劉雪飛,吳曉芳,祁 悅,張德福,謝 晶,牟偉麗,李學(xué)鵬*,勵(lì)建榮
(1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013 2 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海201306 3 蓬萊京魯漁業(yè)有限公司 山東煙臺(tái)265600)
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌,廣泛存在于近海岸的海水、海底沉積物和魚(yú)貝類等海洋生物中,不僅引起水生動(dòng)物的弧菌病,還是我國(guó)食源性疾病的首要致病菌之一[1-2]。在一些沿海城市,60%以上的細(xì)菌性食物中毒都是由該菌引起[3]。由于一些水產(chǎn)品經(jīng)高溫處理會(huì)失去其特有的風(fēng)味,往往不經(jīng)熱處理直接生食,極大地增加引發(fā)食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn),因此研究以非加熱方式抑制副溶血弧菌是控制生食水產(chǎn)品引起食物中毒的關(guān)鍵[4]。目前,人們?yōu)榱藴p少和防止該菌在水產(chǎn)品中的污染,采取的主要措施是使用消毒劑與抗生素,這種做法存在明顯的弊端,例如:抗生素藥物殘留,細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生,破壞水生動(dòng)物體內(nèi)微平衡以及免疫力[5]。研究發(fā)現(xiàn),多種天然防腐劑具有顯著的抑菌活性,可代替化學(xué)合成的抑菌劑應(yīng)用于食品工業(yè)中[6]。尋找并開(kāi)發(fā)天然、綠色、高效的抑菌物質(zhì)越來(lái)越受到關(guān)注。
革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜,除了細(xì)胞質(zhì)膜,還有一層參與構(gòu)成細(xì)胞壁的外膜(Outer Membrane)。外膜蛋白(Outer Membrane Protein,OMP)是外膜的主要成分之一,由反向平行的β-折疊通過(guò)相鄰的氫鍵結(jié)合形成具有長(zhǎng)而窄的疏水性通道的β-桶狀結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)可促使外膜蛋白具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性[7]。跨膜的β-桶狀結(jié)構(gòu)蛋白通常作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、通道蛋白,協(xié)助小分子物質(zhì)的進(jìn)出[8]。有研究證實(shí)鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白OmpW 是有效的藥物靶標(biāo)[9]。副溶血弧菌外膜蛋白OmpC 是凡爾濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白LH75 產(chǎn)生抑菌作用的靶點(diǎn)之一[10]。張丹鳳[11]經(jīng)耐藥分析等試驗(yàn),證明大腸桿菌K-12 外膜蛋白TolC 不僅參與藥物的外排過(guò)程,還參與對(duì)外界抗生素的感應(yīng)。
檸檬酸與咖啡酸均為天然小分子有機(jī)物,被廣泛應(yīng)用在食品和醫(yī)藥工業(yè)上。檸檬酸對(duì)包括雷氏普羅維登菌[12]、嗜水氣單胞菌[13]和熒光假單胞菌[13]在內(nèi)的多種革蘭氏陰性菌有抑制作用。咖啡酸及其酯類衍生物除具有抗氧化、抗突變作用外,還可抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)[14]。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有文獻(xiàn)多數(shù)是從抑制現(xiàn)象上篩選副溶血弧菌的抑菌劑,而很少?gòu)姆肿铀窖芯恳种谱饔冒l(fā)生的機(jī)理。開(kāi)發(fā)作用于新靶點(diǎn)、具有抑菌新機(jī)制且綠色、安全的食源性致病菌抑菌劑迫在眉睫。
