楊耀長，張志超，王衛(wèi)東，宋睿，張偉，巨云為

(1.山東省煙臺市蓬萊區(qū)林業(yè)局，山東 煙臺 265600；2.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

松材線蟲病又稱松萎蔫病，是松屬(Pinus)植物的一種重要病害，其病原之一為松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)，屬側(cè)尾腺口綱(Secernentea)滑刃科(Aphelenchoidoidea)傘滑刃屬(Bursaphelenchus)。趙博光等[1]提出松萎蔫病是由松材線蟲及其體表所攜帶的細(xì)菌共同引起的，噻吩類殺蟲劑對多種昆蟲有顯著的光活化毒殺作用[2-5]。α-三噻吩是噻吩類殺蟲劑的典型代表，因其具有高效低毒、作用方式多樣、易降解及不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點[6-7]，常被用于殺滅蚊(Culexpipiens)、蠅(MuscadomesticaL.)等衛(wèi)生害蟲[8-9]。王建斌等[10]對α-T的殺松材線蟲活性進行了測定，1×10-5g/mL和1×10-6g/mL的α-T溶液在光照強度大于1 250 Lx時，對線蟲的致死率約為92%和80.5%，證實α-T具有良好的殺線蟲效果。惡喹酸(OA)屬于喹啉酮類殺菌劑，通過抑制細(xì)菌DNA的合成，從而阻礙細(xì)菌的分裂和增殖。Kwon等[11]通過研究殺菌劑-OA對松材線蟲病的抑制作用發(fā)現(xiàn)，OA可以顯著增強對松材線蟲病的防治效果。單獨注射惡喹酸的3 a生染松材線蟲病黑松(Pinusthunbergii)苗的死亡率為30%，單獨注射阿維菌素的染病松苗的死亡率為20%，二者混用后染病松苗的死亡率僅為10%。

因此，本文對α-三噻吩(α-terthienyl,α-T)與惡喹酸(Oxolinic Acid,OA)聯(lián)合應(yīng)用對松材線蟲的毒殺作用及對其繁殖的影響進行研究，并研究α-T與OA的混合溶液對接種過松材線蟲的黑松離體松枝的影響，以期為α-T與OA的混合溶液對松材線蟲病的防治方法和作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試試劑及材料

α-三噻吩(α-T)，純度99.9%，美國Sigma公司生產(chǎn)，由加拿大林務(wù)局Dr.Blair Helson贈送；惡喹酸(OA)，純度99.43%，西安萬昌生物科技有限公司生產(chǎn)；二甲基亞砜(DMSO，分析純)，純度99.8%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森保實驗室提供；供試松材線蟲，是由山東長島疫區(qū)感染松材線蟲病致死的黑松上分離提取，并置于南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森保實驗室培養(yǎng)。

1.2 試驗儀器

TG328B型光學(xué)分析天平，內(nèi)徑為2.5 cm和9 cm的培養(yǎng)皿，計數(shù)器，250 D型恒溫光照培養(yǎng)箱，HITACHI U-5100型光度計，夾鏈密封袋，15 mL塑料離心管，TG16型臺式高速離心機，移液槍，誘捕器(含誘芯)，解剖刀，OLYMPUS BH 2型顯微鏡。其中，TG328B型光學(xué)分析天平，為上海精科天美儀器有限公司生產(chǎn)；250D型恒溫光照培養(yǎng)箱，為常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司生產(chǎn)；TG16型臺式高速離心機，為上海盧湘儀離心機儀器有限公司生產(chǎn)；HITACHI U-5100型光度計和OLYMPUS BH 2型顯微鏡均為日本進口。

1.3 溶液配制

1.3.1 毒殺試驗及離體松枝試驗中溶液的配制

稱取α-T 0.05 g，加入1 mL二甲基亞砜，待α-T溶解后加入約0.1 mL吐溫20乳化，加蒸餾水定容至50 mL，即得濃度為1×10-3g/mL的α-T母液。分別取1、0.5、0.1、0.05、0.01 mL的 α-T母液加蒸餾水定容稀釋至1 L，即得到濃度分別為1×10-6、5×10-7、1×10-7、5×10-8、1×10-8g/mL的α-T溶液各1 L。將所得溶液用錫箔紙包裹容器避光后，置于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取OA 0.05 g，加入蒸餾水使其充分溶解，定容至50 mL，得到濃度為1×10-3g/mL的OA母液。采用α-T母液定容稀釋的同樣方法，分別取部分OA母液加蒸餾水稀釋，得到濃度分別為1×10-6、5×10-7、1×10-7、5×10-8、1×10-8g/mL的OA溶液。將所得溶液用錫箔紙包裹容器避光后，置于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

