劉雪飛，吳曉芳，祁 悅，張德福，謝 晶，牟偉麗，李學鵬*，勵建榮

（1 渤海大學食品科學與工程學院 遼寧省食品安全重點實驗室生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013 2 上海海洋大學食品學院 上海201306 3 蓬萊京魯漁業(yè)有限公司 山東煙臺265600）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛存在于近海岸的海水、海底沉積物和魚貝類等海洋生物中，不僅引起水生動物的弧菌病，還是我國食源性疾病的首要致病菌之一[1-2]。在一些沿海城市，60%以上的細菌性食物中毒都是由該菌引起[3]。由于一些水產(chǎn)品經(jīng)高溫處理會失去其特有的風味，往往不經(jīng)熱處理直接生食，極大地增加引發(fā)食源性疾病的風險，因此研究以非加熱方式抑制副溶血弧菌是控制生食水產(chǎn)品引起食物中毒的關鍵[4]。目前，人們?yōu)榱藴p少和防止該菌在水產(chǎn)品中的污染，采取的主要措施是使用消毒劑與抗生素，這種做法存在明顯的弊端，例如：抗生素藥物殘留，細菌耐藥性的產(chǎn)生，破壞水生動物體內(nèi)微平衡以及免疫力[5]。研究發(fā)現(xiàn)，多種天然防腐劑具有顯著的抑菌活性，可代替化學合成的抑菌劑應用于食品工業(yè)中[6]。尋找并開發(fā)天然、綠色、高效的抑菌物質越來越受到關注。

革蘭氏陰性細菌細胞結構復雜，除了細胞質膜，還有一層參與構成細胞壁的外膜（Outer Membrane）。外膜蛋白（Outer Membrane Protein，OMP）是外膜的主要成分之一，由反向平行的β-折疊通過相鄰的氫鍵結合形成具有長而窄的疏水性通道的β-桶狀結構，這些結構可促使外膜蛋白具有很強的穩(wěn)定性[7]?？缒さ摩?桶狀結構蛋白通常作為轉運蛋白、通道蛋白，協(xié)助小分子物質的進出[8]。有研究證實鮑曼不動桿菌外膜蛋白OmpW 是有效的藥物靶標[9]。副溶血弧菌外膜蛋白OmpC 是凡爾濱對蝦血藍蛋白LH75 產(chǎn)生抑菌作用的靶點之一[10]。張丹鳳[11]經(jīng)耐藥分析等試驗，證明大腸桿菌K-12 外膜蛋白TolC 不僅參與藥物的外排過程，還參與對外界抗生素的感應。

檸檬酸與咖啡酸均為天然小分子有機物，被廣泛應用在食品和醫(yī)藥工業(yè)上。檸檬酸對包括雷氏普羅維登菌[12]、嗜水氣單胞菌[13]和熒光假單胞菌[13]在內(nèi)的多種革蘭氏陰性菌有抑制作用?？Х人峒捌漉ヮ愌苌锍哂锌寡趸?、抗突變作用外，還可抑制大腸桿菌的生長[14]。國內(nèi)現(xiàn)有文獻多數(shù)是從抑制現(xiàn)象上篩選副溶血弧菌的抑菌劑，而很少從分子水平研究抑制作用發(fā)生的機理。開發(fā)作用于新靶點、具有抑菌新機制且綠色、安全的食源性致病菌抑菌劑迫在眉睫。

分子對接（Molecular Docking）是在Fisher 的受體學說的基礎上發(fā)展而來的一種利用計算機進行分子模擬的技術，對接時將小分子配體放入受體的活性位點，之后按照能量互補、幾何匹配及化學環(huán)境互補的原則，對配體與受體相互作用的好壞進行實時評價，找到配體與受體分子間最佳的結合模式（包括合理的位置與構象），這在藥物設計上有非常重要的意義[15-16]。分子對接的基礎在于已知受體的三維結構，然而，要獲得膜結合蛋白的晶體結構十分困難，通過試驗方式獲得其三維結構具有很大的局限性。現(xiàn)階段科研領域廣泛使用的同源建模（Homology Modeling）是一種重要的預測蛋白質結構和功能的方法，該方法的基本原理即蛋白質的序列同源性決定了蛋白質三維結構的同源性，利用蛋白序列同源的已知結構的蛋白作為模板可以構建一個結構未知的目標蛋白。

