白 潔,紀(jì)文靜,舍 玲,努爾麥麥提·葉爾遜

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科,新疆 烏魯木齊,830028)

幽門螺桿菌(Hp)是定植于胃黏膜的一種革蘭氏陰性桿菌，與胃炎、胃潰瘍的關(guān)系密切，研究[1]發(fā)現(xiàn)其與胃癌有關(guān)，是導(dǎo)致胃黏膜癌變的主要原因。自噬是維持細胞穩(wěn)定的重要方式，在介導(dǎo)機體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細胞正常生長和分化、細胞損傷和修復(fù)等病理生理活動中發(fā)揮重要的作用，但過度自噬會對細胞造成損害[2]。研究[3]表明,Hp可通過自噬途徑損傷胃黏膜，誘導(dǎo)慢性炎癥，進而導(dǎo)致癌變。凋亡是細胞在相關(guān)基因的調(diào)控下發(fā)生的正常死亡過程。研究[4]表明,Hp VacA可影響細胞線粒體膜點位，誘導(dǎo)細胞凋亡。研究[5]發(fā)現(xiàn),Hp(+)胃黏膜細胞的凋亡發(fā)生率明顯高于Hp(-)細胞。蝦青素是天然存在的類胡蘿卜素，具有抗氧化、抗炎癥和抗腫瘤等功效，已成為研究的熱點。馬于林等[6]研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素可通過抑制氧化應(yīng)激來抑制細胞凋亡。本研究通過構(gòu)建Hp感染的胃上皮細胞株AGS細胞，加入不同濃度的蝦青素，觀察細胞自噬及凋亡的情況，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細胞株及儀器

人胃上皮細胞株AGS細胞(上海生命科學(xué)研究所); 蝦青素(純度>98%，長沙上禾生物科技有限公司); Hp標(biāo)準(zhǔn)株 NCTC11637、SS1(中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所); Ham′s F12培養(yǎng)液、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基(Sigma公司，美國); 胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶(Biosciences,美國); 兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、LC3-Ⅰ、Beclin1、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、β-actin多克隆一抗、鼠抗兔單克隆二抗、FITC標(biāo)記鼠抗兔抗體(Sigma公司，美國); Trizol試劑(江蘇碧云天科技有限公司); LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1、Bcl-2、Bax及DADPH引物序列(上海生工有限公司); RNA提取試劑盒、PCR試劑盒(武漢博士德生物公司); 白細胞介素-17(IL-17)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(南京奧尼多福公司); TUNEL原位凋亡細胞檢測試劑盒、DAPI染色試劑盒(BioVision公司，美國); 酶標(biāo)儀、倒置熒光顯微鏡(上海儀電分析儀器有限公司); ABI 7900PCR擴增儀(上海儀電分析儀器有限公司); Trans Blot 轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像儀(上海儀電分析儀器有限公司); 凝膠成像系統(tǒng)(UVP bioimaging systems，美國)。

1.2 細胞、Hp培養(yǎng)

含10%胎牛血清(FBS)和青霉素、鏈霉素各100 U/L的Ham′s F12培養(yǎng)基培養(yǎng)AGS細胞，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶后，用0.25%胰酶消化，制備單細胞懸液，使用血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基、傳代。

吸取50 μL Hp菌種，均勻接種到哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基中，放入37 ℃下10%CO2、5%O2、85%N2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h。

1.3 抑菌試驗

用培養(yǎng)液配成10 μmol/L的蝦青素。在24孔板中加入10 μL Hp菌懸液(109cfu/mL)以及990 μL蝦青素，空白對照組加入不含藥物的培養(yǎng)液[含0.1%二甲基亞砜(DMSO)、10%FBS的培養(yǎng)液]和菌懸液，陽性對照組則加入含100 μg/mL阿莫西林和50 μg/mL克拉霉素混合抗生素的培養(yǎng)液和Hp菌懸液。37 ℃微需氧條件下培養(yǎng)24 h后，適當(dāng)稀釋，取50 μL轉(zhuǎn)至哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后計數(shù)菌落。