將濃度為1×10-3g/mL的α-T溶液和OA溶液稀釋得到濃度分別為2×10-6、1×10-6、2×10-7、1×10-7、2×10-8g/mL的α-T溶液和OA溶液，將同濃度的2種溶液等量混合，得到濃度分別為1×10-6、5×10-7、1×10-7、5×10-8、1×10-8g/mL的混合溶液。將所得溶液用錫箔紙包裹容器避光后，置于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 α-T與OA聯(lián)合應(yīng)用對松材線蟲繁殖影響試驗中溶液的配制

分別取α-T母液和OA母液，通過稀釋配制成濃度分別為5×10-8、1×10-8、5×10-9、1×10-9、5×10-10g/mL的α-T溶液和OA溶液。

將濃度為2×10-3g/mL的α-T溶液和OA溶液等量混合，得到濃度為1×10-3g/mL的混合溶液，通過稀釋配制濃度分別為5×10-8、1×10-8、5×10-9、1×10-9、5×10-10g/mL的混合溶液。

1.4 試驗方法

1.4.1 α-T與OA聯(lián)合應(yīng)用對松材線蟲的毒殺試驗

挑取實驗室培養(yǎng)的松材線蟲(不少于200條)，將其置于直徑為3.5 cm的培養(yǎng)皿中，用1.3.1中配制的每個濃度溶液及自來水對照(CK)進行5組重復(fù)處理。將處理過的松材線蟲置于27 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)光照強度為450 Lx。于24 h后從恒溫培養(yǎng)箱中取出松材線蟲，在顯微鏡下隨機挑取出200條松材線蟲，觀察并記錄死亡線蟲的數(shù)量。

各種處理的線蟲死亡率=處理后死亡線蟲數(shù)量/試驗前線蟲總蟲數(shù)×100%

校正死亡率=(處理組死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)×100%

增長率=(α-T和OA的混合溶液作用下的校正死亡率-α-T作用下的校正死亡率)/α-T作用下的校正死亡率×100%

1.4.2 α-T與OA聯(lián)合應(yīng)用對松材線蟲繁殖影響試驗

將1.3.2配制的15種不同溶液和1個CK(共計16種處理)，分別在PDA培養(yǎng)基上均勻涂抹1 mL，并接種灰葡萄孢。將上述所得培養(yǎng)基用鋁箔紙包裹避光后，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取適量培養(yǎng)好的松材線蟲用兩層紗布包好，置于貝曼漏斗中，加適量的水，在常溫下分離6～12 h；接取約10 mL線蟲懸浮液，配制的懸浮液中線蟲的密度達(dá)到20條/μL，將裝有懸浮液的試管密封后置于4 ℃以下冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

取長滿灰葡萄孢的內(nèi)徑為2.5 cm培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基，以未用藥劑處理的培養(yǎng)基為對照(CK)，每皿接種松材線蟲成蟲20條，雌、雄各10條。將小培養(yǎng)皿放入內(nèi)徑為9 cm的大培養(yǎng)皿中，用濕潤濾紙保濕，并用Parafilm“M”膜封口，后放入28 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(光強<0.1 Lx)。5 d后用貝曼漏斗法分離松材線蟲并計數(shù)。由于α-T溶液和OA溶液及其混合溶液，各為5種處理，加一組自來水對照，每個處理設(shè)計為16皿，5組重復(fù)。