分子對(duì)接(Molecular Docking)是在Fisher 的受體學(xué)說(shuō)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一種利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行分子模擬的技術(shù),對(duì)接時(shí)將小分子配體放入受體的活性位點(diǎn),之后按照能量互補(bǔ)、幾何匹配及化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)的原則,對(duì)配體與受體相互作用的好壞進(jìn)行實(shí)時(shí)評(píng)價(jià),找到配體與受體分子間最佳的結(jié)合模式(包括合理的位置與構(gòu)象),這在藥物設(shè)計(jì)上有非常重要的意義[15-16]。分子對(duì)接的基礎(chǔ)在于已知受體的三維結(jié)構(gòu),然而,要獲得膜結(jié)合蛋白的晶體結(jié)構(gòu)十分困難,通過(guò)試驗(yàn)方式獲得其三維結(jié)構(gòu)具有很大的局限性。現(xiàn)階段科研領(lǐng)域廣泛使用的同源建模(Homology Modeling)是一種重要的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的方法,該方法的基本原理即蛋白質(zhì)的序列同源性決定了蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的同源性,利用蛋白序列同源的已知結(jié)構(gòu)的蛋白作為模板可以構(gòu)建一個(gè)結(jié)構(gòu)未知的目標(biāo)蛋白。
本文在上述理論基礎(chǔ)上,利用同源建模與分子對(duì)接構(gòu)建副溶血弧菌外膜蛋白OmpW 的三維結(jié)構(gòu),確定活性部位作為靶標(biāo),與檸檬酸和咖啡酸等小分子天然物質(zhì)對(duì)接獲得相應(yīng)的分?jǐn)?shù),并通過(guò)試驗(yàn)研究?jī)煞N小分子對(duì)正常、去外膜、去壁(即原生質(zhì)體)這3 種狀態(tài)的副溶血弧菌的抑制效果,分析外膜蛋白OmpW 是否為檸檬酸和咖啡酸的作用位點(diǎn),為篩選無(wú)毒、高效、綠色的抑菌劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖或生食海鮮新型調(diào)味品的開(kāi)發(fā)提供參考,同時(shí)為尋找新的藥物靶點(diǎn)提供一定的理論依據(jù)。
表1 耐藥株的耐藥譜Table 1 Resistant spectrum of drug-resistant strains
副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)ATCC17802、ATCC33847、分離株1(分離自白蛤)、分離株2(分離自鮑魚(yú))、耐藥株1(耐藥譜見(jiàn)表1)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。
3% NaCl APW 培養(yǎng)基、TCBS 培養(yǎng)基購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。以上培養(yǎng)基均121 ℃滅菌20 min。
Tris、檸檬酸、咖啡酸、EDTA、甘油,購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司;蔗糖、MgCl2、馬來(lái)酸鹽、NaOH,購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;磷酸鹽緩沖液(pH 7.2~7.4),購(gòu)于武漢普賽諾生命科技有限公司;溶菌酶,購(gòu)于合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。
PL303 電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;PHBJ-206 pH 計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;GI54DS 高壓蒸汽滅菌鍋,南京智德豐科學(xué)儀器有限公司;ZD-85A 氣浴恒溫振蕩器,金壇市科技儀器有限公司;SPX-250 生化培養(yǎng)箱,寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠;5804R 高速離心分離機(jī),Eppendorf 中國(guó)有限公司;VICTORTM X3 微孔板讀數(shù)儀,珀金埃爾默儀器(上海)有限公司。
