董 瀟，黃國清，肖軍霞

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島266109）

姜黃素（curcumin）是從姜科姜黃屬植物姜黃（Curcumin longa）中提取的一種天然酚類色素，具有無毒、無害的特點(diǎn)[1]。隨著對姜黃素研究的深入，發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗氧化、調(diào)脂、抗病毒、抗感染、抗腫瘤、抗凝、抗肝纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等廣泛的藥理活性，且毒性低，不良反應(yīng)小[2]。人體臨床試驗(yàn)表明，姜黃素以相對較高的水平攝入（8 g/d，持續(xù)8 周），不會(huì)對健康產(chǎn)生不良影響，這表明它作為營養(yǎng)保健品是安全的[3]。然而，姜黃素作為功能性食品和飲料中的營養(yǎng)保健成分使用時(shí)，因化學(xué)不穩(wěn)定性、水溶性低、口服生物利用度差等原因往往受到限制[4]。這些問題通?？梢酝ㄟ^將姜黃素包封在口服攝入的食品級納米顆粒基遞送系統(tǒng)中來克服[5]。

以玉米醇溶蛋白（Zein）包埋姜黃素是增加其水分散性和穩(wěn)定性，提高其生物利用度和生物活性的有效途徑。玉米醇溶蛋白是玉米蛋白粉中的主要蛋白質(zhì)，約占總蛋白的70%[6]。玉米醇溶蛋白是一種典型的醇溶水不溶型植物蛋白，不溶于水，只溶于60%～95%的乙醇。通過反溶劑沉淀機(jī)制將玉米醇溶蛋白-乙醇溶液注入水中，由于溶解度降低，因此玉米醇溶蛋白便可自發(fā)形成納米粒子[7]。因其特殊的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，故玉米醇溶蛋白在食品、醫(yī)藥和化工行業(yè)可作為良好的包裝材料[8-9]。

為了進(jìn)一步提高玉米醇溶蛋白納米粒子對姜黃素的包埋效果，Yao 等[10]使用生物聚合物涂層（藻酸鹽/明膠）的靜電沉積來增加玉米醇溶蛋白納米顆粒的穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明：該涂層可以吸附到玉米醇溶蛋白納米顆粒表面并增加它們的靜電和空間排斥，進(jìn)而提高納米顆粒的穩(wěn)定性。楊曉泉團(tuán)隊(duì)[11-18]近五年來在玉米醇溶蛋白的改性、制粒與應(yīng)用方面做了大量工作，包括制備蛋白納米粒子，利用干法制備玉米肽糖基化納米粒子，利用玉米醇溶蛋白與多糖及蛋白質(zhì)的相互作用合成多種玉米醇溶蛋白復(fù)合粒子（包括玉米醇溶蛋白/酪朊酸鈉、玉米醇溶蛋白/硬脂酸、玉米醇溶蛋白/甜菜果膠、玉米醇溶蛋白/甲殼素復(fù)合粒子等），并對這些粒子在活性物質(zhì)輸送和乳液穩(wěn)定等領(lǐng)域做了一系列的研究，這些研究為拓寬玉米醇溶蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域奠定了良好的基礎(chǔ)。

美拉德反應(yīng)是氨基化合物（如胺、氨基酸、蛋白質(zhì)等）和羰基化合物（糖類）之間發(fā)生的非酶褐變反應(yīng)，也稱為羰氨反應(yīng)。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard reaction products，MRPs）種類繁多，不僅對食品的色澤、風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)，還能提高食品的氧化穩(wěn)定性，延長貨架期[19]。通過美拉德反應(yīng)來改善蛋白質(zhì)功能特性，其反應(yīng)本質(zhì)是利用生物大分子多糖的多羥基特性改善共價(jià)復(fù)合物的親水-親油平衡，利用多糖的無規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu)特質(zhì)改善復(fù)合物的熱穩(wěn)定性，同時(shí)利用多糖的大分子本質(zhì)改善復(fù)合物的界面空間穩(wěn)定效果[20]，美拉德反應(yīng)被廣泛用于蛋白質(zhì)的改性[21]。由于玉米醇溶蛋白不溶于水，這極大地限制了美拉德反應(yīng)在玉米醇溶蛋白改性中的應(yīng)用，目前僅極少量文獻(xiàn)報(bào)道在干熱條件下玉米醇溶蛋白可與單糖發(fā)生美拉德反應(yīng)[22]，然而，對于濕熱條件下玉米醇溶蛋白與還原糖的美拉德反應(yīng)及其產(chǎn)物在姜黃素納米顆粒制備中的應(yīng)用還未見報(bào)道。