各處理對線蟲繁殖的抑制率的計算公式為：

抑制率=(對照組線蟲存活平均數(shù)-處理組線蟲存活平均數(shù))/對照組線蟲存活平均數(shù) ×100%

增長率=(α-T和OA的混合溶液作用下的抑制率-α-T作用下的抑制率)/α-T作用下的抑制率×100%

1.4.3 α-T與OA聯(lián)合應(yīng)用對松材線蟲防治作用的離體松枝試驗

選取苗圃地中樹勢良好的5 a生黑松，剪取生長狀況良好且相似的1 a生枝條，直徑在0.8～1.0 cm，長約25 cm，采集后立刻浸入自來水中備用。

去除松枝下部的松針，并剔除一部分上部松針，以減少松枝蒸騰失水。在松枝底端往上約1/3處，用解剖刀沿枝干斜切入木質(zhì)部，切口深約1 mm，長約5 cm，并用鋸齒在裸露的木質(zhì)部刮幾下，模擬天牛咬食痕，主要為防止接種的懸浮液下滑，然后將含有約500條線蟲的懸浮液均勻注入切口處，這樣處理可使松枝接種約500條線蟲。取口徑7 cm，高15 cm的玻璃瓶，加入自來水至玻璃瓶的1/2左右，將處理過的松枝放入瓶中，用聚乙烯薄膜封住瓶口。

2 d后將松枝取出，將玻璃瓶中的自來水處理干凈，并分別注入濃度為1×10-6、5×10-7、1×10-7、5×10-8、1×10-8g/mL等α-T溶液和OA溶液及其混合溶液至玻璃瓶1/2，將松枝插入瓶中，每瓶1枝，以只接種松材線蟲松枝+自來水為對照(CK1)，以未接種松材線蟲松枝+自來水作為空白對照(CK2)，共計17種處理，每個處理設(shè)10個重復(fù)。將放入松枝的玻璃瓶用聚乙烯薄膜封住瓶口，放入可見光強度為800 Lx的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每日觀察松枝的生長狀況，確保玻璃瓶中的溶液充足，從發(fā)現(xiàn)松枝發(fā)病起記錄數(shù)據(jù)直至單獨接種松材線蟲對照組大部分死亡。統(tǒng)計各種藥物溶液處理下的離體松枝的枯萎?dāng)?shù)量，計算出枯萎率。根據(jù)枯萎率，判斷出各種藥物溶液不同濃度對松材線蟲病防治效果的強弱。

校正枯萎率=(處理下松枝枯萎?dāng)?shù)量-空白對照下松枝枯萎?dāng)?shù)量)/(10-空白對照下松枝枯萎?dāng)?shù)量)×100%

校正枯萎率下降率=(α-T作用下的校正枯萎率-α-T和OA的混合溶液作用下的校正枯萎率)/α-T作用下的校正枯萎率×100%

校正枯萎率的方差分析以反正弦轉(zhuǎn)換后利用SPSS 19.0軟件計算。

1.4.4 毒力回歸計算方法

在測算出各處理組相同藥物不同試驗濃度下線蟲數(shù)量等相關(guān)數(shù)據(jù)后，再應(yīng)用Excel進行毒力回歸分析[13]，得出毒力回歸方程y=b+ax，及相關(guān)系數(shù)R值、EC50值(半數(shù)有效濃度值)、死亡率和校正死亡率等相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-T與OA聯(lián)合應(yīng)用對松材線蟲的毒殺作用

由表1中α-T溶液試驗數(shù)據(jù)可知，α-T在光照條件下對松材線蟲有很好的殺滅作用，隨著濃度的增加，殺滅作用逐漸增強。與CK相比，低濃度的α-T溶液仍可對松材線蟲起到一定的殺滅作用。當(dāng)α-T濃度≥1×10-6g/mL時，松材線蟲的死亡率可達(dá)96%以上。

其毒力回歸方程為：y=0.247 33x+3.411 1，R2=0.027 82，EC50≈1×10-6g/mL

由表1中OA溶液試驗數(shù)據(jù)可知，OA對松材線蟲本身并無明顯的殺滅作用。由表1中α-T和OA混合溶液試驗數(shù)據(jù)可知，同濃度的α-T與OA等量混合溶液對于松材線蟲有很好的殺滅作用，殺滅作用隨濃度的降低逐漸減弱。當(dāng)濃度≥5×10-7g/mL時，毒殺效果可達(dá)99%以上。