1.4 Hp感染AGS細胞的方法及分組

選取第3代細胞,0.25%胰酶消化，調(diào)整濃度為1×106/L的單細胞懸液，接種于6孔板，每組設(shè)置5個復(fù)孔。Hp菌種培養(yǎng)24 h后，測定細菌濃度，更換新鮮培養(yǎng)基，并按照Hp菌落: 細胞數(shù)=100∶1加入Hp菌懸液,37 ℃、5% CO2共培養(yǎng)。更換培養(yǎng)液，保證每孔中培養(yǎng)液為2.0 mL,將不同濃度的蝦青素0.5 mL加入到6孔板中，對照組(蝦青素0 μmol/L,DMSO代替),10 μmol/L組(蝦青素10 μmol/L),20 μmol/L組(蝦青素20 μmol/L),50 μmol/L組(蝦青素50 μmol/L)。細胞繼續(xù)培養(yǎng)96 h,用于后續(xù)實驗。

1.5 免疫熒光檢測Hp感染AGS細胞

取Hp感染的AGS細胞，去培養(yǎng)液,PBS沖洗,3%多聚甲醛孵育10 min,PBS洗滌，用1%牛血清白蛋白(BSA)、22.52 mg/mL甘氨酸的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)孵育細胞30 min以封閉抗體,PBS洗滌，加入外膜蛋白(OMP)單克隆一抗孵育4 ℃室溫過夜,PBS洗滌，與相應(yīng)熒光標(biāo)記二抗反應(yīng),PBS洗滌，加入DAPI,37 ℃孵育15 min,棄染色液，甲醇洗滌; 加入甘油，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 實時熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測細胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1、Bcl-2、Bax mRNA表達

對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化，離心。加入等體積TRIzol試劑，根據(jù)試劑盒說明書提取總RNA,溶于20 μL二乙基焦碳酸酯(DEPC)水，取1 μL加入79 μL DEPC水檢測純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，樣品總RNA 1 μg,隨機引物或oligo(dT)18-20為100 pmol,脫氧核苷三磷酸(每種dNTP各10 mmol/L) 1 μL,反轉(zhuǎn)錄緩沖液(5×) 4 μL,RNase抑制劑 (20～40 U/μL) 1 μL,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 20 U,DEPC處理水補至20 μL,目標(biāo)引物序列見表1。根據(jù)試劑盒說明書進行PCR擴增: cDNA 2 μL,上、下引物各3 μL,Taq聚合酶0.5 μL,總體積共25 μL,反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為92 ℃ 20 s、96 ℃ 2 s、85 ℃ 20 s、80 ℃ 6 s,共40個循環(huán)。構(gòu)建溶解曲線。采用2-△△Ct法計算目標(biāo)引物mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 Western blot法檢測LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1、Bcl-2、Bax蛋白的表達

細胞經(jīng)胰酶消化,40 ℃下1 500轉(zhuǎn)/min離心5 min,去上清，超聲波破核，離心，取上清液。配膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、切膜，封閉液封閉1 h,逐次LC3-Ⅱ(1∶500)、LC3-Ⅰ(1∶500)、Beclin1(1∶500)、Bcl-2(1∶100)、Bax(1∶100)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶100)。Bio-Rad成像儀曝光成像,Image Lab Software測定光密度，以目標(biāo)蛋白與β-actin條帶光密度值比值表示相對表達量。

1.8 TUNEL實驗及ELISA檢測IL-17濃度

取Hp感染的AGS細胞，去除培養(yǎng)液,PBS沖洗,3%多聚甲醛孵育10 min,PBS洗滌，加入適量凋亡檢測液,37 ℃孵育60 min,PBS洗滌，加入DAPI室溫避光孵育8 min,PBS沖洗，加抗淬滅劑，激光共聚焦顯微鏡下觀察，計算凋亡率。細胞核呈藍色，凋亡細胞呈綠色。

取各組AGS細胞,3 000轉(zhuǎn)/min離心10 min,收集細胞上清,ELISA檢測IL-17濃度。具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進行。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 Hp感染AGS細胞

Hp在AGS細胞質(zhì)中彌散分布，進行自我復(fù)制，提示Hp感染AGS細胞成功，并在細胞內(nèi)增殖。見圖1。

A: 細胞核DAPI染色(藍色); B: Hp OMP蛋白染色(綠色); C: A、B合并圖; D: Hp在AGS細胞內(nèi)大量增殖的完整細胞圖。圖1 激光共聚焦觀察Hp感染AGS細胞(放大倍數(shù)40倍)

2.2 蝦青素對Hp增殖的影響

與對照組比較，蝦青素對Hp增殖起到顯著的抑制作用(P<0.05),但弱于抗生素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