由于葡萄糖（Glucose，Glu）在乙醇水溶液中具有較好的溶解性，本文首先利用葡萄糖為模式多糖，通過美拉德反應(yīng)對玉米醇溶蛋白進(jìn)行改性，研究美拉德反應(yīng)發(fā)生的最適條件，對所得MRP 的部分性質(zhì)進(jìn)行表征；然后，利用反溶劑法制備姜黃素納米顆粒，研究所得納米顆粒的部分性質(zhì)，并與未改性玉米醇溶蛋白比較，以明確美拉德反應(yīng)能否提高玉米醇溶蛋白納米顆粒的功能性質(zhì)。本文有望為美拉德反應(yīng)在玉米醇溶蛋白改性中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白（食品級），高郵市日星藥用輔料有限公司；姜黃素（分析純），上海生工生物工程股份有限公司；葡萄糖（分析純），天津市光城化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白（生化試劑），天津市巴斯夫化工有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、95%乙醇、磷酸（分析純），萊陽市東方化工有限公司。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計(jì)（UV-2000），上海尤尼科儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器（90-3），上海亞榮生化儀器廠；低速大容量離心機(jī)（DL-5-B），上海安亭儀器設(shè)備廠；激光粒度分析儀（NANO ZS90），英國馬爾文儀器公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S），鞏義市于華儀器有限責(zé)任公司；真空冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-10N），寧波新之生物科技股份有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀（NicoletIR200），賽默飛世爾科技；熱重分析儀（TGA 2-SF），梅特勒-托利多儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 Zein/Glu 美拉德反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.3.1.1 時(shí)間對Zein/Glu 美拉德反應(yīng)的影響 取10 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的玉米醇溶蛋白-乙醇溶液（70%），按葡萄糖和玉米醇溶蛋白質(zhì)量比2∶1 加入0.6 g 葡萄糖。用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至13.0，置于90 ℃水浴中分別反應(yīng)30，60，90，120，150 min后冷卻至室溫。取反應(yīng)溶液適當(dāng)稀釋后，測定美拉德反應(yīng)發(fā)生的程度。

1.3.1.2 溫度對Zein/Glu 美拉德反應(yīng)的影響 取10 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的玉米醇溶蛋白-乙醇溶液（70%），按葡萄糖和玉米醇溶蛋白質(zhì)量比2∶1 加入0.6 g 葡萄糖。用NaOH 溶液和HCl 溶液調(diào)節(jié)pH 至13.0，分別置于50，60，70，80，90 ℃水浴下反應(yīng)90 min 后，冷卻至室溫。取反應(yīng)溶液適當(dāng)稀釋后，測定美拉德反應(yīng)發(fā)生的程度。

1.3.1.3 pH 值對Zein/Glu 美拉德反應(yīng)的影響 取10 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的玉米醇溶蛋白-乙醇溶液（70%），按葡萄糖和玉米醇溶蛋白質(zhì)量比2∶1 加入0.6 g 葡萄糖。用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 分別至10.0，11.0，12.0，13.0，14.0，置于90 ℃水域中反應(yīng)90 min 后，冷卻至室溫。取反應(yīng)溶液適當(dāng)稀釋后，測定美拉德反應(yīng)發(fā)生的程度。

1.3.1.4 混合比例對Zein/Glu 美拉德反應(yīng)的影響取10 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的玉米醇溶蛋白-乙醇溶液（70%），按葡萄糖和玉米醇溶蛋白質(zhì)量比1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，1∶2，1∶3 分別加入葡萄糖。用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 值至13.0，置于90 ℃水域中反應(yīng)90 min 后，冷卻至室溫。取反應(yīng)溶液適當(dāng)稀釋后，測定美拉德反應(yīng)發(fā)生的程度。