本文在上述理論基礎上，利用同源建模與分子對接構建副溶血弧菌外膜蛋白OmpW 的三維結構，確定活性部位作為靶標，與檸檬酸和咖啡酸等小分子天然物質對接獲得相應的分數(shù)，并通過試驗研究兩種小分子對正常、去外膜、去壁（即原生質體）這3 種狀態(tài)的副溶血弧菌的抑制效果，分析外膜蛋白OmpW 是否為檸檬酸和咖啡酸的作用位點，為篩選無毒、高效、綠色的抑菌劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖或生食海鮮新型調(diào)味品的開發(fā)提供參考，同時為尋找新的藥物靶點提供一定的理論依據(jù)。

表1 耐藥株的耐藥譜Table 1 Resistant spectrum of drug-resistant strains

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與試劑

副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）ATCC17802、ATCC33847、分離株1（分離自白蛤）、分離株2（分離自鮑魚）、耐藥株1（耐藥譜見表1）均為本實驗室保存。

3% NaCl APW 培養(yǎng)基、TCBS 培養(yǎng)基購于北京奧博星生物技術有限責任公司。以上培養(yǎng)基均121 ℃滅菌20 min。

Tris、檸檬酸、咖啡酸、EDTA、甘油，購于生工生物工程（上海）股份有限公司；蔗糖、MgCl2、馬來酸鹽、NaOH，購于天津市風船化學試劑科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4），購于武漢普賽諾生命科技有限公司；溶菌酶，購于合肥博美生物科技有限責任公司。

1.2 儀器與設備

PL303 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHBJ-206 pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；GI54DS 高壓蒸汽滅菌鍋，南京智德豐科學儀器有限公司；ZD-85A 氣浴恒溫振蕩器，金壇市科技儀器有限公司；SPX-250 生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠；5804R 高速離心分離機，Eppendorf 中國有限公司；VICTORTM X3 微孔板讀數(shù)儀，珀金埃爾默儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 構建副溶血弧菌外膜蛋白OmpW 的同源模型 副溶血弧菌外膜蛋白OmpW 的晶體結構尚未有報道，其氨基酸序列（214aa，GI：1050211542）可以通過NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得，利用該序列在PDB 數(shù)據(jù)庫（http.//www.crsb.org）高級檢索的BLAST 找到與之序列相似度最高的蛋白質，以該蛋白為模板，用SWISS MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）構建模擬的三維模型，建模結果用ULCA（http：//servicesn.mbi.ucla.edu/）進行評估。

1.3.2 靶標的確定與分子對接 以模擬的外膜蛋白OmpW 模型作為靶標，用分子模擬軟件Discovery Studio 2017R2 處理該蛋白質晶體結構，包括去除水分子、加極性氫原子、能量最小化、構象最優(yōu)化等。根據(jù)之前報道過的蛋白活性位點信息確定活性位點，為后續(xù)分子對接做準備。自Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載小分 子結構，利用DS 軟件進行分子對接，得出相應的能量信息和打分函數(shù)。打分越高說明受體與配體的相互作用可能越強，可能產(chǎn)生的抑制作用也就越強。

1.3.3 菌種活化及處理 將試驗菌株分別接種于3% NaCl APW 中，振蕩培養(yǎng)12～18 h，重復傳代2次。

參考Xu 等[17]的方法進行菌種處理。將活化的菌液于4 ℃4 000 g 離心10 min 收獲菌體，棄上清液，沉淀用0.01 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液（pH 7.0）離心洗滌，重復2 次，棄上清液，加入高滲Tris-HCl 緩沖液（pH 7.0）30 mL 使細胞重懸，再加入EDTA 溶液（pH 8.0），使其終濃度為0.01 mol/L，注意滴加的速度，讓整個滴加時間控制在20 min 左右。將離心管放入恒溫振蕩器中于37 ℃100 r/min 振蕩20 min，除去副溶血弧菌的外膜層，將1 支離心管置于4 ℃冰箱中，待用。

另一支離心管置于4 ℃ 3 000 g 離心10 min，棄上清液，沉淀用SMM 緩沖液 （包含0.5 mol/L 蔗糖、20 mmol/L 馬來酸鹽、20 mmol/L Mg-Cl2，pH 6.5）離心洗滌2 次，棄上清液，將沉淀重懸于含1 mg/mL 溶菌酶的SMM 緩沖液中，混勻后置于37 ℃100 r/min 振蕩30 min，消化肽聚糖層，再加入3.33 mL EDTA 溶液，搖勻后置于37 ℃溫育15 min，制得已除去細胞壁的副溶血弧菌原生質體，將該離心管置于4 ℃冰箱中，待用。

