王文華，李秀婷，徐友強，李微微，孫寶國*

（1 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京工商大學(xué) 北京100048 2 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京工商大學(xué) 北京100048）

鄰苯二甲酸酯類 （Phthalate Esters，PAEs）因在提高塑料制品穩(wěn)定性、柔韌性、凝聚力和防水性能等方面具有優(yōu)良特性，故自20 世紀50年代起被廣泛添加到各種塑料制品中[1-2]。目前全球PAEs的年消耗量高達6 800 萬t[3]，主要用于建筑、汽車、醫(yī)療產(chǎn)品、電線和電纜行業(yè)；也用作油漆、黏合劑、化妝品和潤滑劑的添加劑[2]。PAEs 與塑料非共價連接，很容易從塑料中浸出和遷移到周圍環(huán)境基質(zhì)中[4-7]。由于大量生產(chǎn)和廣泛使用，因此PAEs在不同環(huán)境中被頻繁檢出[8-12]。環(huán)境中的PAEs 會通過食物鏈對水生生物和人類健康產(chǎn)生負面影響[13]。如PAEs 可與雌激素受體結(jié)合，引起激素紊亂[14]；干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)[15]；誘導(dǎo)生殖毒性[16-17]，肝臟過氧化物酶體增殖[18]，肝細胞腫瘤[19]；誘發(fā)兒童肥胖[20]，并可能危害胎兒健康[21]。

隨著對其危害的逐步認識，PAEs 引發(fā)的健康問題成為人們關(guān)注的焦點，美國環(huán)保局已將最常見的PAEs 列為優(yōu)先控制環(huán)境污染物[22-23]。除了在水體、土壤檢測到PAEs 外，水稻、小麥、高粱等農(nóng)作物中也不同程度地被檢出鄰苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（Diethyl phthalate，DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DBP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（Diisobutyl phthalate，DiBP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯〔Di（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP〕[24]，可能通過飲食攝入增加人體健康風(fēng)險。高效降解鄰苯二甲酸酯成為解決這一問題的關(guān)鍵。

在自然條件下，PAEs 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，其水解、光解速度非常緩慢，屬于難降解物質(zhì)[25-26]。在去除鄰苯二甲酸酯的研究中，細菌降解的主導(dǎo)作用被廣泛報道，成為環(huán)境中去除PAEs 的主要微生物[1，27]，且新的高效降解細菌不斷被發(fā)現(xiàn)，如從白酒曲中篩選獲得1 株康氏副球菌 （Paracoccus.kondratievae）BJQ0001，對PAEs 降解有重要作用[28]。

本試驗從酒醅中分離出1 株可有效降解DBP的不動桿菌屬細菌，命名為Aci-17。利用GenBank上已知酯降解基因序列的高度同源區(qū)設(shè)計引物，從菌株Aci-17 基因組中克隆出1 個全長1 077 bp 的酯鍵水解酶基因，其重組表達蛋白除了具有高效降解DBP 能力外，還可高效降解DMP、DEP、DiBP。借助生物信息學(xué)軟件對其進行生物信息學(xué)分析，在I-TASSER 在線建模基礎(chǔ)上，通過Est96蛋白與配體分子對接方法，探究Est96 催化鄰苯二甲酸酯生物降解機制，以期為鄰苯二甲酸酯生物降解提供重要依據(jù)。也為不動桿菌Aci-17 的后續(xù)開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不動桿菌Aci-17 從酒醅中分離獲得，聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，基因測序委托華大基因完成。細菌基因組DNA 提取試劑盒、大腸桿菌（E.coli）DH5α 感受態(tài)細胞、大腸桿菌BL21 感受態(tài)細胞，購自天根生化科技（北京）有限公司；克隆載體pMD18-T、Trans Taq-T DNA聚合酶、NovoRecRPCR 一步定向克隆試劑盒、表達載體pCold-TF，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 培養(yǎng)基

MSMY 培養(yǎng)基：根據(jù)Li 等[29]在礦物鹽培養(yǎng)基（mineral salt medium，MSM）基礎(chǔ)上添加酵母膏成分的改良礦鹽培養(yǎng)基；DBP 溶解在二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）中，并在加入培養(yǎng)基之前通過0.22 μm 的無菌膜過濾。

LB 培養(yǎng)基：酵母膏（5.0 g/L）、胰蛋白胨（10.0 g/L）和氯化鈉（10.0 g/L）。

1.3 儀器與設(shè)備

EPS301 瓊脂糖凝膠電泳儀、DYY-III-8B 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一儀器廠；ImageQuant 300凝膠成像儀、Multitemp Ⅲ恒溫循環(huán)水浴器，美國GE 公司；HR60-IIA2 生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；Microfuge 20R 高速冷凍離心機，美國Beckman Coulter 公司；T100-Thermal cycler PCR 儀，美國Bio-Rad 公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.4 方法