1.3.2 MRP 的表征

1.3.2.1 MRP 程度的測定 Zein/Glu 美拉德反應(yīng)的程度用其在290 nm 和420 nm 下的吸光值表示。等美拉德反應(yīng)完成后，取出部分樣品并用70%乙醇適當(dāng)稀釋，以70%乙醇為參照，分別在290 nm 和420 nm 下比色。

1.3.2.2 溶液pH 值變化 待在最佳條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)后，直接用pH 計(jì)測定反應(yīng)體系的pH值，以未發(fā)生美拉德反應(yīng)的玉米醇溶蛋白-乙醇溶液作為對照。

1.3.2.3 玉米醇溶蛋白溶解性 通過反應(yīng)體系中可溶性蛋白的含量來間接反應(yīng)美拉德反應(yīng)對玉米醇溶蛋白溶解性的影響，可溶性蛋白的含量采用考馬斯亮藍(lán)G250 法測定，以牛血清白蛋白為參照[7]。

1.3.3 負(fù)載姜黃素的Zein/Glu MRP 納米顆粒取100 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的玉米醇溶蛋白-乙醇溶液（70%），在最佳條件下制備Zein/Glu MRP，反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，用磁力攪拌器以500 r/min 攪拌1 h，之后加入0.36 g 姜黃素持續(xù)攪拌1 h，3 000 r/min 離心10 min，除去不溶性雜質(zhì)，得到澄清的溶液，4 ℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

將4 mL 上述過程中制備所得溶液用1 mL 注射器分4 次緩慢分散至16 mL pH 4.0 的蒸餾水中，分散的同時(shí)以1 000 r/min 的速度磁力攪拌3 min，得納米顆粒分散液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)掉乙醇，并用相同體積pH 4.0 的蒸餾水補(bǔ)充至20 mL，制得負(fù)載了姜黃素的Zein/Glu MRP 納米顆粒分散液。用未發(fā)生美拉德反應(yīng)的玉米醇溶蛋白按照相同的工藝制備負(fù)載了姜黃素的納米顆粒作為對照。

將所得納米顆粒分散液分別倒入平皿，-18℃下冷凍48 h 后用真空冷凍機(jī)凍干，輕輕研磨成均勻粉末后置于干燥箱內(nèi)備用。

1.3.4 包埋效率及載藥量 準(zhǔn)確稱取6 mg 姜黃素溶解于100 mL 95%的乙醇溶液中，振蕩搖勻。準(zhǔn)確吸取上述溶液0.25，0.5，1，2，3，4 mL，用乙醇定容至15 mL，分別配制成1，2，4，8，12，16 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外可見分光光度計(jì)測定波長在425 nm 時(shí)的吸光度值，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制得到姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線[23]。根據(jù)如下兩個(gè)公式計(jì)算包埋效率和載藥量：

1.3.4.1 納米顆粒表面姜黃素含量 準(zhǔn)確稱取0.1 g 納米顆粒粉末于試管中，加入10 mL 無水乙醇，輕輕搖晃1 min。靜置一段時(shí)間后，取其上清液1 mL，加入9 mL 無水乙醇稀釋。以無水乙醇作對照，測定425 nm 處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定姜黃素含量[24]。

1.3.4.2 納米顆粒中姜黃素總含量 準(zhǔn)確稱取0.1 g 納米顆粒粉末于試管中，加入10 mL 無水乙醇，在室溫下用500 W 超聲處理15 min 以提取姜黃素。此時(shí)試管下層為白色沉淀，上清液為黃色液體。3 000 r/min 離心5 min，取其上清液1 mL，加入9 mL 無水乙醇稀釋。以無水乙醇作對照，測定425 nm 處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定姜黃素含量[24]。

1.3.5 紅外光譜 取少量凍干后的樣品粉末于瑪瑙研缽中，加入一定量KBr 進(jìn)行研磨，將研磨好的粉末壓片。將壓片置于紅外光譜儀在波長4 000～400 cm-1進(jìn)行掃描分析，空白KBr 作為背景對照[25]。

1.3.6 微觀結(jié)構(gòu) 在導(dǎo)電膠上將凍干粉末狀樣品均勻分散，置于金屬載物臺(tái)上，電壓為2 kV，用常溫真空噴鍍法噴金處理，置于掃描電鏡下觀察，選取具有代表性的視野，進(jìn)行顯微拍攝。

