃忠民，艾志錄，李 娜，張改平

（1 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物免疫學重點實驗室 鄭州450002 2 河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院 鄭州450002 3 河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 鄭州450002 4 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大宗糧食加工重點實驗室 鄭州450002 5 鄭州市營養(yǎng)與健康食品實驗室 鄭州450002）

近幾十年來，食物過敏引起全世界廣泛的關(guān)注，被視為一種嚴重的公共營養(yǎng)衛(wèi)生問題。小麥作為FAO 公認的常見八大過敏原之一，危害著小麥過敏人群的健康。小麥過敏多屬于遲發(fā)性過敏反應，有較高的病患率和漏診率，并發(fā)癥狀較多。它主要影響皮膚、內(nèi)臟、呼吸道的健康，引起運動激發(fā)過敏癥、職業(yè)哮喘、鼻炎、接觸性蕁麻癥、乳糜瀉腸炎、麻風皮膚病等[1]，還與反復發(fā)作的過敏性休克相關(guān)[2]。Jiang 等[3]回顧中國人群1 952 次嚴重過敏反應，發(fā)現(xiàn)食物（77%）是常見嚴重過敏反應的主要誘因，其中小麥（37%）也是誘發(fā)中國人群過敏性休克最常見食物。日本研究同樣顯示：小麥是食物依賴運動誘發(fā)過敏性休克主要的致敏食物[4]。不同的小麥過敏原對過敏患者有著不同的致病機制，并呈現(xiàn)不同的臨床癥狀。小麥過敏的途徑很多，包括吸入、攝入，也有接觸小麥產(chǎn)品而導致過敏的報道。

小麥醇溶蛋白是小麥主要過敏原之一，根據(jù)電泳圖譜上相對遷移率不同，主要分為α-、β-、γ-、ω-型4 種。α-、β-、γ-醇溶蛋白分子質(zhì)量為31～45 ku，ω-醇溶蛋白分子質(zhì)量45～75 ku。Biagi等[5]認為醇溶蛋白是引起乳糜瀉的主要蛋白。γ-醇溶蛋白也被推測是乳糜瀉的一個重要過敏原[6]。Rasanen 等[7]對18 個小麥口頭激發(fā)過敏的兒童研究發(fā)現(xiàn)，超過半數(shù)的兒童產(chǎn)生了能與醇溶蛋白特異性結(jié)合的IgE。Morita 等[8]和Palosuo 等[9]研究表明γ-醇溶蛋白和ω5-醇溶蛋白是引發(fā)小麥依賴運動激發(fā)性過敏癥的主要過敏原。

麩質(zhì)是目前唯一規(guī)定了食品中含量閾值的過敏原成分，含量不高于20 mg/kg，稱為“無麩質(zhì)食品”[10]。我國對小麥過敏的研究幾乎空白，在國際貿(mào)易中涉及的小麥過敏問題給我國面制品的生產(chǎn)發(fā)展帶來嚴峻的挑戰(zhàn)。例如我國出口啤酒曾多次由于未能符合歐盟關(guān)于食品中麩質(zhì)過敏原成分標識的標準而被拒。

發(fā)酵面制品是幾乎半數(shù)中國人口的主要營養(yǎng)源，是中國旱作農(nóng)業(yè)、小麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，與人們的日常飲食密切相關(guān)。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，食品加工方式呈多樣化，如微波、超高壓、速凍技術(shù)等在食品領(lǐng)域得到較廣泛的應用。因此，研究食品加工對發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白致敏性的影響具有重要意義。本文研究不同加工方式對發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白抗原性的影響，為探討加工方式在脫敏食品生產(chǎn)中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鄭麥7698，購于河南省農(nóng)業(yè)科學院；60Co 輻照源，河南省科學院同位素有限公司；BCA 蛋白定量檢測試劑盒，北京鼎國昌盛有限公司；彩虹預染Marker（11～180 ku），北京索萊寶科技有限公司；夾心式酶聯(lián)免疫小麥醇溶蛋白ELISA 試劑盒（一抗是兔源抗小麥醇溶蛋白抗體；標記抗體是HRP 標記的羊源抗兔和植物的醇溶蛋白抗體），江蘇綠葉生物有限公司；其它試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