1.4.1 Aci-17 對DBP 的生物降解 參考Xu 等[28]的方法，將Aci-17 在LB 培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)后，細胞培養(yǎng)物（體積分數(shù)2%）接種到含DBP 的MSMY培養(yǎng)基中，DBP 最終質(zhì)量濃度分別為200，400，600 mg/L 和800 mg/L。試驗設(shè)置3 個平行。在96 h 培養(yǎng)期內(nèi)每隔12 h 收集細胞培養(yǎng)樣品（10 mL），加入正己烷（2 mL），將所有試劑轉(zhuǎn)移到50 mL 管中并劇烈混合30 s。13 000×g 下離心5 min，收集上清液，0.22 μm 無菌膜過濾，使用氣相色譜定量測定殘余的DBP。

1.4.2 16 S rDNA 測序 離心收集過夜培養(yǎng)Aci-17 菌體，按照細菌基因組DNA 試劑盒操作步驟提取基因組DNA，檢測其純度合格后，以細菌總DNA 為模板，16S 通用引物擴增16S 序列。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR 產(chǎn)物送至華大基因測序有限公司測序。將測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中核酸序列進行比對，選取同源性高的菌株的16S rDNA 序列，利用MEGA 7.0 軟件進行多序列比對，用鄰接（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.3 基因Est96 克隆、重組載體構(gòu)建及蛋白誘導(dǎo)表達 根據(jù)文獻報道具有降解PAEs 能力的不動桿菌LMB-5 全基因組信息[30]及GenBank 上已知的不動桿菌酯酶基因序列 （GenBank 登陸號：AGY55959.1，AFK31309.1，AEW03609.1，WP_163143359.1，HAK15034.1，ENV65051.1，OJU 85238.1，EPH30775.1），利用序列的高度同源區(qū)設(shè)計目的基因保守區(qū)簡并引物 （表1），PCR 擴增獲得基因保守序列，依據(jù)保守區(qū)域測序結(jié)果及高度同源序列設(shè)計全長引物（表1），以Aci-17 基因組DNA 為模板PCR 擴增，擴增條件：94 ℃、5 min；94℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、2.5 min，循環(huán)30 次；72℃、10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物條帶，送至華大基因進行基因序列測定。

表1 克隆表達過程使用引物Table 1 Primers used for amplification and recombinant construction of expression vector

使用根據(jù)In-Fusion 設(shè)計含EcoRⅠ酶切位點的引物將目的基因克隆至原核表達載體pCold-TF 載體，將重組質(zhì)粒pCold-TF-Est96 轉(zhuǎn)化到E.coli BL21 （DE3）中，選擇測序正確的轉(zhuǎn)化子搖瓶培養(yǎng)至OD600值達0.6～0.8 時加入終濃度為50 mmol/L 的IPTG，在20、200/min 條件下培養(yǎng)20 h，13 000×g 離心5 min 收集菌體，Tris-HCl 洗滌2次后懸浮細胞，超聲破碎，離心取上清即為Est96粗酶液。

1.4.4 酯酶Est96 生物信息學(xué)分析

1.4.4.1 酯酶Est96 氨基酸序列及基本性質(zhì)分析 氨基酸序列來源于NCBI 數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)序列；多序列比對借助Clustal Omega 和ESPript 3.0在線分析獲得；ExPASy-ProtParamtool 和SignalP 4.1 Server 預(yù)測工具用于對Est96 蛋白的理化性質(zhì)和信號肽分析。

1.4.4.2 親/疏水性及跨膜區(qū)分析 蛋白親水/疏水性分析由Expasy 網(wǎng)站ProScale 工具完成，蛋白跨膜區(qū)預(yù)測采用在線軟件TMHMM 2.0 進行。

1.4.4.3 二級、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測 在線提交Est96 氨基酸序列至SOPMA Secondary Structure Prediction Method 完成蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；三維結(jié)構(gòu)預(yù)測由I-TASSER 服務(wù)器在線計算完成。所用生物信息學(xué)在線分析工具見表2。

表2 生物信息學(xué)在線分析工具及網(wǎng)址Table 2 Bioinformatics online programs and web sites

1.4.5 酯酶Est96 功能驗證 參考Xu 等[28]的方法，反應(yīng)混合物在30 ℃，200 r/min 反應(yīng)12 h，反應(yīng)結(jié)束，如1.4.1 節(jié)所述方法制備樣品用于氣相色譜分析。