1.3.7 釋放率 準(zhǔn)確稱取凍干納米顆粒25 mg 用80 目尼龍網(wǎng)紗過濾網(wǎng)布包住，加入無水乙醇溶液250 mL，常溫磁力攪拌，分別于0，1，2，3，4，5 h 時(shí)取1 mL 上清液，加入1 mL 無水乙醇稀釋后測定425 nm 處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定姜黃素的含量[24]。每次取出1 mL 釋放液后再新加入1 mL無水乙醇以保持體系體積恒定。

1.3.8 熱穩(wěn)定性 稱取待測樣品粉末0.0030 g 加入到熱重分析儀坩堝中，以氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)氣，按10℃/min 的速率從30 ℃加熱到500 ℃，以未發(fā)生美拉德反應(yīng)的玉米醇溶蛋白姜黃素納米顆粒作為對照，通過計(jì)算機(jī)記錄加熱過程中的數(shù)據(jù)以及加熱變化曲線[26]。

1.3.9 貯藏穩(wěn)定性 將在最適條件下制備的裝載了姜黃素的玉米醇溶蛋白納米顆粒溶液和Zein/Glu MRP 納米顆粒溶液于室溫下放置一段時(shí)間，分別在第0 h、1 周、2 周、3 周、4 周和5 周時(shí)取樣，測定粒徑和電勢變化。

1.3.9.1 粒徑 將納米顆粒分散液用70%乙醇稀釋200 倍后，通過粒度分析儀在默認(rèn)條件下測定粒徑，每個(gè)樣品測量3 次[27]。

1.3.9.2 Zeta 電勢 將納米顆粒分散液用70%乙醇稀釋200 倍后，通過粒度分析儀在默認(rèn)條件下測定zeta 電勢，每個(gè)樣品測量3 次[27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本論文中所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用OriginPro Portable 作圖，結(jié)果以±s 表示。采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異顯著性分析采用方差分析（ANOVA）中的Tukey HSD 測試，當(dāng)P＜0.05 時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zein/Glu 美拉德反應(yīng)條件的優(yōu)化

圖1 時(shí)間對Zein-Glu 美拉德反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of reaction time on the Maillard reaction between zein and glucose

2.1.1 時(shí)間對Zein/Glu 美拉德反應(yīng)的影響 美拉德反應(yīng)初級階段和中間階段的產(chǎn)物分別在290 nm 和420 nm 處有較強(qiáng)吸收，因此可用這兩個(gè)波長下的吸光值來表示美拉德反應(yīng)程度的變化[28]。由圖1可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，Zein/Glu MRP和玉米醇溶蛋白的A290nm和A420nm均呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢，但前者的吸光值在所有反應(yīng)時(shí)間下均大于后者，表明玉米醇溶蛋白與葡萄糖之間發(fā)生了美拉德反應(yīng)。目前絕大多數(shù)多糖的美拉德反應(yīng)均發(fā)生在水溶液中，但在有機(jī)相中的美拉德反應(yīng)目前還極少有報(bào)道[29]，這可能是美拉德反應(yīng)尚未被用于玉米醇溶蛋白改性的一個(gè)重要原因。在本文中，由于葡萄糖在乙醇水溶液中具有較好的穩(wěn)定性，這為其與玉米醇溶蛋白分子的充分接觸和美拉德反應(yīng)的發(fā)生創(chuàng)造了條件。圖1的結(jié)果表明，玉米醇溶蛋白與單糖在有機(jī)相中也可以發(fā)生美拉德反應(yīng)，因此美拉德反應(yīng)也可以用于玉米醇溶蛋白的改性。

當(dāng)反應(yīng)時(shí)間由30 min 增加至90 min 時(shí)，Zein/Glu MRP 的A290nm和A420nm隨之增加，表明美拉德反應(yīng)的初級產(chǎn)物大量生成并轉(zhuǎn)化為中間階段產(chǎn)物[28]；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)一步延長至120 min 和150 min 時(shí)，兩個(gè)吸光值均隨之顯著下降，表明此時(shí)中間階段產(chǎn)物被大量消耗生成了高分子產(chǎn)物，美拉德反應(yīng)開始進(jìn)入高級階段。由于高級階段產(chǎn)物溶解度差、副產(chǎn)物多，因此本文選擇90 min 為玉米醇溶蛋白的最佳改性時(shí)間進(jìn)行后續(xù)研究。