MLU-202 布勒實驗磨粉機，中國無錫布勒機械公司；非標定制螺旋速凍裝置，鄭州亨利制冷設備有限公司；GCSJ-15-1-7 臭氧水機，武漢威蒙環(huán)?？萍加邢薰?；WD900B 型微波爐，順德市格蘭仕電器實業(yè)有限公司；KQ-500DE 超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；FPG5620YHL 超高壓處理裝置，英國SFP 公司；SX-500 高壓蒸汽滅菌鍋，Tomy 公司；ZW-SY-2D 脈沖強光殺菌設備，寧波中物光電殺菌技術(shù)有限公司；LGJ-10D 真空冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；Mini-PROTEAN165-8003 電泳儀，Bio-Rad 公司；CHEMI SYSTEM 凝膠成像及分析系統(tǒng)，UVP 公司；M5酶標儀，Molecular Devices 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同加工處理發(fā)酵面團 選取小麥品種為鄭麥7698，潤麥，磨粉，制作成發(fā)酵面團[11]，軋成1.4～1.5 mm 厚的面皮，分別進行以下處理，如表1所示。

表1 發(fā)酵面團的不同加工處理Table 1 Different processing of fermented dough

空白發(fā)酵面團作為陽性對照組CK，每個處理設3 個重復，所有處理后的樣品均立即冷凍干燥，打磨成粉，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品中小麥醇溶蛋白的提取 參考潘治利[18]的方法從樣品中提取小麥醇溶蛋白，用0.45 μm 尼龍66 濾頭過濾，并用BCA 法測定蛋白濃度。

1.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 參照蛋白質(zhì)電泳技術(shù)[19]，小麥醇溶蛋白與5×上樣緩沖液按1∶1 混合，煮沸10 min 后上樣。

1.3.4 夾心法ELISA 測定蛋白的抗原性 具體方法參考文獻[20]：

本研究用致敏性殘存率評估致敏蛋白抗原性的變化。

樣品抗原與一抗混合→溫育→洗滌→加入酶標抗體→溫育→洗滌→顯色→濃硫酸終止反應→酶標儀讀數(shù)。

按照公式計算發(fā)酵面團中過敏原小麥醇溶蛋白的致敏性殘存率：

式中：OD空白為70%乙醇的吸光值；OD對照為陽性對照發(fā)酵面團的吸光值；OD樣品為樣品的吸光值。每個處理重復測3 次。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)分析采用Excel 2007 和SPSS.16.0 軟件，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P<0.05 表示具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱加工和冷處理對小麥醇溶蛋白抗原性的影響

2.1.1 小麥醇溶蛋白的SDS-PAGE 電泳結(jié)果分析 由圖1可知，CK 中小麥醇溶蛋白目的條帶清晰，亞基分明，說明本試驗采用的提純小麥醇溶蛋白試驗方法可行。與CK 相比，熱加工和冷處理后發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的特征譜帶發(fā)生了變化，其中熱蒸和高溫高壓處理后目的蛋白變化尤為顯著。二者共同之處是在55 ku 左右生成新的條帶。二者均屬于濕熱處理，可能是因為濕熱處理導致小麥醇溶蛋白發(fā)生聚合或交聯(lián)形成大分子蛋白質(zhì)。不同之處是高溫高壓處理后，小麥醇溶蛋白35 ku 左右的特征譜帶明顯淡化至幾乎消失，說明其α-、β-、γ-醇溶蛋白的含量明顯降低，高壓強化了小麥醇溶蛋白的聚合或交聯(lián)作用。熱蒸處理后小麥醇溶蛋白35 ku 左右的主要譜帶稍微淡化，而25 ku 左右的譜帶明顯加深?？赡苁且驗闊嵴籼幚硎共糠中←湸既艿鞍装l(fā)生了降解，生成了更多小分子蛋白。

圖1 熱加工和冷處理發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的SDS-PAGE 電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of wheat gliadin in fermented dough under thermal processing and cold treatments

2.1.2 小麥醇溶蛋白的ELISA 結(jié)果分析 由圖2可知，烘烤處理和冷處理對發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的抗原性影響均不顯著（P>0.05），而熱蒸、微波和高溫高壓處理樣品中小麥醇溶蛋白的抗體結(jié)合能力均顯著低于對照（P<0.01）。熱蒸處理其抗原性降低了35.37%；微波處理和高溫高壓處理其抗原性分別降低了62.63%和61.47%。