1.3.1 構(gòu)建副溶血弧菌外膜蛋白OmpW 的同源模型 副溶血弧菌外膜蛋白OmpW 的晶體結(jié)構(gòu)尚未有報(bào)道,其氨基酸序列(214aa,GI:1050211542)可以通過(guò)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得,利用該序列在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)(http.//www.crsb.org)高級(jí)檢索的BLAST 找到與之序列相似度最高的蛋白質(zhì),以該蛋白為模板,用SWISS MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)構(gòu)建模擬的三維模型,建模結(jié)果用ULCA(http://servicesn.mbi.ucla.edu/)進(jìn)行評(píng)估。
1.3.2 靶標(biāo)的確定與分子對(duì)接 以模擬的外膜蛋白OmpW 模型作為靶標(biāo),用分子模擬軟件Discovery Studio 2017R2 處理該蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu),包括去除水分子、加極性氫原子、能量最小化、構(gòu)象最優(yōu)化等。根據(jù)之前報(bào)道過(guò)的蛋白活性位點(diǎn)信息確定活性位點(diǎn),為后續(xù)分子對(duì)接做準(zhǔn)備。自Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載小分 子結(jié)構(gòu),利用DS 軟件進(jìn)行分子對(duì)接,得出相應(yīng)的能量信息和打分函數(shù)。打分越高說(shuō)明受體與配體的相互作用可能越強(qiáng),可能產(chǎn)生的抑制作用也就越強(qiáng)。
1.3.3 菌種活化及處理 將試驗(yàn)菌株分別接種于3% NaCl APW 中,振蕩培養(yǎng)12~18 h,重復(fù)傳代2次。
參考Xu 等[17]的方法進(jìn)行菌種處理。將活化的菌液于4 ℃4 000 g 離心10 min 收獲菌體,棄上清液,沉淀用0.01 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液(pH 7.0)離心洗滌,重復(fù)2 次,棄上清液,加入高滲Tris-HCl 緩沖液(pH 7.0)30 mL 使細(xì)胞重懸,再加入EDTA 溶液(pH 8.0),使其終濃度為0.01 mol/L,注意滴加的速度,讓整個(gè)滴加時(shí)間控制在20 min 左右。將離心管放入恒溫振蕩器中于37 ℃100 r/min 振蕩20 min,除去副溶血弧菌的外膜層,將1 支離心管置于4 ℃冰箱中,待用。
另一支離心管置于4 ℃ 3 000 g 離心10 min,棄上清液,沉淀用SMM 緩沖液 (包含0.5 mol/L 蔗糖、20 mmol/L 馬來(lái)酸鹽、20 mmol/L Mg-Cl2,pH 6.5)離心洗滌2 次,棄上清液,將沉淀重懸于含1 mg/mL 溶菌酶的SMM 緩沖液中,混勻后置于37 ℃100 r/min 振蕩30 min,消化肽聚糖層,再加入3.33 mL EDTA 溶液,搖勻后置于37 ℃溫育15 min,制得已除去細(xì)胞壁的副溶血弧菌原生質(zhì)體,將該離心管置于4 ℃冰箱中,待用。
1.3.4 最小抑菌濃度測(cè)定 采用二倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(MIC),每支試管依次加入藥物溶液500 μL(0.008~32.000 mg/mL),新鮮APW 培養(yǎng)基490 μL 和10 μL 菌液 (包括正常菌:normal bacteria,NB;去外膜菌:Outer membrane deficient bacteria,OMDB;去壁菌:Cell wall deficient bacteria,CWDB)混勻,同時(shí)做不含藥物的陰性對(duì)照以及不含藥物和菌液的空白對(duì)照。將上述試管在37℃培養(yǎng)24 h,肉眼觀察菌體生長(zhǎng)情況,不出現(xiàn)渾濁的最小藥物濃度即為MIC。
1.3.5 殺菌曲線的測(cè)定 采用96 孔板法,每孔加入250 μL 含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基和2.5 μL菌液(NB/OMDB/CWDB),混勻。同時(shí)做不含藥物的空白對(duì)照,將所有96 孔板于37 ℃靜置培養(yǎng),每隔2 h 測(cè)定其在600 nm 處的OD 值。每塊96 孔板只測(cè)定1 次,以減少雜菌污染的可能。
