袁 明，汪雯雯，王世宣，周 婷

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430030)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs)是一種雌激素依賴性婦科良性疾病，主要臨床表現(xiàn)為痛經(jīng)、慢性盆腔痛及繼發(fā)性不孕等。腹腔鏡檢查是診斷EMs的金標(biāo)準(zhǔn)[1]，但操作本身的創(chuàng)傷性及高額成本阻礙了其廣泛運(yùn)用。此外，僅70%～75%的腹腔鏡下直視病灶被組織學(xué)證實(shí)[2]。影像學(xué)診斷及血液標(biāo)記物(如CA125)對(duì)EMs的特異度及靈敏度有限。因此，研究EMs診斷的無創(chuàng)、特異性生物標(biāo)記是目前亟待解決的難題。小分子RNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度在19～25個(gè)核苷酸之間的非編碼小RNA，通過抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或降解靶基因mRNA來發(fā)揮作用。外周血循環(huán)中的miRNA具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及組織特異特性，其異常表達(dá)與特定的疾病相關(guān)。本研究通過驗(yàn)證特定miRNA在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥(ovarian endometriosis,OEMs)患者血漿中的表達(dá)水平，以期找到內(nèi)異癥診斷及疾病預(yù)后評(píng)估的有效手段。

1 資料與方法

1.1 臨床資料及標(biāo)本采集 收集2010年1月1日至2011年12月31日在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院因卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫行手術(shù)治療的患者(15～49歲)56例，同期因婦科良性疾病(子宮平滑肌瘤17例，不孕癥23例)住院行手術(shù)治療的患者40例。OEMs患者中32例在術(shù)后20個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)，24例在術(shù)后30個(gè)月的隨訪期內(nèi)均未見復(fù)發(fā)。研究對(duì)象的納入及排除標(biāo)準(zhǔn),OEMs患者的復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)及隨訪情況見前期研究[3-4]。OEMs患者的全血樣本均于術(shù)前采集，臨床資料及臨床標(biāo)本的采集工作經(jīng)華中科技大學(xué)倫理委員會(huì)討論并通過。

1.2 主要試劑與器材 RNA提取試劑TRIzol(Invitrogen公司)；ReverTra Ace qPCR RT Kit(TaKaRa公司)；SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司)；miRNA逆轉(zhuǎn)錄引物、檢測(cè)引物(廣州銳博公司)；RNeasy Plus Micro Kit(QIAGEN公司)。ABI PRISM 7000 Sequence Detection System，Real-time PCR(BIO-RAD公司)；NanoDrop 2000c(Thermo公司)。

1.3 提取各組血樣中總RNA及RT-qPCR檢測(cè) -80℃冰箱中取出血漿，37℃水浴鍋中快速溶解，置于冰上。取200μl血漿，按QIAamp?miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒，提取總RNA；使用NanoDrop 2000c檢測(cè)RNA的純度和濃度，-80℃保存?zhèn)溆?。?0ng總RNA反轉(zhuǎn)錄為穩(wěn)定的cDNA，提取的總RNA不足50ng時(shí)，取最大上樣量進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在miRBase database上獲取要擴(kuò)增的miRNA序列，并設(shè)計(jì)引物。RT-qPCR反應(yīng)條件：95℃ 1min；40個(gè)循環(huán)，95℃變性15s，60℃退火45s及72℃延伸30s。最后95℃ 15s，60℃ 15s，95℃ 15s收集熒光。U6作內(nèi)參，非內(nèi)異癥人群作為對(duì)照，2-ΔΔct方法計(jì)算各miRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 納入人群臨床資料 OEMs復(fù)發(fā)組、OEMs未復(fù)發(fā)組及非內(nèi)異癥對(duì)照組的術(shù)時(shí)年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；OEMs復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組的rAFS評(píng)分及分級(jí)、術(shù)后受孕、術(shù)時(shí)卵巢囊腫最大直徑比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 OEMs復(fù)發(fā)組、OEMs未復(fù)發(fā)組及非內(nèi)異癥對(duì)照組患者的一般資料比較

