陸婷，陳少瑜，吳濤，肖良俊

(1.云南省林業(yè)和草原技術推廣總站，云南 昆明 650224；2.云南省林業(yè)和草原科學院 經濟林研究所，云南 昆明 650201；3.云南省林業(yè)和草原科學院/云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室/國家林業(yè)和草原局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室，云南 昆明 650201)

胡桃屬(JuglansL.)植物在世界上有23個種，我國有13個種[1]，其中分布較廣且栽培較多的是核桃(J.regia)和深紋核桃(J.sigillata)2個種[2]。深紋核桃廣泛分布于西南地區(qū)，為我國特有種[3]，云南作為深紋核桃的主要分布區(qū)之一，深紋核桃栽培歷史悠久，種質資源非常豐富。迪慶藏族自治州位于滇西北，滇、藏、川3省(區(qū))交界處，世界上著名的“三江并流”腹心地帶，其間高山峽谷縱橫，境內海拔最高處是6 740 m的梅里雪山主峰卡瓦格博峰，最低處海拔為1 486 m的瀾滄江河谷，絕對高差5 254 m，小范圍內的巨大高差導致了境內的垂直氣候和立體生態(tài)環(huán)境[4]。經初步調查此區(qū)域核桃種質資源具有豐富的多樣性，然而，隨著近年來核桃產業(yè)的發(fā)展，良種和無性系的推廣種植，核桃天然資源遭到破壞，致使當?shù)睾颂曳N質資源遺傳多樣性逐漸喪失。開展核桃種質資源遺傳多樣性研究是對資源科學保護和利用的重要理論基礎，因此在了解迪慶州核桃種質資源的遺傳多樣性水平及遺傳結構特征基礎上，制定并積極采取科學的保護和開發(fā)利用措施顯得尤為必要。

作為評價遺傳多樣性的一種重要技術，DNA分子標記廣泛應用于各種植物的多樣性研究中[5]。在最為常用的幾種分子標記技術中，簡單重復序列(simple sequence repeats，SSRs)標記是基于PCR的核酸多態(tài)檢測技術，具有靈敏性和穩(wěn)定性高、通用性強、共顯性等優(yōu)點，廣泛用于植物的指紋分析、品種鑒定、遺傳結構和系統(tǒng)進化等研究中[6-8]，對于核桃種質資源的遺傳多樣性也有一些研究報道[9-13]，但對迪慶州核桃種質資源的遺傳多樣性狀況仍未有了解。本研究基于SSR分子標記技術對云南省迪慶藏族自治州3個群體共161份深紋核桃種質資源進行遺傳多樣性分析，揭示資源的遺傳多樣性水平及遺傳結構特征，為其保護和利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地概況及材料來源

迪慶藏族自治州位于云南省西北部(90°35′～100°18′ E，26°52′～29°16′ N)，地處青藏高原東南邊緣，橫斷山南段北端，滇、川、藏3省(區(qū))交界處。全州土地面積23 870 km2，平均海拔3 380 m，最高海拔為梅里雪山主峰卡瓦格博峰(6 740 m)，最低海拔為瀾滄江河谷(1 486 m)。迪慶州屬溫帶-寒溫帶氣候，年平均氣溫10.6 ℃，年極端最高氣溫25.1 ℃，最低氣溫-27.4 ℃，該州轄德欽縣、維西傈僳族自治縣和香格里拉市，3個縣(市)皆有核桃的分布。

試驗分析的161份深紋核桃單株樣品分別采自迪慶州的3個縣(市)(各單株相距100 m以上)，每個縣(市)的資源作為1個群體進行遺傳多樣性分析，3個群體的地理信息及樣本數(shù)量見表1。以采集的單株穗條(二倍體)作為1個樣本，穗條采回后取韌皮提取DNA。