2.1.2 溫度對Zein-Glu 美拉德反應(yīng)的影響 溫度對Zein-Glu 美拉德反應(yīng)的影響見圖2。隨著溫度的升高，Zein/Glu MRP 的A290nm和A420nm均呈現(xiàn)增長的趨勢，且Zein 在兩個(gè)波長下的吸光值都小于Zein/Glu MRP，進(jìn)一步證實(shí)玉米醇溶蛋白與葡萄糖之間發(fā)生了美拉德反應(yīng)，且高溫有利于反應(yīng)的發(fā)生，這與絕大部分蛋白質(zhì)-糖體系的美拉德反應(yīng)規(guī)律一致[4]。由于在選定的溫度范圍內(nèi)A290nm和A420nm均未呈現(xiàn)下降趨勢，表明此時(shí)美拉德反應(yīng)都在初級和中級階段，因此選取90 ℃為最適反應(yīng)溫度進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 溫度對Zein-Glu 美拉德反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of temperature on the Maillard reaction between zein and glucose

2.1.3 pH 值對Zein-Glu 美拉德反應(yīng)的影響 由于玉米醇溶蛋白在堿性溶液中有較好的溶解性[30]，因此本文還研究了pH 值對Zein-Glu 美拉德反應(yīng)的影響。由圖3可以看出，隨著體系pH 值由10增至13，Zein/Glu MRP 的A290nm和A420nm均隨之顯著增加；但是當(dāng)pH 值達(dá)到14 時(shí)，兩個(gè)吸光值均劇烈下降，表明極堿性質(zhì)不利于玉米醇溶蛋白與葡萄糖之間美拉德反應(yīng)的發(fā)生。因此選取pH 13為最適pH 值進(jìn)行后續(xù)研究。

2.1.4 混合比例對Zein/Glu 美拉德反應(yīng)的影響玉米醇溶蛋白與葡萄糖的質(zhì)量比對兩者美拉德反應(yīng)的影響見圖4。在玉米醇溶蛋白質(zhì)量不變的情況下，隨著葡萄糖質(zhì)量的增加，Zein/Glu MRP 的A290nm和A420nm都呈現(xiàn)出先增大后減小的變化趨勢，且在玉米醇溶蛋白與葡萄糖的質(zhì)量比為1∶3時(shí)達(dá)到最大值。這表明，當(dāng)葡萄糖過量時(shí)僅會(huì)使玉米醇溶蛋白發(fā)生微弱的糖基化反應(yīng)?？紤]到葡萄糖為單糖，微弱的美拉德反應(yīng)可能會(huì)對玉米醇溶蛋白功能性質(zhì)的改善不夠明顯，因此本文確定Zein∶Glu 質(zhì)量比1∶3 為最佳混合比例，在上述確定的最佳條件下制備Zein/Glu MRP 進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 pH 值對Zein-Glu 美拉德反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of pH on Maillard reaction between zein and glucose

圖4 Zein 與Glu 的比例對Zein-Glu 美拉德反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of zein to Glu mass ratio on their Maillard reaction

2.2 Zein/Glu MRP 的表征

2.2.1 溶液pH 值變化 由于與多糖的美拉德反應(yīng)會(huì)消耗掉-NH2并產(chǎn)生小分子有機(jī)酸，因此蛋白質(zhì)-糖之間的美拉德反應(yīng)通常會(huì)使反應(yīng)體系的pH值降低[31]。美拉德反應(yīng)前后反應(yīng)體系pH 變化見圖5a?？梢钥闯?，起始Glu/Zein 混合溶液的pH 值為13，在最適條件下反應(yīng)一段時(shí)間后急劇下降至7.85，而未發(fā)生美拉德反應(yīng)的玉米醇溶蛋白溶液pH 值僅發(fā)生了輕微變化（pH 11.51）。這進(jìn)一步證實(shí)了玉米醇溶蛋白與葡萄糖之間發(fā)生了美拉德反應(yīng)，且反應(yīng)程度較為劇烈。