1.3.6 抑菌作用有效性驗(yàn)證 為了驗(yàn)證藥物對(duì)副溶血弧菌不同菌株的有效性,測(cè)定藥物對(duì)副溶血弧菌ATCC33847、2 株食品分離株和1 株抗藥株的抑制效果。具體操作方法同1.3.4 節(jié)。
1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 2007 處理數(shù)據(jù)并繪制圖表,采用SPSS 19.0 進(jìn)行差異顯著性分析,數(shù)據(jù)表示方式為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,每個(gè)測(cè)定項(xiàng)目做3 個(gè)平行。
目標(biāo)蛋白在PDB 中的序列對(duì)比結(jié)果如圖1所示,此圖只截取同源性大于50%的蛋白,其中2MHL、2F1T 的序列一致性較高。通常情況下,當(dāng)目標(biāo)蛋白的氨基酸序列與模板蛋白的氨基酸序列同源性達(dá)到30%及以上時(shí),就可以利用此模板來(lái)構(gòu)建目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu),且結(jié)果具有較高的可信性[18]。圖1結(jié)果顯示,來(lái)自于大腸桿菌(Escherichia coli)的外膜蛋白OmpW(PDB ID:2MHL)與目標(biāo)蛋白序列的一致性達(dá)58%以上,這表明二者的同源性很高。另外,其全局模型質(zhì)量評(píng)估(GMQE)分?jǐn)?shù)最高,且蛋白質(zhì)氨基酸殘基的完整性也較高,因此選擇2MHL 作為目標(biāo)蛋白同源建模的模板。以PDB 中2MHL 的三維結(jié)構(gòu)為模板,通過(guò)SWISS MODEL 模擬出目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白同樣具有β-桶狀結(jié)構(gòu),用于控制物質(zhì)的進(jìn)出。許多抗生素及抑菌分子與孔道蛋白特異性結(jié)合,或通過(guò)孔道進(jìn)入膜內(nèi)發(fā)揮抑菌作用[19-20]。
OmpW 的建模結(jié)果中有78.0%的殘基落入最佳區(qū)域(Favoured region),16.8%的殘基落入許可區(qū)域(Allowed region),這說(shuō)明該模型是較為合理的。殘基中GLN24、ASN39、LYS44、LEU46、GLU50、THR58、PRO115、PHE137 落入異常區(qū)域(Outlier region),但這些殘基多位于蛋白的外表面,距活性中心較遠(yuǎn),對(duì)后續(xù)的分子對(duì)接無(wú)直接影響。
圖1 副溶血弧菌OmpW 同源模板的搜尋結(jié)果Fig.1 Search of homologous sequences of OmpW of V.parahaemolyticus
根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選擇5 種具有抑菌作用的小分子作為篩選對(duì)象,從Pubchem 下載這些小分子的結(jié)構(gòu),并作為配體進(jìn)行對(duì)接,最佳構(gòu)象的打分結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明,在這5 種天然植物源小分子中,咖啡酸和檸檬酸的打分較高,這說(shuō)明咖啡酸和檸檬酸與副溶血弧菌OmpW 的相互作用較強(qiáng),可能產(chǎn)生的抑制作用也更強(qiáng)。
DS 軟件搜尋的潛在活性位點(diǎn)共有6 個(gè),如圖2所示。據(jù)Soojhawon 等[9]的研究結(jié)果,靠近周質(zhì)空間且位于桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)的位點(diǎn)(Site2)是最有可能的活性位點(diǎn)。在該位點(diǎn)與咖啡酸對(duì)接時(shí),咖啡酸的O 和受體蛋白中ASP26 的O 產(chǎn)生了一個(gè)不利的相互作用(Unfavorable interaction),因此選用同樣位于桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)的Site1 作為與咖啡酸對(duì)接位點(diǎn),Site2 作為與檸檬酸對(duì)接的位點(diǎn),且結(jié)果較為理想。