其毒力回歸方程為：y=-1.304 8x+14.65，R2=0.862 9，EC50≈1×10-7g/mL

由表1中α-T作用下的校正死亡率、OA作用下的校正死亡率、α-T和OA的混合作用下的校正死亡率和增長率等數(shù)據(jù)可知，不同濃度α-T和OA溶液對松材線蟲均具有一定的毒殺作用，其中，α-T對松材線蟲的毒殺作用隨著濃度降低而減弱。OA對松材線蟲沒有明顯的毒殺作用，但當(dāng)兩者混合時對α-T的毒殺效果有一定的增效作用，尤其當(dāng)濃度為5×10-7g/mL時，增效作用達(dá)到最強。

表1 α-T和OA對松材線蟲的毒殺作用

2.2 α-T與OA聯(lián)合應(yīng)用對松材線蟲繁殖的抑制作用

如表2中α-T溶液試驗數(shù)據(jù)所示，在黑暗條件下，α-T對松材線蟲的繁殖具有非常強的抑制作用，其抑制作用隨著α-T濃度的增加而逐漸增強。當(dāng)α-T濃度>1×10-8g/mL時，其抑制率可達(dá)80%以上。

如表2中OA溶液試驗數(shù)據(jù)所示，在黑暗條件下，OA對松材線蟲的繁殖具有一定的抑制作用，但效果并不明顯。隨著OA溶液濃度的增加，其對松材線蟲繁殖的抑制作用逐漸增強。

由表2中α-T和OA混合溶液試驗數(shù)據(jù)可知，在黑暗條件下，同濃度的α-T與OA混合溶液對松材線蟲的繁殖具有很強的抑制作用，其抑制率隨著溶液濃度的增加而逐漸上升。當(dāng)混合溶液濃度≥1×10-8g/mL時，其抑制率達(dá)80%以上；當(dāng)混合溶液濃度為5×10-8g/mL時，其抑制率達(dá)92.3%。

由表2中α-T作用下的抑制率、OA作用下的抑制率、α-T和OA的混合作用下的抑制率和增長率等數(shù)據(jù)可知，α-T和OA對松材線蟲的繁殖都具有一定的抑制作用，但OA的抑制作用弱于α-T。α-T、OA及其混合溶液對松材線蟲的繁殖的抑制率均隨著濃度的降低而下降，使用混合溶液時的抑制率高于單獨使用α-T或OA。

表2 α-T和OA對松材線蟲繁殖的抑制效果

2.3 α-T與OA對松材線蟲病防治作用的離體松枝試驗

每日觀察松枝的生長狀況，確保玻璃瓶中的水分充足，從發(fā)現(xiàn)松枝發(fā)病起記錄數(shù)據(jù)直至單獨接種松材線蟲對照組松枝大部分枯萎死亡。在試驗松枝接種線蟲15 d后，部分針葉開始出現(xiàn)變黃現(xiàn)象；接種30 d后，有接種松枝枯萎死亡；在接種50 d后，CK1松枝大部分枯萎死亡，見表3。

表3 α-T和OA對松材線蟲防治作用的離體松枝實驗

由表3中α-T溶液試驗數(shù)據(jù)可知，CK2松枝只枯萎1枝，而CK1松枝枯萎?dāng)?shù)量達(dá)到9枝，因此利用切根苗做此實驗完全可行。采用其他濃度處理的松枝枯萎?dāng)?shù)量最高為4枝，最低為1枝，且隨著濃度的增加枯萎?dāng)?shù)量逐漸減少。對表中校正枯萎率數(shù)據(jù)反正弦轉(zhuǎn)換后進行方差分析，以線蟲+5×10-7g/mLα-T溶液處理為最好，與其他處理均達(dá)極顯著差異(P<0.01)。由此可知，α-T對松材線蟲具有良好的防治效果。

由表3中OA溶液試驗數(shù)據(jù)可知，與CK1相比，OA不同濃度處理的離體松枝枯萎?dāng)?shù)量有所減少，但相差不大。從校正枯萎率數(shù)據(jù)的方差來看，對松材線蟲防治作用較好的OA溶液濃度為1×10-6g/mL，其校正枯萎率僅為55.6%，與其他濃度間差異不顯著。這表明OA對松材線蟲病具有一定的防治作用，但防治效果不明顯，且與OA的濃度無關(guān)。