1.4.6 分析方法 參考Xu 等[28]方法，采用Agilent7890B 氣相色譜系統(tǒng)，色譜柱為Agilent 19091 Ne-213I 柱（30 m×0.32 mm×0.50 μm），以80 ℃恒溫5 min，20 ℃/min 的速率升溫至240 ℃，最后240 ℃保持恒溫25 min，進行定量分析。載氣為氮氣，流速1.0 mL/min，進樣量1.0 μL。Origin8.0 軟件用于統(tǒng)計分析，t 檢驗分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4.7 分子對接 為深入了解酯鍵水解酶Est96在DMP 降解過程中與配體間相互作用，對兩者進行了分子對接。使用PubChem 化合物數(shù)據(jù)庫檢索并獲得DMP 的SDF 格式[31]，借助Pymol 2.4.1 轉(zhuǎn)換為PDB 格式[32]。使用軟件AutoDockTools 1.5.6打開處理過的受體分子（Est96 酯酶）和配體分子（DMP）[33]，選定對接中心點區(qū)域三維坐標，即X=69.113，Y=57.253，Z=64.025，選擇I-TASSER 預(yù)測的Est96 活性位點作為潛在結(jié)合位點創(chuàng)建對接受體網(wǎng)格盒的空間為24?×24?×22?，網(wǎng)格間距0.375 ?，進行100 輪次擬合對接分析。選取具有最低結(jié)合能值的構(gòu)象進行分析，使用Discovery Studio 2020 在2D 層面上分析Est96 與DMP 形成的作用力，使用Pymol 2.4.1 對Est96 與DMP 在3D 空間形成的作用力進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Aci-17 對DBP 的生物降解

在以DBP 為唯一碳源的MSMY 培養(yǎng)基中，DBP 初始質(zhì)量濃度分別為200，400，600 mg/L 和800 mg/L 時，每24 h 測定培養(yǎng)基中殘留的DBP質(zhì)量濃度，經(jīng)過Aci-17 的生物降解，殘留DBP 質(zhì)量濃度與降解時間關(guān)系曲線如圖1所示，隨降解時間延長，體系中DBP 殘留量逐漸減小，96 h 時初始質(zhì)量濃度為200，400，600 mg/L 和800 mg/L的樣本中DBP 降解率分別為100.00%，78.20%，84.66%，64.11%。DBP 的初始濃度會影響Aci-17對DBP 的降解速率。

圖1 Aci-17 降解不同初始質(zhì)量濃度DBPFig.1 Degradation of different initial concentrations of DBP by Aci-17

2.2 16S rDNA 鑒定

圖2 Aci-17 基因組、16S PCR 擴增電泳驗證圖及16S rDNA 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Identification of extracted genome，16S PCR products and based phylogentic trees for 16S rDNA gene sequence of Aci-17

提取Aci-17 基因組DNA 電泳檢測如圖2a顯示，沒有明顯的拖尾現(xiàn)象。以基因組DNA 為模板，進行16S rDNA 擴增，瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰且片段大小在1～2 kb 之間（圖2b）。將PCR 擴增的16S rDNA 片段序列提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫進行相似性分析，通過Clustal X 軟件多重比對后，用MEGA 6.0 軟件中的Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2c）。

2.3 Est96 克隆、重組載體構(gòu)建及蛋白誘導(dǎo)表達

以Aci-17 基因組DNA 為模板簡并引物PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示200～250 bp 有明顯條帶（圖3a），DNAMAN 軟件分析測序結(jié)果顯示保守區(qū)序列長度為237 bp，依據(jù)此保守區(qū)序列及高度同源序列設(shè)計全長引物進行PCR 擴增，獲得編碼框全長1 077 bp 的Est96 基因（圖3b）。

按照1.4.3 節(jié)中方法得到Est96 粗酶液，SDSPAGE 電泳檢測結(jié)果顯示（圖3c），目的蛋白有單一且清晰的條帶，與預(yù)測大小相吻合，表明Est96成功表達為可溶性蛋白。