表1 核桃群體的地理信息及樣本數(shù)量

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃基因組DNA的提取

核桃基因組DNA的提取采用改進的CTAB法[14]，其濃度和純度用1%的瓊脂糖凝膠電泳及紫外可見分光光度計(thermo scientific)進行檢測，將DNA樣品濃度用Tris-EDTA緩沖液調至20 ng/μL，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物確定及SSR-PCR擴增和擴增產物的毛細管電泳檢測

參照陳少瑜等[15]的方法，用20對初步篩選的引物[16]對3個群體中隨機抽取的3～5份樣品進行擴增，丙烯酰胺電泳確定有擴增結果且條帶清晰穩(wěn)定的引物。將確定的引物用以全部樣品的擴增，擴增結果采用毛細管電泳[17]檢測記錄。

1.3 統(tǒng)計及分析

將檢測到的SSR片段錄入Exel表，利用GenAIEx 6.5[18]及POPGENE 1.32[19]計算分析群體的觀察等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Shannon信息指數(shù)(I)等遺傳多樣性參數(shù)；群體間的遺傳距離(D)、遺傳一致度(I)、F-統(tǒng)計量(FIS、FIT、FST)及基因流(Nm)[20]等群體遺傳分化參數(shù)。

基于群體的遺傳距離，運用Mega 6.06軟件進行UPGMA聚類并繪制各群體遺傳關系樹狀圖[21]。

利用STRUCTURE 2.3.2軟件分析核桃群體的遺傳結構[22]。將聚類參數(shù)K設置為2～15，每個K值獨立重復運算10次，運行參數(shù)“Length of Burn-in Period”為10 000次，“Number of MCMC Reps of Burning”設為100 000次。采用ΔK值最大原則選取最佳K值[23]，結果通過Distruct軟件[24]繪制群體遺傳結構圖。

2 結果與分析

2.1 引物及擴增結果

經丙烯酰胺電泳檢測最終確定18對引物用以161份樣品的擴增，引物序列及相關信息參見文獻[16]，擴增結果列于表2。由表2可見，18對引物對161份樣品擴增片段的大小為96～250 bp，共檢測到171個等位基因，平均每個引物檢測到9.5個等位基因，其中引物CUJRB103a和CUJRB220檢測到的等位基因最多(各16個)，引物JUG-13和ZMZ-11的最少，分別只有3個。

表2 18對SSR引物及擴增結果

2.2 核桃群體的遺傳多樣性

18對引物對3群體161份樣品的擴增結果經POPGENE 1.32軟件分析得到群體的遺傳多樣性參數(shù)(表3)。由表3可見，3個群體的觀察等位基因數(shù)(Na)的變化范圍為5.556～7.111，平均為6.574；有效等位基因數(shù)(Ne)的變化范圍為2.862～3.174，平均為3.030；觀察雜合度(Ho)的變化范圍為0.390～0.580，平均為0.467；期望雜合度(He)的變化范圍為0.580～0.619，平均為0.598；Shannon信息指數(shù)(I)介于1.153～1.313之間，平均為1.231，3個群體的多態(tài)位點百分率(P)均為100%。除了多態(tài)位點百分率，各群體的其他遺傳參數(shù)存在明顯差異。綜合比較3個群體的遺傳參數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，維西群體的Ne、He和I最高(Ne=3.174，He=0.619，I=1.313)，德欽群體的最低(Ne=2.862，He=0.580，I=1.153)，說明3個群體中維西群體擁有相對較高的遺傳多樣性，德欽的相對較低。

表3 迪慶州3個核桃群體的遺傳多樣性

2.3 核桃群體的遺傳分化及遺傳結構

表4顯示了迪慶州3個核桃群體間遺傳分化狀況。由表4可知，群體間的近交系數(shù)(FIS)介于-0.168 5～0.495 9之間，平均為0.218 7，其中1個位點(JSI-63)雜合子過剩。群體間的遺傳分化系數(shù)(FST)介于0.005 2～0.225 3之間，平均為0.065 2。數(shù)據(jù)表明遺傳變異主要存在于群體內，來源于群體間的遺傳變異只占總變異的6.52%。各位點的基因流(Nm)差異較大，變化范圍在0.859 5～9.454 9之間，平均為4.266 3。