結(jié)合圖1可知，熱蒸處理和高溫高壓處理后小麥醇溶蛋白抗體結(jié)合能力顯著低于對照，主要歸因于小麥醇溶蛋白一級結(jié)構(gòu)的改變。高溫高壓處理后樣品中α-、β-、γ-亞基含量大大減少，同時其致敏蛋白的消化穩(wěn)定性降低[21]，均為其致敏性的下降提供了可能。高溫高壓降低致敏蛋白的免疫反應性的研究不僅僅局限于小麥，在花生、綠豌豆和羽扇豆、榛子粉的相關(guān)研究中也得到類似結(jié)果[22-26]。微波處理后，發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的一級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯改變，可能是進行熱處理使蛋白發(fā)生構(gòu)象和化學變化[13]，從而影響其發(fā)生免疫反應，最終降低了小麥醇溶蛋白的致敏性。

圖2 熱加工和冷處理發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白抗原性的變化Fig.2 Changes in antigenicity of wheat gliadin in fermented dough under thermal processing and cold treatments

2.2 非熱加工對小麥醇溶蛋白抗原性的影響

2.2.1 小麥醇溶蛋白的SDS-PAGE 電泳結(jié)果分析由圖3可以看出，與CK 相比，臭氧熏蒸、脈沖強光和超聲波處理后小麥醇溶蛋白的特征譜帶并未發(fā)生顯著變化，說明發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白分子質(zhì)量未發(fā)生明顯變化。

2.2.2 小麥醇溶蛋白的ELISA 結(jié)果分析 由圖4可知，臭氧熏蒸60 min，脈沖強光處理（PL）和超聲波處理均能顯著降低發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的抗原性（P<0.01），其抗原性均降低到70%以下，尤其是臭氧熏蒸60 min 時，其抗原性降到最低，降至51.02%，降低了48.98%。

圖3 非熱加工處理發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的SDS-PAGE 電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of wheat gliadin in fermented dough under non-thermal processing treatments

2.3 超高壓處理對小麥醇溶蛋白抗原性的影響

2.3.1 小麥醇溶蛋白的SDS-PAGE 電泳結(jié)果分析 由圖5可知，超高壓處理后，小麥醇溶蛋白無論從條帶數(shù)量、位置和灰度均沒有明顯差異，表明單純的壓力（300 MPa 以內(nèi)）處理對發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白分子質(zhì)量沒有影響。

2.3.2 小麥醇溶蛋白的ELISA 結(jié)果分析 如圖6所示，超高壓處理后發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的抗原性呈波動型變化，先升高后降低。與CK 相比，100 MPa 時，小麥醇溶蛋白的抗原性變化最顯著 （P<0.05），增加了約61.8%；150 MPa 和200 MPa 時其抗原性變化不顯著（P>0.05），略有下降，

臭氧作為一種強氧化劑，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進行氧化，破壞或影響蛋白質(zhì)的表位，從而達到降低過敏原的效果，并且臭氧熏蒸時間越長，其抗原性降低越多。脈沖強光處理過程中過敏原變化可能與其光熱、光物理和光化學效應有關(guān)，但其確切機制尚不清楚。脈沖強光處理隨著時間的延長，其抗原性變化不大。Zhao 等[27]研究發(fā)現(xiàn)PL 脈沖光能夠?qū)⒄麄€花生核內(nèi)的所有主要變應原減至無法檢測到的水平。超聲處理可能是通過改變小麥醇溶蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)，而引起其致敏性的變化。Kasera等[28]、Gulseren 等[29]的研究結(jié)果都表明超聲會影響蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變。但仍增加了22%左右；250 MPa 時，其抗原性降至最低，降低了4%；300 MPa 時，其抗原性又略顯增加，增加到120%左右。

圖4 非熱處理發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白抗原性的變化Fig.4 Changes in antigenicity of wheat gliadin in fermented dough under non-thermal processing treatments

100 MPa 時，超高壓誘導小麥醇溶蛋白的高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[30]，導致過敏原的表位暴露出來，所以抗原性增強。150，200，250 MPa 時，小麥醇溶蛋白的致敏性殘存率變化不顯著（P>0.05），可能是由于過大的壓力使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)再一次發(fā)生變化，導致其構(gòu)象表位被改變或破壞，不能被IgG 抗體識別[31-32]，從而不能誘發(fā)免疫反應，最終降低了其抗原性。300 MPa 時，隨著壓力的增加，蛋白質(zhì)又會重新發(fā)生聚合，抗原性增加。

圖5 高靜壓處理發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的SDS-PAGE 電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of wheat gliadin in fermented dough under high static pressure treatments