由表3中α-T和OA混合溶液試驗數(shù)據(jù)可知，混合溶液對松材線蟲病的防治作用很強，且低濃度的混合溶液即可很好地防治松材線蟲病。隨著混合溶液濃度的增加，其松枝的枯萎?dāng)?shù)量逐漸減少，方差分析結(jié)果表明，各處理與CK1間均表現(xiàn)出極顯著的差異(P<0.01)，其中，以1×10-6g/mL混合溶液和5×10-7g/mL混合溶液效果最好，其校正枯萎率均為0。

由表3中α-T作用下的校正枯萎率、OA作用下的校正枯萎率、α-T和OA的混合作用下的校正枯萎率和枯萎率的下降率等數(shù)據(jù)可知，α-T不同濃度處理的松樹枯萎率隨著其濃度的增加而下降。而OA不同濃度處理的松樹枯萎率低于CK1的枯萎率，說明其對松材線蟲病具有一定的防治作用。當(dāng)α-T與OA混合使用時，其對松材線蟲病的防治效果在一定程度上得到了增強，其校正死亡率平均下降率為36.67%，防治效果明顯?；旌先芤簩λ刹木€蟲病的防治作用隨著濃度的下降而減弱，在1×10-6g/mL和5×10-7g/mL濃度時，防治效果最好。

3 結(jié)論與討論

本研究以線蟲與細(xì)菌復(fù)合致病假說為前提，從多方面測試了α-T與OA混合溶液聯(lián)合毒殺松材線蟲的可行性。在光照條件下，α-T對松材線蟲具有良好的毒殺作用；當(dāng)線蟲侵入寄主體內(nèi)，在無光照的條件下，α-T可抑制松材線蟲的繁殖。

通過α-T 和OA聯(lián)合應(yīng)用對松材線蟲的毒殺試驗可知，在α-T溶液濃度≥1×10-6g/mL時，對松材線蟲具有良好的毒殺作用。作為抗生素，OA對松材線蟲的生長并無影響。將α-T和OA溶液進行混合，當(dāng)混合溶液濃度≥5×10-7g/mL時，可對松材線蟲起到很好的防治作用。

作為一種典型的光敏毒素，α-T在光照條件下對松材線蟲具有良好的殺滅作用，王建斌等[10]采用浸漬法對α-T在可見光下對松材線蟲的毒性做了測定，結(jié)果表明光強越高，α-T對松材線蟲的毒性越強。但樹體內(nèi)有時并無陽光直射或者光照強度很弱，α-T在無光條件下是否能對松材線蟲病起到很好的防治作用？本試驗在無光照的條件下研究了α-T對松材線蟲繁殖的影響，結(jié)果表明在無光條件下，α-T(α-T與OA的混合溶液)可明顯抑制松材線蟲的繁殖，從而減輕其對寄主的危害。α-T和OA對松材線蟲的繁殖都具有一定的抑制作用，但OA的抑制作用弱于α-T。α-T、OA及其混合溶液對松材線蟲的繁殖的抑制率均隨濃度降低而下降，使用混合溶液時的抑制率高于單獨使用α-T或OA。因此，α-T與OA對松材線蟲防治作用的離體松枝試驗在可見光下進行。另外，由于在混合溶液的配置過程中容易產(chǎn)生沉淀，所以要確保α-T及OA溶解完全。

通過離體松枝試驗可知，α-T與OA對松材線蟲病均有一定的防治作用，但α-T的防治作用更為明顯。當(dāng)α-T溶液濃度為1×10-6、5×10-7、1×10-7g/mL時，松枝的校正枯萎率最高僅為11.1%，最低為0。單獨使用OA對松材線蟲病也有一定的防治作用。作為一種殺菌劑，OA本身對松材線蟲沒有殺滅作用，但其可作用于線蟲體表的細(xì)菌。根據(jù)趙博光等[12]提出的松萎蔫病的線蟲和細(xì)菌復(fù)合侵染的假說，殺滅松材線蟲體表的細(xì)菌可防止松材線蟲病的發(fā)生。與單獨使用α-T或者OA相比，兩者混合使用對松材線蟲的防治效果明顯更好。α-T可直接殺滅松材線蟲，OA可控制松材線蟲體表的細(xì)菌，使其不能產(chǎn)生致萎毒素，這就是兩者混合使用可增強防效之原因所在。