1.3.4 最小抑菌濃度測定 采用二倍稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC），每支試管依次加入藥物溶液500 μL（0.008～32.000 mg/mL），新鮮APW 培養(yǎng)基490 μL 和10 μL 菌液 （包括正常菌：normal bacteria，NB；去外膜菌：Outer membrane deficient bacteria，OMDB；去壁菌：Cell wall deficient bacteria，CWDB）混勻，同時做不含藥物的陰性對照以及不含藥物和菌液的空白對照。將上述試管在37℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察菌體生長情況，不出現(xiàn)渾濁的最小藥物濃度即為MIC。

1.3.5 殺菌曲線的測定 采用96 孔板法，每孔加入250 μL 含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基和2.5 μL菌液（NB/OMDB/CWDB），混勻。同時做不含藥物的空白對照，將所有96 孔板于37 ℃靜置培養(yǎng)，每隔2 h 測定其在600 nm 處的OD 值。每塊96 孔板只測定1 次，以減少雜菌污染的可能。

1.3.6 抑菌作用有效性驗證 為了驗證藥物對副溶血弧菌不同菌株的有效性，測定藥物對副溶血弧菌ATCC33847、2 株食品分離株和1 株抗藥株的抑制效果。具體操作方法同1.3.4 節(jié)。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用Excel 2007 處理數(shù)據(jù)并繪制圖表，采用SPSS 19.0 進行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)表示方式為平均數(shù)±標準差，每個測定項目做3 個平行。

2 結果與分析

2.1 同源建模

目標蛋白在PDB 中的序列對比結果如圖1所示，此圖只截取同源性大于50%的蛋白，其中2MHL、2F1T 的序列一致性較高。通常情況下，當目標蛋白的氨基酸序列與模板蛋白的氨基酸序列同源性達到30%及以上時，就可以利用此模板來構建目標蛋白的三維結構，且結果具有較高的可信性[18]。圖1結果顯示，來自于大腸桿菌（Escherichia coli）的外膜蛋白OmpW（PDB ID：2MHL）與目標蛋白序列的一致性達58%以上，這表明二者的同源性很高。另外，其全局模型質量評估（GMQE）分數(shù)最高，且蛋白質氨基酸殘基的完整性也較高，因此選擇2MHL 作為目標蛋白同源建模的模板。以PDB 中2MHL 的三維結構為模板，通過SWISS MODEL 模擬出目標蛋白的三維結構，結果顯示目標蛋白同樣具有β-桶狀結構，用于控制物質的進出。許多抗生素及抑菌分子與孔道蛋白特異性結合，或通過孔道進入膜內(nèi)發(fā)揮抑菌作用[19-20]。

OmpW 的建模結果中有78.0%的殘基落入最佳區(qū)域（Favoured region），16.8%的殘基落入許可區(qū)域（Allowed region），這說明該模型是較為合理的。殘基中GLN24、ASN39、LYS44、LEU46、GLU50、THR58、PRO115、PHE137 落入異常區(qū)域（Outlier region），但這些殘基多位于蛋白的外表面，距活性中心較遠，對后續(xù)的分子對接無直接影響。

圖1 副溶血弧菌OmpW 同源模板的搜尋結果Fig.1 Search of homologous sequences of OmpW of V.parahaemolyticus

2.2 分子對接

根據(jù)文獻報道選擇5 種具有抑菌作用的小分子作為篩選對象，從Pubchem 下載這些小分子的結構，并作為配體進行對接，最佳構象的打分結果如表2所示。結果表明，在這5 種天然植物源小分子中，咖啡酸和檸檬酸的打分較高，這說明咖啡酸和檸檬酸與副溶血弧菌OmpW 的相互作用較強，可能產(chǎn)生的抑制作用也更強。

DS 軟件搜尋的潛在活性位點共有6 個，如圖2所示。據(jù)Soojhawon 等[9]的研究結果，靠近周質空間且位于桶狀結構內(nèi)側的位點（Site2）是最有可能的活性位點。在該位點與咖啡酸對接時，咖啡酸的O 和受體蛋白中ASP26 的O 產(chǎn)生了一個不利的相互作用（Unfavorable interaction），因此選用同樣位于桶狀結構內(nèi)側的Site1 作為與咖啡酸對接位點，Site2 作為與檸檬酸對接的位點，且結果較為理想。