2.2 RT-qPCR檢測(cè)miRNA表達(dá) 與非內(nèi)異癥對(duì)照組相比，OEMs患者中miRNA-20a、miRNA-141及miRNA-17-5p表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，miRNA-199a表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與未復(fù)發(fā)組比較，復(fù)發(fā)組中miRNA-20a及miRNA-17-5p表達(dá)下調(diào)，miRNA-199a表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)發(fā)組及未復(fù)發(fā)組中miR-141表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 OEMs復(fù)發(fā)組、OEMs未復(fù)發(fā)組及非內(nèi)異癥對(duì)照組人群中miRNA的表達(dá)水平

2.3 ROC曲線分析各指標(biāo)檢測(cè)效能 ROC曲線分析表明，血漿中miRNA-20a、miRNA-17-5p及miRNA-199a均可作為分辨OEMs復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)病例的有效生物指標(biāo)。miRNA-20a、miRNA-17-5p及miRNA-199a的AUC分別為0.83(95%CI為0.741～0.919)、0.76(95%CI為0.641～0.892)、0.71(95%CI為0.583～0.831)(圖2)。

圖2 ROC曲線分析miRNA-20a、miRNA-17-5p及miRNA-199a的檢測(cè)效能

3 討 論

EMs是婦科常見良性疾病，但具有惡性腫瘤的生物學(xué)行為。由于EMs患者的非特異性癥狀,且缺乏無創(chuàng)檢測(cè)手段，導(dǎo)致起病和診斷之間存在很長(zhǎng)的滯后期。EMs的無創(chuàng)診斷有助于疾病的早期發(fā)現(xiàn)和治療，提高生活質(zhì)量并降低疾病相關(guān)費(fèi)用。因此，其被世界子宮內(nèi)膜異位癥學(xué)會(huì)和世界子宮內(nèi)膜異位癥研究基金會(huì)選為優(yōu)先研究項(xiàng)目[5]。外周循環(huán)中的miRNAs表達(dá)穩(wěn)定，檢測(cè)手段成熟[6]，使其成為EMs無創(chuàng)診斷研究的熱點(diǎn)。目前，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)特定的miRNA通過調(diào)節(jié)廣泛的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與內(nèi)異癥的發(fā)病及進(jìn)展，包括炎性作用、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)的重塑以及血管形成等[7]。此外，大量研究表明,EMs組和非EMs對(duì)照組循環(huán)中miRNA表達(dá)存在差異，但這些研究結(jié)果不一致[8]。本研究篩選并驗(yàn)證可用于EMs的無創(chuàng)診斷的血漿miRNAs，以期建立EMs的診斷及預(yù)后模型，為臨床決策提供新的思路。

本研究發(fā)現(xiàn)，血漿中miRNA-20a、miRNA-17-5p及miRNA-199a可作為識(shí)別OEMs復(fù)發(fā)的潛在生物標(biāo)記物。RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與非內(nèi)異癥對(duì)照組相比，OEMs組患者血漿中miRNA-20a、miRNA-141及miRNA-17-5p表達(dá)顯著降低，而miRNA-199a表達(dá)顯著升高；與OEMs未復(fù)發(fā)組相比，復(fù)發(fā)組血漿中miRNA-20a及miRNA-17-5p表達(dá)顯著降低，miRNA-199a表達(dá)則顯著升高。采用ROC曲線分析各指標(biāo)識(shí)別復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組的效能，發(fā)現(xiàn)miRNA-20a、miRNA-199a及miRNA-17-5p的AUC分別為0.83(95%CI為0.741～0.919)、0.76(95%CI為0.641～0.892]、0.71(95%CI為0.583～0.831)。本研究結(jié)果為內(nèi)異癥的診斷及預(yù)后評(píng)估提供了新的思路。

本研究顯示，內(nèi)異癥患者血漿中miRNA-20a及miRNA-17-5p表達(dá)顯著降低，與在OEMs未復(fù)發(fā)組的表達(dá)趨勢(shì)相同。miRNA-20a與miRNA-17-5p表達(dá)下調(diào)減弱了對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用，進(jìn)而上調(diào)相應(yīng)靶基因表達(dá)。上調(diào)抗凋亡蛋白BCL2及細(xì)胞周期抑制因子CDKN1A，導(dǎo)致內(nèi)異癥細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)、凋亡減弱[9-10]；上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β及白細(xì)胞介素8(IL-8),可導(dǎo)致內(nèi)膜異位灶的炎性環(huán)境并促進(jìn)組織的重塑。此外，miRNA-20a及miRNA-17-5p下調(diào)還可促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)，導(dǎo)致內(nèi)膜異位灶新生血管的形成[11-12]。