2.2.2 玉米醇溶蛋白溶解性 美拉德反應(yīng)通常會(huì)提高蛋白質(zhì)的溶解性[32]。美拉德反應(yīng)前后可溶性蛋白含量變化見圖5b。未改性玉米醇溶蛋白的可溶性蛋白含量為231.54 mg/g，而在本文選擇的最佳條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)后達(dá)到了287.79 mg/g，增加了24.3%，這表明美拉德反應(yīng)使得玉米醇溶蛋白的溶解性得到了改善。

2.3 包埋效率及載藥量

美拉德反應(yīng)對玉米醇溶蛋白包埋效果的影響見圖6所示。以姜黃素作為芯材時(shí)，Zein/Glu MRP的包埋效率為53.10%，載藥量為1.59%；而玉米醇溶蛋白的包埋效率僅為2.30%，而載藥量則達(dá)到了2.80%。這表明，與葡萄糖的美拉德反應(yīng)可以顯著提升玉米醇溶蛋白的包埋效率，從而使得大部分姜黃素被包埋于納米顆粒內(nèi)部。在納米顆粒的制備過程中未發(fā)生姜黃素的損失，因此理論上兩種納米顆粒的載藥量應(yīng)該相同。圖6中載藥量的差異可能與包埋效率有關(guān)系。由于Zein/Glu MRP 納米顆粒的包埋率更高，導(dǎo)致在利用無水乙醇提取時(shí)不完全，結(jié)果使測得的載藥量有所降低。

圖5 美拉德反應(yīng)對反應(yīng)體系pH 值（a）及可溶性蛋白含量（b）的影響Fig.5 Effect of Maillard reaction on the pH （a）and soluble protein content （b）of the reaction system

圖6 美拉德反應(yīng)對玉米醇溶蛋白包埋效率的影響Fig.6 Effect of Maillard reaction on the embedding efficiency of zein

2.4 傅里葉紅外光譜分析

納米顆粒的紅外光譜分析圖見圖7。酰胺（RCONH2）的特征吸收峰出現(xiàn)在3 050～3 500 cm-1處，所有樣品都在這個(gè)波數(shù)范圍內(nèi)有一個(gè)較寬的吸收峰，其中裝載了姜黃素的Zein/Glu MRPs 納米顆粒的峰相較于裝載了姜黃素的玉米醇溶蛋白納米顆粒的峰寬，表明發(fā)生的美拉德反應(yīng)會(huì)改變酰胺基團(tuán)的含量；羰基（C=O）的特征吸收峰在1 750～1 680 cm-1，由圖7可知，裝載了姜黃素的Zein/Glu MRP 納米顆粒在此范圍內(nèi)的峰比裝載了姜黃素的玉米醇溶蛋白納米顆粒、姜黃素和玉米醇溶蛋白的峰寬，表明玉米醇溶蛋白與葡萄糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)。

2.5 溶液形態(tài)

圖7 裝載了姜黃素的Zein 和Zein/Glu MRP納米顆粒的紅外光譜圖Fig.7 FTIR spectrum of the curcumin-loaded zein and Zein/Glu MRP nanoparticles

圖8 Zein（a）和Zein/Glu MRP（b）穩(wěn)定姜黃素納米顆粒溶液形態(tài)Fig.8 Morphology of the aqueous curcumin solutions stabilized by zein （a）and Zein/Glu MRP （b）

由兩種玉米醇溶蛋白穩(wěn)定的姜黃素納米顆粒溶液的形態(tài)見圖8。玉米醇溶蛋白和姜黃素本身均溶于水，但是圖8可以看出整個(gè)體系非常均一，無分層或沉淀出現(xiàn)，表明納米顆粒乳液制備成功。另外，Zein/Glu MRP 穩(wěn)定乳液（圖8b）的顏色要深于玉米醇溶蛋白穩(wěn)定的姜黃素納米顆粒溶液，這是由于美拉德反應(yīng)導(dǎo)致褐變所致。

2.6 微觀結(jié)構(gòu)