圖3顯示的是檸檬酸與外膜蛋白OmpW 模型的對接結果及產(chǎn)生的相互作用。圖3a 顯示了檸檬酸在與受體蛋白結合時的狀態(tài)與位置，顯然兩個小分子處在相對疏水的桶狀結構內(nèi)側。如圖3b所示，檸檬酸與外膜蛋白OmpW 中的氨基酸殘基TYR111、ASN174、ARG30、VAL28 形成了5條經(jīng)典氫鍵（Conventional hydrogen bond），這些氫鍵的氫供體和受體之間的距離均小于或接近于3?，且DHA 和HAY 角均落在90°～180°之間，表明很可能形成了強氫鍵[21-22]。而檸檬酸與GLY65、SER73 形成2 條非經(jīng)典的CH...O 氫鍵（Carbon hydrogen bond），盡管比經(jīng)典氫鍵作用弱，但在蛋白質-配體的結合中也起到一定作用[23]。除了氫鍵，ARG30 側鏈的NH2還與檸檬酸的O 產(chǎn)生靜電相互作用（Attractive charges）。此外，圖3b 顯示出配體與TYR122、ASP164 等8 個氨基酸殘基產(chǎn)生了范德華相互作用。

表2 分子對接打分結果Table 2 Results of molecular docking scoring

圖2 DS 軟件定義的OmpW 潛在活性位點Fig.2 Potential OmpW active sites defined by DS software

咖啡酸與受體蛋白產(chǎn)生的相互作用主要有氫鍵、疏水相互作用和范德華相互作用，見圖4?？Х人嶂蟹恿u基的H 與THR105 側鏈上-OH 的O、羧基的O 與MET207 形成強氫鍵，同時羧基上的另2 個O 分別與蛋白的ALA177 和TRP178 形成弱氫鍵。咖啡酸的苯環(huán)與TRP178 的兩個π 環(huán)（包括但不僅僅包括芳香環(huán)）均有相互作用，π 軌道產(chǎn)生堆疊效應（Pi-Pi T-shaped）。此外咖啡酸還與兩個非極性的氨基酸殘基ALA34 和VAL205 產(chǎn)生另一種類型的疏水相互作用（Pi-Alkyl）。疏水相互作用以及疏水與親水的平衡是維持蛋白質-配體結構穩(wěn)定的主要作用力之一[24]。此外，咖啡酸還與SER35、PHE82 等8 個氨基酸殘基之間存在范德華力。

上述提及的均為非鍵相互作用，與共價鍵相比，非鍵相互作用非常弱，但是它們的累積和堆疊效應是巨大的，對配體與蛋白的結合以及蛋白質-配體的構象穩(wěn)定起到至關重要的作用[24]。

圖3 檸檬酸與OmpW 模型對接結果Fig.3 Docking results of citric acid with OmpW model

圖4 咖啡酸與OmpW 模型對接結果Fig.4 Docking results of caffeic acid with OmpW model

2.3 最小抑菌濃度

由表3結果可知，檸檬酸與咖啡酸對副溶血弧菌ATCC17802 均有抑制作用。去外膜和去壁處理增加了副溶血弧菌ATCC17802 對檸檬酸與咖啡酸的敏感性，其MIC 分別減小為原來的1/16 和1/64，這說明抑制劑確實與外膜蛋白OmpW 產(chǎn)生了相互作用，并可能使之失去原有的生理功能（控制物質進出等）。另外，有研究表明外膜蛋白與周質空間和內(nèi)膜的蛋白形成復合物體系，這一體系可能對藥物進行外排，而失去了外膜甚至細胞壁后，沒有體系的外排作用，敏感性明顯增強[25]。

表3 檸檬酸與咖啡酸對副溶血弧菌ATCC17802 的MIC（mg/mL）Table 3 MIC of citric acid and caffeic acid on V.parahaemolyticus ATCC17802 （mg/mL）