2.4 輻照處理對小麥醇溶蛋白抗原性的影響

2.4.1 小麥醇溶蛋白的SDS-PAGE 電泳結(jié)果分析 由圖7可知，不同60Co 輻照劑量處理前后，發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的特征譜帶沒有發(fā)生顯著變化，說明1～15 kGy 的輻照劑量對發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的分子質(zhì)量無影響，小麥醇溶蛋白對輻照的穩(wěn)定性較強。

2.4.2 小麥醇溶蛋白的ELISA 結(jié)果分析 由圖8可知，輻照處理后發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的抗原性呈波動型變化，先降低后升高。與CK 相比，輻照劑量為1，3，5，7 kGy 時，發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的抗原性變化不顯著 （P>0.05），但是1 kGy 時，致敏性增加了約20%；3，5 kGy 劑量時，其致敏性幾乎保持不變；7 kGy 時，抗原性降低了約20%左右；輻照劑量為10 kGy 時，其致敏性變化極顯著（P<0.01），降低了29.92%。13，15 kGy 時，樣品中小麥醇溶蛋白的抗原性呈增加趨勢，15 kGy 時，抗原性增加了約20%。結(jié)合圖7可知，輻照改變發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的抗原性可能是因為輻照導致目的蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起了大量的蛋白質(zhì)變性[33]。

圖7 不同60Co 輻照劑量處理下發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的SDS-PAGE 電泳圖Fig.7 SDS-PAGE of wheat gliadin in fermented dough under different 60Co irradiation doses

圖8 不同輻照劑量處理發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白抗原性的變化Fig.8 Changes of antigenicity of wheat gliadin in fermented dough under different irradiation doses

2.5 加工對小麥醇溶蛋白增敏效果的比較

由圖9可以看出，100 MPa 時，發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白抗原性增加極顯著（P<0.01），增加了61.84%。輻照劑量為1，15 kGy 時和150，200，300 MPa 超高壓處理時，發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白抗原性增加不顯著（P>0.05），增加了約20%左右。由此可知，保壓溫度35 ℃，保壓時間20 min 時，300 MPa 以內(nèi)的靜態(tài)超高壓處理不合適用于發(fā)酵面團的加工，更高壓力對發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的抗原性影響仍需進一步研究。

2.6 加工對小麥醇溶蛋白脫敏效果的比較

由圖10可以看出，熱蒸、微波、高溫高壓、60Co 7 kGy、60Co 10 kGy、臭氧熏蒸60 min、脈沖強光和超聲波處理均能顯著降低發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的抗原性（P<0.05），其抗原性均降至80%以下，其中微波和高溫高壓處理的脫敏效果最好，分別降至37.36%和38.52%。結(jié)合圖1可知，從蛋白攝入方面考慮，微波處理比高溫高壓更適合用于發(fā)酵面制品，這一新型加熱方式更值得推廣。從脫敏效果來看，與烘烤處理相比，熱蒸處理更適合發(fā)酵面團的加工，也印證了中國傳統(tǒng)飲食中蒸饅頭、包子的合理性。由此推測也可能是這一中國勞動人民的智慧結(jié)晶大大降低了中國人群發(fā)生小麥過敏的概率。這一發(fā)現(xiàn)與水煮處理降低非發(fā)酵面團小麥醇溶蛋白的致敏性不謀而合[34]，無一不體現(xiàn)中國飲食文化的博大精深。隨著時代的發(fā)展，食品加工方式的多樣化，新型加工方式，如臭氧熏蒸、脈沖強光和超聲波等均可用于發(fā)酵面制品加工中，輻照在發(fā)酵面制品加工中運用時要注意劑量的控制。

圖9 發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白增敏加工方式Fig.9 Processing methods for increasing allergenicity of wheat gliadin in fermented dough

圖10 發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白脫敏加工方式Fig.10 Processing methods for reducing sensitization of wheat gliadin in fermented dough

3 結(jié)論

綜合以上分析，不同加工方式對發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的抗原性影響不同，而相同加工方式的不同條件對發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的抗原性影響也有顯著差異。300 MPa 以內(nèi)的靜態(tài)超高壓處理具有增敏作用，不適合用于發(fā)酵面團。熱蒸、微波、高溫高壓、60Co（7，10 kGy）、臭氧熏蒸（60 min）、脈沖強光和超聲波處理均能顯著降低發(fā)酵面團中小麥醇溶蛋白的抗原性，均可用于發(fā)酵面制品加工中，其中微波、高溫高壓和熱蒸處理在發(fā)酵面制品加工中更值得推崇。加工可以作為食品過敏安全控制的有效手段。