2.4 酯酶Est96 生物信息學(xué)分析

2.4.1 酯酶Est96 多序列比對及基本性質(zhì)分析利用ESPript3.0 在線程序?qū)С龅男蛄袑Ρ葓D （圖4）顯示Est96 與水解酶第Ⅳ家族氨基酸序列具有較高保守性，Est96 具有水解酶第Ⅳ家族的GXSXG 保守基序和HGGG 氧陰離子孔結(jié)構(gòu)，及1個由親核殘基Ser201，酸性殘基Asp253 和1 個保守His325 組成的典型絲氨酸水解酶催化三聯(lián)體，親核殘基Ser201 位于Gly199-Asp200-Ser201-Ala202-Gly203 保守基序中。在大多數(shù)水解酶第Ⅳ家族中，活性位點絲氨酸存在于經(jīng)典的GXSXG 保守基序中[30，34]，GXSXG 保守基序與PAEs 的降解密切相關(guān)[35-38]，Est96 氨基酸序列中的GXSXG 保守基序中的第1 個X 是Asp，第2 個X 是其它鄰苯二甲酸酯酶中常出現(xiàn)的非極性殘基Ala，GDSAG這個基序在絲氨酸水解酶中是獨特的[39]。典型催化三聯(lián)體的序列相似性和保守性表明，鄰苯二甲酸酯水解酶中重要的共同功能的基序在進化過程中一直是保守的。HGGG 四肽基序位于高度保守的五肽基序上游，其在水解過程中與疏水結(jié)合口袋有關(guān)[40]。在其它細菌如熱棒菌屬（Pyrobaculum，BAC06606.1）、嗜酸硫化桿菌 （Sulfobacillus acidophilus，AEW03609.1）、鞘脂菌屬（Sphingobium，AJO67804.1）、芽孢桿菌屬（Bacillus，AAU04567.1）酯酶序列中也是保守的。

通過ExPASy-ProtParam 工具對Est96 基本性質(zhì)進行分析，顯示Est96 是由358 個氨基酸殘基組成的多肽鏈，分子質(zhì)量40.66 ku，預(yù)測等電點9.23，帶正、負電荷氨基酸分別為42 和32，分子式為C1835H2863N511O516S10，原子總數(shù)5 735，消光系數(shù)39 560，含量最高的氨基酸為異亮氨酸（9.5%），不穩(wěn)定系數(shù)46.45，脂肪族指數(shù)88.02。Est96 不穩(wěn)定指數(shù)大于40，表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性可能由其序列中某些氨基酸的順序決定[41]。以上基本酶學(xué)性質(zhì)的分析有助于后續(xù)蛋白質(zhì)的分離純化及性質(zhì)研究。

圖3 Est96 基因保守序列、全長序列電泳檢測及Est96 誘導(dǎo)表達SDS-PAGE 分析Fig.3 Electrophoresis analysis of coreing sequence and full-length sequence of Est96 and analysis of SDS-PAGE for Est96

圖4 Est96 與脂肪酶第Ⅳ家族其它5 個蛋白的序列比對Fig.4 Protein sequences alignment between Est96 and other homologs from the family Ⅳ

將Est96 氨基酸殘基序列遞交SignalP 5.0區(qū)域。因此，生物信息學(xué)分析結(jié)果說明Est96 存在于胞內(nèi)。Server，顯示信號肽（Sec/SPI）為0.0123，雙精氨酸易位信號肽（Tat/SPI）為0.0006，脂信號肽（Sec/SPII）為0.0008（圖5），結(jié)果表明Est96 不具有信號肽序列。沒有信號肽的引導(dǎo)，新合成的蛋白質(zhì)不能發(fā)生轉(zhuǎn)運，即翻譯完畢的蛋白會滯留在合成的

2.4.2 親/疏水性及跨膜區(qū)分析 采用Protscale在線軟件Hphob/Kyte & Doolittle 算法計算Est96蛋白的疏水性 （圖6a）。位于320 位的異亮氨酸（Ile）疏水性最強，分值-2.433。位于229 位的脯氨酸（Pro）親水性最強，分值1.878。親疏水預(yù)測結(jié)果顯示Est96 蛋白的疏水區(qū)域少于親水區(qū)域，屬于親水蛋白。采用TMHMM 2.0 進行蛋白跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果（圖6b）顯示蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)，屬于胞內(nèi)蛋白。

2.4.3 二級、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，Est96 中α-螺旋占蛋白質(zhì)43.85%，伸展鏈占蛋白質(zhì)13.97%，β-折疊占蛋白質(zhì)6.42%，無規(guī)則卷曲占蛋白質(zhì)35.75%。可見，對于Est96 而言，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是蛋白結(jié)構(gòu)的主要組成部分。

借助I-Tasser 在線服務(wù)器對Est96 三維結(jié)構(gòu)進行建模，模型預(yù)測得分C-Score 為0.74（置信區(qū)間為-5-2），TM-Score 為0.62±0.14，表明模型預(yù)測具有良好的準確性和合理性，可用于后續(xù)分子對接。建模結(jié)構(gòu)分析顯示Gly129、Gly130、Val133、Ser201、Ala202、Val 230、Val 257、His325 是與酯酶活性相關(guān)的活性位點，為后續(xù)分子對接提供基礎(chǔ)。