2.4 殺菌曲線

不同濃度的檸檬酸與咖啡酸對副溶血弧菌ATCC17802 3 種狀態(tài)菌體的抑制情況通過殺菌曲線的形式加以分析。圖5結果表明，當檸檬酸濃度為副溶血弧菌ATCC17802 正常菌體MIC 的1/64和1/32 時，對于正常菌體幾乎沒有抑制作用，而對于去外膜和去壁的菌體卻能夠完全抑制其生長，24 h 內(nèi)OD600nm的上下波動均不超過0.2，這與檸檬酸對不同菌體MIC 測定結果相一致。當檸檬酸濃度達到MIC 和2 MIC 時，3 種狀態(tài)的菌體均受到很大程度的抑制，只有未加檸檬酸的空白組呈現(xiàn)出正常的生長曲線。Ye 等[26]發(fā)現(xiàn)，在濃度為1/2 MIC 的硫酸新霉素的作用下，阪崎腸桿菌ΔOmpW 缺失株的存活率明顯低于野生型菌株，且缺失株生物膜形成率的下降幅度大于野生型菌株。彭志鋒等[27]通過微量稀釋法測定多種抗菌藥物對鴨源雞桿菌親本菌株RU 和突變株ΔOmpW的MIC，結果顯示，相對于RU，土霉素和四環(huán)素對ΔOmpW 的MIC 值分別降低到1/8 和1/32，這些結果說明，外膜β-桶狀蛋白很可能就是抑菌劑作用的位點。

圖5 不同濃度的檸檬酸對副溶血弧菌ATCC17802 的殺菌曲線Fig.5 Killing curves of V.parahaemolyticus ATCC17802 under different concentrations of citric acid

圖6結果表明，當咖啡酸濃度為副溶血弧菌ATCC17802 正常菌體MIC 的1/16 或1/8 時，正常菌體幾乎沒有受到任何抑制作用，與空白對照相比OD600nm相差不大（P>0.05），曲線呈S 型。而去外膜和去壁的菌體卻幾乎完全被抑制，這同樣與咖啡酸對不同菌體MIC 測定結果相一致。當咖啡酸濃度增加到MIC 或2MIC 時，3 種狀態(tài)的菌體均受到抑制，只有未加咖啡酸的空白組呈現(xiàn)出正常的生長曲線。有研究表明對茶多酚具抑菌活性起重要作用的是茶多酚分子內(nèi)的多個酚羥基。酚羥基可與蛋白質分子中的氨基或羧基發(fā)生結合反應，其疏水性的苯環(huán)也可以與蛋白質發(fā)生疏水結合反應，而茶多酚與蛋白質之間的結合作用阻斷了細菌的侵染路徑，故而能夠抑菌[28]。而咖啡酸有2 個相鄰的酚羥基，這2 個酚羥基可能是咖啡酸的2個活性基團，與副溶血弧菌外膜β-桶狀蛋白通道中的疏水基團相互作用，起到抑菌作用，這在分子對接時已經(jīng)體現(xiàn)。

圖6 不同濃度的咖啡酸對副溶血弧菌ATCC17802 的殺菌曲線Fig.6 Killing curves of V.parahaemolyticus ATCC17802 under different concentrations of caffeic acid

2.5 有效性驗證

表4結果顯示，檸檬酸和咖啡酸對副溶血弧菌ATCC33847、分離株1（白蛤）、分離株2（鮑魚）以及耐藥株均有抑制作用。且去外膜和去壁之后，MIC 均顯著減小，該結果與測定的副溶血弧菌ATCC17802 的MIC 規(guī)律一致。Lin 等[29]的研究結果也表明，從大腸桿菌中刪除OmpW 引起幾種抗生素的MIC 降低，OmpW 可能是革蘭氏陰性細菌的潛在藥物靶標[30]，檸檬酸和咖啡酸的作用位點極可能是副溶血弧菌OmpW。

表4 檸檬酸和咖啡酸對4 種菌株類型的副溶血弧菌的MIC（mg/mL）Table 4 MIC of citric acid and caffeic acid against four kinds of strains of V.parahaemolyticus （mg/mL）

3 結論

本研究結果表明，以分子對接技術為基礎篩選副溶血弧菌抑菌劑的方法可行。檸檬酸和咖啡酸對副溶血弧菌的抑菌效果較理想，MIC 均為2 mg/mL。此外，檸檬酸和咖啡酸的作用靶點位于副溶血弧菌外膜上β-桶狀蛋白OmpW 的可能性很高，去外膜和去壁菌體的MIC 和殺菌曲線測定結果均證實了外膜對于菌體對抗小分子抑菌劑的重要作用。但還需要更深入地對抑菌劑與外膜蛋白OmpW 的相互作用進行生物物理表征，以證實其作為潛在藥物靶標的作用。