裝載了姜黃素的Zein/Glu MRP 納米顆粒凍干后的掃描電鏡狀態(tài)見圖9所示。可以看出，納米顆粒之間發(fā)生了較為嚴(yán)重的聚集現(xiàn)象，這可能會(huì)影響凍干粉末的流動(dòng)性；雖然如此，基質(zhì)表面可以看到較多的球狀結(jié)構(gòu)，表明形成的納米顆粒為球形。有文獻(xiàn)報(bào)道表明，玉米醇溶蛋白通過反溶劑法制備的蘆丁納米顆粒[33]和姜黃素納米顆粒[34]均為球形，這與圖9的結(jié)果基本一致，但是這兩篇報(bào)道中均未觀察到嚴(yán)重的聚集現(xiàn)象，表明美拉德反應(yīng)可能會(huì)改變玉米醇溶蛋白的表面性質(zhì)，從而使得聚集的趨勢增強(qiáng)。

2.7 釋放率

為了檢驗(yàn)所得納米顆粒是否具有緩釋功能，對兩種負(fù)載了姜黃素的納米顆粒在乙醇中的釋放性能進(jìn)行了研究。由圖10可知，隨著釋放時(shí)間的延長，兩種納米顆粒中姜黃素的釋放率均隨著浸泡時(shí)間的延長而增加，當(dāng)浸泡時(shí)間達(dá)到12 h 時(shí)，兩種納米顆粒中姜黃素的釋放率分別達(dá)到了76.91%和82.96%。另外，裝載了姜黃素的玉米醇溶蛋白納米顆粒在浸泡的起始階段（1～6 h）姜黃素的釋放率急劇增加，隨后緩慢變化，表現(xiàn)為“突釋”行為（burst release），裝載了蘆丁的玉米醇溶蛋白納米顆粒也表現(xiàn)出了類似的釋放行為[8]；而裝載了姜黃素的Zein/Glu MRP 納米顆粒中的姜黃素在整個(gè)浸泡過程中釋放率均比較穩(wěn)定，表現(xiàn)出了較好的緩釋功能 （sustainable release）。這是由于Zein/Glu MRP 納米顆粒的保留率更高，被包埋在顆粒內(nèi)部的姜黃素釋放較為困難，從而使最終的累積釋放率較低，但是釋放速度更加緩慢。因此，通過美拉德反應(yīng)可以改善玉米醇溶蛋白納米顆粒的緩釋性能。

圖9 裝載了姜黃素的Zein/Glu MRP納米顆粒的掃描電鏡圖Fig.9 SEM images of the curcumin-loaded Zein/Glu MRPs nanoparticles

2.8 熱穩(wěn)定性

納米顆粒的TGA 變化見圖11。姜黃素的質(zhì)量損失大致分為兩個(gè)階段，從200 ℃左右時(shí)，反應(yīng)物的質(zhì)量開始下降，到400 ℃左右時(shí)，質(zhì)量損失約45%，隨后失重速率降低，400～500 ℃期間，質(zhì)量損失約5%。玉米醇溶蛋白及裝載了姜黃素的玉米醇溶蛋白納米顆粒的質(zhì)量損失大體可以分為3 個(gè)階段，從100 ℃左右時(shí)，兩種樣品的質(zhì)量均降低了5%左右，這是由于失水所至，隨后失重速率降低；從260～350 ℃時(shí)，兩種樣品的質(zhì)量降低到了50%左右，質(zhì)量損失約45%，裝載了姜黃素的玉米醇溶蛋白納米顆粒開始失重緩慢，而玉米醇溶蛋白失重速率依舊增加，在370 ℃時(shí)達(dá)到峰值；從370～500 ℃玉米醇溶蛋白的質(zhì)量降低到了25%左右，而裝載了姜黃素的玉米醇溶蛋白納米顆粒的質(zhì)量降低到了35%左右。

裝載了姜黃素的Zein/Glu MRP 納米顆粒的質(zhì)量損失大致分為4 個(gè)階段，在100 ℃左右質(zhì)量降低到約90%；當(dāng)溫度達(dá)到150～200 ℃之間時(shí)，失重率進(jìn)一步劇烈下降，納米顆粒的質(zhì)量降低到65%左右，而另外3 個(gè)樣品中未觀察到此現(xiàn)象，表明美拉德反應(yīng)生成了一些易熱分解或易揮發(fā)的物質(zhì)；當(dāng)溫度進(jìn)一步升高到500 ℃時(shí)，納米顆粒的質(zhì)量緩慢降低到30%左右，這一數(shù)值高于玉米醇溶蛋白納米顆粒和玉米醇溶蛋白，表明發(fā)生了美拉德反應(yīng)的玉米醇溶蛋白再包埋姜黃素能夠提高納米顆粒的熱穩(wěn)定性。