圖3顯示的是檸檬酸與外膜蛋白OmpW 模型的對(duì)接結(jié)果及產(chǎn)生的相互作用。圖3a 顯示了檸檬酸在與受體蛋白結(jié)合時(shí)的狀態(tài)與位置,顯然兩個(gè)小分子處在相對(duì)疏水的桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)。如圖3b所示,檸檬酸與外膜蛋白OmpW 中的氨基酸殘基TYR111、ASN174、ARG30、VAL28 形成了5條經(jīng)典氫鍵(Conventional hydrogen bond),這些氫鍵的氫供體和受體之間的距離均小于或接近于3?,且DHA 和HAY 角均落在90°~180°之間,表明很可能形成了強(qiáng)氫鍵[21-22]。而檸檬酸與GLY65、SER73 形成2 條非經(jīng)典的CH...O 氫鍵(Carbon hydrogen bond),盡管比經(jīng)典氫鍵作用弱,但在蛋白質(zhì)-配體的結(jié)合中也起到一定作用[23]。除了氫鍵,ARG30 側(cè)鏈的NH2還與檸檬酸的O 產(chǎn)生靜電相互作用(Attractive charges)。此外,圖3b 顯示出配體與TYR122、ASP164 等8 個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)生了范德華相互作用。
表2 分子對(duì)接打分結(jié)果Table 2 Results of molecular docking scoring
圖2 DS 軟件定義的OmpW 潛在活性位點(diǎn)Fig.2 Potential OmpW active sites defined by DS software
咖啡酸與受體蛋白產(chǎn)生的相互作用主要有氫鍵、疏水相互作用和范德華相互作用,見(jiàn)圖4。咖啡酸中酚羥基的H 與THR105 側(cè)鏈上-OH 的O、羧基的O 與MET207 形成強(qiáng)氫鍵,同時(shí)羧基上的另2 個(gè)O 分別與蛋白的ALA177 和TRP178 形成弱氫鍵??Х人岬谋江h(huán)與TRP178 的兩個(gè)π 環(huán)(包括但不僅僅包括芳香環(huán))均有相互作用,π 軌道產(chǎn)生堆疊效應(yīng)(Pi-Pi T-shaped)。此外咖啡酸還與兩個(gè)非極性的氨基酸殘基ALA34 和VAL205 產(chǎn)生另一種類型的疏水相互作用(Pi-Alkyl)。疏水相互作用以及疏水與親水的平衡是維持蛋白質(zhì)-配體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要作用力之一[24]。此外,咖啡酸還與SER35、PHE82 等8 個(gè)氨基酸殘基之間存在范德華力。
上述提及的均為非鍵相互作用,與共價(jià)鍵相比,非鍵相互作用非常弱,但是它們的累積和堆疊效應(yīng)是巨大的,對(duì)配體與蛋白的結(jié)合以及蛋白質(zhì)-配體的構(gòu)象穩(wěn)定起到至關(guān)重要的作用[24]。
圖3 檸檬酸與OmpW 模型對(duì)接結(jié)果Fig.3 Docking results of citric acid with OmpW model
圖4 咖啡酸與OmpW 模型對(duì)接結(jié)果Fig.4 Docking results of caffeic acid with OmpW model
由表3結(jié)果可知,檸檬酸與咖啡酸對(duì)副溶血弧菌ATCC17802 均有抑制作用。去外膜和去壁處理增加了副溶血弧菌ATCC17802 對(duì)檸檬酸與咖啡酸的敏感性,其MIC 分別減小為原來(lái)的1/16 和1/64,這說(shuō)明抑制劑確實(shí)與外膜蛋白OmpW 產(chǎn)生了相互作用,并可能使之失去原有的生理功能(控制物質(zhì)進(jìn)出等)。另外,有研究表明外膜蛋白與周質(zhì)空間和內(nèi)膜的蛋白形成復(fù)合物體系,這一體系可能對(duì)藥物進(jìn)行外排,而失去了外膜甚至細(xì)胞壁后,沒(méi)有體系的外排作用,敏感性明顯增強(qiáng)[25]。
表3 檸檬酸與咖啡酸對(duì)副溶血弧菌ATCC17802 的MIC(mg/mL)Table 3 MIC of citric acid and caffeic acid on V.parahaemolyticus ATCC17802 (mg/mL)