表4 迪慶州3個核桃群體的遺傳分化與基因流

利用STRUCTURE分析迪慶州核桃種質資源群體的遺傳結構，當K=3時ΔK值最大(圖1)，表明161份核桃資源具有3個不同類群(圖2)，紅色、綠色和紫色分別代表3個類群，由圖2可見雖然類群間存在一定的遺傳混雜和基因交流現(xiàn)象，但仍可看出較為明顯的分化，其中德欽群體遺傳混雜程度相對較小，維西和香格里拉群體較為相似，3個類群的單株基本均勻分布。

圖1 最佳類群數(shù)(K)與推斷值(ΔK)的關系

圖2 基于STRUCTURE分析的迪慶州3個核桃群體的遺傳結構

2.4 群體間的遺傳關系及UPGMA聚類

為了進一步了解迪慶州3個核桃群體間的遺傳關系，利用群體間的Nei’s遺傳距離(表5)進行UPGMA聚類。由表5可見，3個群體遺傳距離(D)的變化范圍為0.127 8～0.201 3。其中，維西和香格里拉的遺傳距離最小(D=0.127 8)，維西和德欽的遺傳距離最大(D=0.201 3)。從聚類圖(圖3)可以看出，3個群體在遺傳距離0.13處可以劃分成2個組，維西和香格里拉聚為一組，德欽單獨為一組。

表5 迪慶州3個核桃群體間的Nei’s遺傳距離(D)與遺傳一致度(I)

圖3 基于Nei’s遺傳距離的3個群體的UPGMA聚類圖

3 討論與結論

遺傳多樣性是物種長期生存和保持進化的基礎[25]。通常采用Shannon’s信息指數(shù)(I)和期望雜合度(He)作為評估群體遺傳多樣性的重要指標，其中He不僅可以衡量群體的遺傳多樣性，還可以反映群體中等位基因的豐富度和均勻程度[26-27]。本研究中，3個核桃群體He的平均值為0.598，I的平均值為1.231，高于此前劉曉麗等[28](He=0.282；I= 0.422 5)，Wang H 等(He=0.525[9]；He=0.586[11])以及吳濤等[16](He=0.591；I= 1.157)基于SSR分子標記的核桃群體(J.regia或J.sigillata)的遺傳多樣性，低于王滑等(He=0.617[26]；He=0.678[29])，徐永杰等[10](He=0.657；I= 1.324)采用相同分子標記技術對核桃群體的遺傳多樣性研究結果。可見，迪慶核桃種質資源的遺傳多樣性處于中等水平。

評估一個樹種的遺傳多樣性對于這個樹種的基因保存和優(yōu)樹選擇非常重要[30-31]。一個物種遺傳多樣性和它的生活史和生態(tài)特征密切相關，通常稀有種、特有種、分布范圍狹窄的物種具有較低的遺傳多樣性，廣布、異交、動物傳播種子的物種會有較高的遺傳多樣性[32]。其次，繁育系統(tǒng)、遺傳漂變、基因突變、基因流等內部因素，環(huán)境變化、人為干擾等外部因素對一個物種的遺傳多樣性水平及分布格局有很大影響[33]。本研究的對象深紋核桃是我國特有種，在云南分布廣泛，全省127個縣海拔850 ～2 900 m范圍內均有栽培和分布[34-35]。此外，迪慶州具有垂直氣候和立體生態(tài)環(huán)境，再加之核桃的異花授粉，實生后代遺傳基礎多樣、變異豐富，以上諸多因素導致了該區(qū)域核桃種質資源的遺傳多樣性水平較高。然而，生境的片段化以及其他諸如種質交換、良種推廣種植、野生資源砍伐等人為干擾又降低了種質的遺傳多樣性水平。其中生境的片段化會減小有效種群規(guī)模，降低物種的適應能力，引起某些等位基因的消失，造成群體遺傳多樣性的喪失[36]，同時，有效種群規(guī)模的下降會增加種群的近交頻率，進而降低物種的遺傳多樣性及生產能力[37]。本研究分析的18個位點中僅有JSI-63位點的近交系數(shù)小于0(FIS=-0.168 5)，其他位點的近交系數(shù)均大于0，雜合子不足，數(shù)據(jù)表明迪慶州核桃種質資源群體內存在近親繁殖，缺乏足夠的雜合子(Ho= 0.467，He= 0.598，Ho