2.9 貯藏穩(wěn)定性

2.9.1 粒徑 貯藏時(shí)間對納米顆粒粒徑的影響見圖12a。無論是裝載了姜黃素的玉米醇溶蛋白納米顆粒還是裝載了姜黃素的Zein/Glu MRP 納米顆粒，粒徑均隨著貯藏時(shí)間的延長而增加，表明顆粒發(fā)生了聚集，穩(wěn)定性有所降低。剛制備的兩種納米顆粒溶液的粒徑并無顯著差別，但是在第3～5周時(shí)Zein/Glu MRP 穩(wěn)定姜黃素納米顆粒顯著小于玉米醇溶蛋白納米顆粒，表明前者具有更好的穩(wěn)定性。

圖11 裝載了姜黃素的Zein/Glu MRP納米顆粒的熱重分析Fig.11 Thermal weight analysis of the curcumin-loaded Zein/Glu MRP nanoparticles

2.9.2 Zeta 電勢 貯藏過程中兩種納米顆粒Zeta電勢的變化如圖12b 所示。可以看出，剛制備的Zein/Glu MRP 納米顆粒帶負(fù)電荷，而玉米醇溶蛋白納米顆?；境孰娭行?；當(dāng)貯藏時(shí)間達(dá)到2 周時(shí)，玉米醇溶蛋白納米顆粒的電勢無顯著變化，而Zein/Glu MRP 納米顆粒的電勢顯著降低；當(dāng)貯藏時(shí)間進(jìn)一步延長時(shí)，玉米醇溶蛋白納米顆粒的電勢顯著增加，而Zein/Glu MRP 納米顆粒的電勢開始下降且顯著低于前者。

圖12 貯藏時(shí)間對裝載了姜黃素的Zein 和Zein/Glu MRP 納米顆粒粒徑（a）及Zeta 電勢（b）的影響Fig.12 Effect of storage time on the particle size （a）and zeta potential （b）of curcumin-loaded zein and Zein/Glu MRP nanoparticles

上述現(xiàn)象可能與兩種納米顆粒的包埋率有關(guān)。由圖6可知，玉米醇溶蛋白納米顆粒表面附著的油量大于Zein/Glu MRP 納米顆粒，油層會(huì)屏蔽玉米醇溶蛋白表面的電荷，從而使得玉米醇溶蛋白納米顆粒的表面電荷基本為0，而后者攜帶負(fù)電荷（圖12b）。攜帶的負(fù)電荷增加了顆粒之間的靜電斥力，因此有利于Zein/Glu MRP 納米顆粒在貯藏過程中的穩(wěn)定性（圖12a）。但是當(dāng)貯藏時(shí)間達(dá)到3 周及以上時(shí)，玉米醇溶蛋白納米顆粒表面附著的油滴通過疏水性相互作用聚集到一起并從納米顆粒表面脫落從而導(dǎo)致電勢增加，而Zein/Glu MRP 顆粒則由于姜黃素從顆粒中緩慢泄露出來而覆蓋在顆粒表面導(dǎo)致其電勢增加。

3 結(jié)論

在70%的乙醇溶液中，玉米醇溶蛋白可以與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，且當(dāng)以控制美拉德反應(yīng)在中間階段為目標(biāo)時(shí)兩者的最適反應(yīng)條件為Zein∶Glu 質(zhì)量比3∶1、溶液pH 13、反應(yīng)溫度90 ℃、反應(yīng)時(shí)間90 min。在此條件下，反應(yīng)體系的pH 值由13 急劇下降至7.85，可溶性蛋白質(zhì)含量增加了24.3%。在上述最佳條件下制備的Zein/Glu MRP以反溶劑法制備姜黃素納米顆粒，與未改性的玉米醇溶蛋白相比，包埋效率提高了22 倍，且在乙醇溶液中具有更好的緩釋性能；同時(shí)，其熱穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性都得到了顯著提高。因此，玉米醇溶蛋白與葡萄糖在70%乙醇溶液中發(fā)生的美拉德反應(yīng)對玉米醇溶蛋白作為一種納米顆粒載體的功能性質(zhì)有顯著的促進(jìn)作用。