圖5 Est96 信號肽預(yù)測Fig.5 Prediction of the signal peptide of Est96

圖6 Est96 疏水性分析與跨膜區(qū)預(yù)測Fig.6 The hydrophobicity analysis and prediction of transmembrane domain of Est96

2.5 酯酶Est96 功能驗證

以DMP、DEP、DiBP、DBP、DEHP 為底物驗證Est96 對PAEs 降解作用。結(jié)果表明Est96 能高效降解短側(cè)鏈PAEs（圖7），對體系中的DMP 降解率達99.996%，Est96 催化分解了體系中超過95%的DEP、DiBP 和DBP。然而，其中DEHP 降解率低于30%，這一結(jié)果可能與側(cè)鏈碳原子數(shù)量多的PAEs 空間位阻大、不容易被微生物降解利用的報道一致[1]，隨著側(cè)鏈碳原子數(shù)量的增加，PAEs 的水溶性呈下降趨勢，同時長側(cè)鏈影響酶反應(yīng)的空間效應(yīng)，微生物更傾向于降解DMP、DEP、DBP、DPP和BBP 等短側(cè)鏈PAEs[1，42-43]。重組蛋白對5 種PAEs 降解特性表明，該蛋白對短側(cè)鏈PAEs 具有較高降解效率。

圖7 Est96 對DMP、DEP、DiBP、DBP和DEHP 的催化降解Fig.7 The degradation of DMP，DEP，DiBP，DBP and DEHP by Est96

2.6 分子對接

基于Est96 對DMP 降解效率最高的試驗結(jié)果，采用誘導(dǎo)契合策略，將DMP 對接到Est96 活性部位，活性位點以及底物結(jié)合位點在單體內(nèi)完成，受體分子和配體之間通過空間匹配和能量匹配相互識別并形成分子復(fù)合物，得到DMP 的最佳取向，對接打分為-5.8 kcal/mol。

圖8 Est96 與DMP 相互作用的分子對接圖Fig.8 Molecular docking analysis of Est96 with DMP

借助PyMOL 2.4.1 可視化工具分析Est96 與DMP 分子對接結(jié)果，DMP 結(jié)合在Est96 催化活性口袋中（圖8A，C），His127-Gly128-Gly129-Gly130、Gly199-Asp200-Ser201-Ala202-Gly203、His325-Gly326-Phe327 3 個保守結(jié)構(gòu)域是催化活性口袋的重要組成 （圖8B、C）。DMP 與Ser201 殘基、Asp253 殘基和His325 殘基形成穩(wěn)定的四面體過渡態(tài)（圖8B），經(jīng)典的催化三聯(lián)體“絲氨酸殘基-天冬氨酸-組氨酸殘基”被認為是酯鍵羰基碳原子上親核攻擊的原因，這種四面體過渡狀態(tài)保證了酯鍵水解的催化作用[44]。DMP 分子酯基中的氧原子作為氫鍵的受體，與Est96 上一個高度保守域的His325 氨基酸側(cè)鏈形成氫鍵（圖8B、C），氫鍵鍵長為2.5?。研究表明氫鍵是酶與配體相互作用的關(guān)鍵作用力[45]，參與氫鍵形成的His325 氨基酸殘基被認為是Est96 與小分子配體相互作用的關(guān)鍵殘基。配體DMP 的苯環(huán)與Phe66 形成π-π 堆積，與Met 82 形成了π-二硫鍵的相互作用穩(wěn)定酶-底物復(fù)合體，與結(jié)合口袋牢固結(jié)合。已有研究證實親核絲氨酸殘基和氧陰離子空穴的殘基對酶的催化功能至關(guān)重要，這些位置的定點突變導(dǎo)致酶功能的喪失[46-48]。

3 結(jié)論

從中國傳統(tǒng)白酒釀造過程中分離鑒定出1 株有效降解DBP 的不動桿菌屬細菌Aci-17，通過克隆和重組表達菌株Aci-17 中的1 個酯鍵水解酶編碼基因，驗證了該基因表達蛋白Est96 對谷物中常見的5 種鄰苯二甲酸酯降解效率。結(jié)果表明，Est96 不僅能夠降解DBP，還可高效降解DMP、DEP、DiBP。同時，在鄰苯二甲酸酯降解過程中Est96 顯示底物偏好性，優(yōu)選烷基側(cè)鏈短而直的鄰苯二甲酸酯作為底物。