有關(guān)miR-199a在EMs中的相關(guān)功能已有文獻(xiàn)報(bào)道。Dai等[13-14]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-199a表達(dá)可減弱子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的粘連、轉(zhuǎn)移及侵襲能力；miR-199a靶向作用于間質(zhì)細(xì)胞的Ikappa B激酶β(IKKβ)，進(jìn)而抑制核因子κB(NK-κB)信號(hào)通路的激活，減少間質(zhì)細(xì)胞IL-8的產(chǎn)生及分泌。Hsu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a通過直接調(diào)控子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞中VEGFA的表達(dá)，調(diào)控子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)能力及血管形成，促進(jìn)EMs發(fā)病。最新研究發(fā)現(xiàn),miR-199a-5p可通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，靶向作用于ZEB1抑制卵巢異位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[16]。這些研究均發(fā)現(xiàn),miR-199a在內(nèi)異癥患者異位病灶中顯著低表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-199a在內(nèi)異癥患者血漿中的表達(dá)顯著升高，與現(xiàn)有文獻(xiàn)相符[17]。miRNA-199a在患者血漿及病灶中的表達(dá)不一致，可能與小分子RNA的來源不同或檢測(cè)過程中使用的內(nèi)參不同相關(guān)。因此，在今后研究中擴(kuò)大樣本量，并利用循環(huán)中大量且不受疾病狀態(tài)影響的小分子RNA作為內(nèi)參，產(chǎn)生可重復(fù)的結(jié)果，以增強(qiáng)miRNAs的診斷價(jià)值。

miR-200家族由miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-141組成，通過調(diào)控EMT促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。研究表明，EMT及MET過程可能參與了盆腔EMs的疾病過程[18]，推測(cè)miR-200家族可能通過調(diào)控EMT、促進(jìn)細(xì)胞遷移參與內(nèi)異癥的發(fā)病過程。Teague等[19]研究指出，與內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜相比，miR-200家族在異位子宮內(nèi)膜中下調(diào)，而miR-200b在子宮內(nèi)膜異位囊腫中的表達(dá)低于正常子宮內(nèi)膜；此外，miR-200c在子宮平滑肌瘤患者中表達(dá)異常，且可能通過調(diào)控ZEBs、VEGFA、TIMP2和FBLN5發(fā)揮作用。miR-141作為miR-200家族的一員，在EMs患者異位病灶中表達(dá)顯著降低，miR-141通過調(diào)控TGF-β1/SMAD2信號(hào)通路，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移能力，參與EMs的疾病進(jìn)展[20]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，miR-141在內(nèi)異癥患者血漿中的表達(dá)顯著降低，與現(xiàn)有文獻(xiàn)相符，但未發(fā)現(xiàn)miR-141在OEMs復(fù)發(fā)組及未復(fù)發(fā)組之間存在顯著差異，可能與研究樣本量小、血樣采集時(shí)間不同等因素相關(guān)。

綜上所述，EMs患者血漿中miRNA-20a及miRNA-17-5p表達(dá)顯著降低，且卵巢內(nèi)異癥復(fù)發(fā)人群較未復(fù)發(fā)人群顯著表達(dá)；而miR-199a在內(nèi)異癥患者及內(nèi)異癥復(fù)發(fā)人群中顯著高表達(dá)。本研究與已有研究結(jié)果部分存有爭(zhēng)議，可能是由于研究設(shè)計(jì)、樣本類型及對(duì)照人群不同相關(guān)。由于研究人群樣本量較小，隨訪時(shí)間有限，本研究結(jié)果需后續(xù)進(jìn)一步研究，但血漿中特異的miRNA檢測(cè)為內(nèi)異癥的診斷及預(yù)后評(píng)估提供了新的思路。