遺傳分化系數(shù)(FST)可以很好地反映群體的遺傳結構[32]。迪慶州3個核桃群體的遺傳分化系數(shù)FST=0.065 2，數(shù)據(jù)表明遺傳變異主要來自群體內的個體間。此分化系數(shù)高于Victory E 等采用SSR分子標記對黑核桃居群的研究結果(FST=0.017)[38]，低于Wang H等采用SSR標記對西藏核桃居群(FST=0.103)和泡核桃居群(FST=0.111)的研究結果[11]，低于王滑等對中國8個核桃居群(FST=0.196)的研究結果[26]，比較結果表明迪慶州核桃群體間的遺傳分化水平較低。

基因流(Nm)是影響群體間遺傳變異程度的重要因素[20]，一般來說，大的基因流可以阻止群體間的遺傳分化，因此基因流大的物種，群體間的遺傳分化較小[39]。Hamrick等研究結果，當Nm>1時，基因流就足以抵制遺傳漂變的作用，阻止群體間的分化；當Nm<1時，遺傳漂變便會導致群體間的遺傳分化[40]。迪慶州3個核桃群體Nm的平均值為4.266 3(Nm>1)，表明基因交流抵制了遺傳漂變的作用，降低群體的遺傳分化水平，這與陳良華等對四川核桃資源的遺傳多樣性研究結果相似[41]。Nm一方面與物種的繁殖方式、地理分布有關，另一方面與環(huán)境變化和人為活動密切相關。作為一種非常重要的經濟林樹種，核桃盡管以異交為主，但其風媒傳粉、種子或嫁接繁殖、人為實生選種以及種質交換等因素都強化了群體間的基因交流，這些應該是群體遺傳分化較低的主要原因。

基于遺傳距離的UPGMA聚類顯示迪慶州的3個核桃群體，維西群體和香格里拉群體間的遺傳距離最小，在遺傳距離0.13處聚為一組；德欽群體和維西群體的遺傳距離最大，另外成為單獨的一組。STRUCTURE分析將161份資源分成3個類群，類群間存在一定的遺傳混雜和基因交流，但也存在較為明顯的分化，其中維西和香格里拉群體間的分化較小，德欽群體與二者的分化相對較大，與UPGMA聚類結果相同。德欽核桃群體海拔為1 992～2 750 m，維西群體1 450～2 300 m，香格里拉群體1 680～2 560 m，德欽核桃群體相對于其他2個群體資源分布的海拔較高；其地理位置與深紋核桃的另一個主要分布區(qū)西藏相鄰，與西藏深紋核桃種質產生基因交流，以上因素有可能是導致3個核桃群體的遺傳結構和聚類結果的主要原因。

遺傳多樣性是資源利用的基礎，本研究揭示了迪慶州深紋核桃種質資源中等水平的遺傳多樣性，具有進一步選育利用的價值和潛力。3個群體中，維西群體的遺傳多樣性相對較高，開展核桃資源選育和保護工作時，維西應作為重點選擇群體，德欽群體分布海拔較高，可作為高海拔特征優(yōu)株的選擇群體。此外，因迪慶州深紋核桃群體間的遺傳分化水平較低，應側重于群體內單株的選擇。