不同濃度的檸檬酸與咖啡酸對(duì)副溶血弧菌ATCC17802 3 種狀態(tài)菌體的抑制情況通過(guò)殺菌曲線的形式加以分析。圖5結(jié)果表明,當(dāng)檸檬酸濃度為副溶血弧菌ATCC17802 正常菌體MIC 的1/64和1/32 時(shí),對(duì)于正常菌體幾乎沒(méi)有抑制作用,而對(duì)于去外膜和去壁的菌體卻能夠完全抑制其生長(zhǎng),24 h 內(nèi)OD600nm的上下波動(dòng)均不超過(guò)0.2,這與檸檬酸對(duì)不同菌體MIC 測(cè)定結(jié)果相一致。當(dāng)檸檬酸濃度達(dá)到MIC 和2 MIC 時(shí),3 種狀態(tài)的菌體均受到很大程度的抑制,只有未加檸檬酸的空白組呈現(xiàn)出正常的生長(zhǎng)曲線。Ye 等[26]發(fā)現(xiàn),在濃度為1/2 MIC 的硫酸新霉素的作用下,阪崎腸桿菌ΔOmpW 缺失株的存活率明顯低于野生型菌株,且缺失株生物膜形成率的下降幅度大于野生型菌株。彭志鋒等[27]通過(guò)微量稀釋法測(cè)定多種抗菌藥物對(duì)鴨源雞桿菌親本菌株RU 和突變株ΔOmpW的MIC,結(jié)果顯示,相對(duì)于RU,土霉素和四環(huán)素對(duì)ΔOmpW 的MIC 值分別降低到1/8 和1/32,這些結(jié)果說(shuō)明,外膜β-桶狀蛋白很可能就是抑菌劑作用的位點(diǎn)。
圖5 不同濃度的檸檬酸對(duì)副溶血弧菌ATCC17802 的殺菌曲線Fig.5 Killing curves of V.parahaemolyticus ATCC17802 under different concentrations of citric acid
圖6結(jié)果表明,當(dāng)咖啡酸濃度為副溶血弧菌ATCC17802 正常菌體MIC 的1/16 或1/8 時(shí),正常菌體幾乎沒(méi)有受到任何抑制作用,與空白對(duì)照相比OD600nm相差不大(P>0.05),曲線呈S 型。而去外膜和去壁的菌體卻幾乎完全被抑制,這同樣與咖啡酸對(duì)不同菌體MIC 測(cè)定結(jié)果相一致。當(dāng)咖啡酸濃度增加到MIC 或2MIC 時(shí),3 種狀態(tài)的菌體均受到抑制,只有未加咖啡酸的空白組呈現(xiàn)出正常的生長(zhǎng)曲線。有研究表明對(duì)茶多酚具抑菌活性起重要作用的是茶多酚分子內(nèi)的多個(gè)酚羥基。酚羥基可與蛋白質(zhì)分子中的氨基或羧基發(fā)生結(jié)合反應(yīng),其疏水性的苯環(huán)也可以與蛋白質(zhì)發(fā)生疏水結(jié)合反應(yīng),而茶多酚與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合作用阻斷了細(xì)菌的侵染路徑,故而能夠抑菌[28]。而咖啡酸有2 個(gè)相鄰的酚羥基,這2 個(gè)酚羥基可能是咖啡酸的2個(gè)活性基團(tuán),與副溶血弧菌外膜β-桶狀蛋白通道中的疏水基團(tuán)相互作用,起到抑菌作用,這在分子對(duì)接時(shí)已經(jīng)體現(xiàn)。
圖6 不同濃度的咖啡酸對(duì)副溶血弧菌ATCC17802 的殺菌曲線Fig.6 Killing curves of V.parahaemolyticus ATCC17802 under different concentrations of caffeic acid
表4結(jié)果顯示,檸檬酸和咖啡酸對(duì)副溶血弧菌ATCC33847、分離株1(白蛤)、分離株2(鮑魚(yú))以及耐藥株均有抑制作用。且去外膜和去壁之后,MIC 均顯著減小,該結(jié)果與測(cè)定的副溶血弧菌ATCC17802 的MIC 規(guī)律一致。Lin 等[29]的研究結(jié)果也表明,從大腸桿菌中刪除OmpW 引起幾種抗生素的MIC 降低,OmpW 可能是革蘭氏陰性細(xì)菌的潛在藥物靶標(biāo)[30],檸檬酸和咖啡酸的作用位點(diǎn)極可能是副溶血弧菌OmpW。
表4 檸檬酸和咖啡酸對(duì)4 種菌株類型的副溶血弧菌的MIC(mg/mL)Table 4 MIC of citric acid and caffeic acid against four kinds of strains of V.parahaemolyticus (mg/mL)
本研究結(jié)果表明,以分子對(duì)接技術(shù)為基礎(chǔ)篩選副溶血弧菌抑菌劑的方法可行。檸檬酸和咖啡酸對(duì)副溶血弧菌的抑菌效果較理想,MIC 均為2 mg/mL。此外,檸檬酸和咖啡酸的作用靶點(diǎn)位于副溶血弧菌外膜上β-桶狀蛋白OmpW 的可能性很高,去外膜和去壁菌體的MIC 和殺菌曲線測(cè)定結(jié)果均證實(shí)了外膜對(duì)于菌體對(duì)抗小分子抑菌劑的重要作用。但還需要更深入地對(duì)抑菌劑與外膜蛋白OmpW 的相互作用進(jìn)行生物物理表征,以證實(shí)其作為潛在藥物靶標(biāo)的作用。