與對照組比較, ?P<0.05; 與抗生素組比較, #P<0.05。圖2 不同藥物對Hp增殖的影響

2.3 蝦青素對Hp感染AGS細胞凋亡的抑制作用

蝦青素10 μmol/L組細胞凋亡率為(1.11±0.03)%,20 μmol/L組為(0.35±0.04)%,50 μmol/L組為(0.22±0.03)%,均低于對照組的(2.14±0.04)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。隨著蝦青素濃度的增高，細胞凋亡率逐漸下降，提示蝦青素對Hp感染AGS細胞凋亡的抑制作用具有濃度依賴性。見圖3、4。

2.4 蝦青素對Hp感染AGS細胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1、Bcl-2、Bax蛋白及mRNA的影響

蝦青素10、20、50 μmol/L組細胞Bcl-2蛋白表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),且隨著濃度的增高，表達量逐漸升高。蝦青素10、20、50 μmol/L組細胞Beclin1、LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)、Bax表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),且隨著濃度的增高，表達量逐漸下降。

藍色代表細胞核DAPI染色,綠色代表凋亡細胞染色。圖3 TUNEL染色檢測各組細胞的凋亡細胞數(shù)(放大倍數(shù)10倍)

與對照組比較, ??P<0.01。圖4 各組細胞的凋亡率比較

蝦青素10、20、50 μmol/L組細胞Bcl-2 mRNA表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),且隨著濃度的增高，表達量逐漸升高。蝦青素10、20、50 μmol/L組細胞Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bax mRNA表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),且隨著濃度的增高，表達量逐漸下降。見圖5、6。

2.5 蝦青素對Hp感染AGS細胞IL-17的影響

蝦青素10、20、50 μmol/L組IL-17含量依次為(102.12±21.92)、(91.02±11.23)、(72.23±12.34) pg/mL,均低于對照組的(123.84±14.39) pg/mL,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且隨著濃度的增高,IL-17含量逐漸下降，提示蝦青素對Hp感染AGS細胞的炎癥抑制作用具有濃度依賴性。

A: Western blot結(jié)果; B: 蛋白表達量; C: mRNA表達量。與對照組比較, ??P<0.01。圖5 各組Bcl-2、Bax蛋白、mRNA的表達

A: Western blot結(jié)果; B: 蛋白表達量; C: mRNA表達量。與對照組比較, ??P<0.01。圖6 各組Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白、mRNA的表達

3 討 論

近年來，隨著生物化學(xué)及提純分離方法的進步，越來越多的天然藥物獲得分離，蝦青素屬于類胡蘿卜素化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗凋亡等功效[7-10]。研究結(jié)果[11]顯示，蝦青素可激活過氧化物酶增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)及其下游靶基因過氧化氫酶，減輕Hp感染AGS細胞的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。凋亡和自噬是細胞死亡的2種途徑，但存在密不可分、相互作用的關(guān)系，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用[12]。

自噬是真核細胞維持細胞穩(wěn)定、提供能量的過程，人體多種疾病與自噬相關(guān)。研究[13]發(fā)現(xiàn)，自噬在胃黏膜細胞Hp感染導(dǎo)致癌變的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。自噬過程受到多種因子調(diào)控，其中自噬相關(guān)蛋白在自噬過程中發(fā)揮不可替代的作用。Beclin1蛋白是啟動自噬的重要蛋白，與PI3K形成結(jié)合體，調(diào)控Atg蛋白的位置，進而加速自噬體的形成[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中Hp感染與Beclin1表達有關(guān)，提示Hp可能通過自噬參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。LC3位于自噬泡膜，參與自噬體的合成，與自噬泡的數(shù)量呈正相關(guān)。LC3主要包括Ⅰ型和Ⅱ型,LC3-Ⅰ代表了自噬前狀態(tài)，發(fā)生自噬后,LC3-Ⅰ與自噬泡膜的PE結(jié)合形成LC3-Ⅱ[16]。LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ及Beclin1是與自噬密切相關(guān)的蛋白，在自噬體形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，可反映自噬活動，是研究自噬活動的特異性指標(biāo)[17]。本研究結(jié)果顯示，加入蝦青素后Hp感染AGS細胞Beclin1蛋白及mRNA表達量,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均降低，提示蝦青素抑制了細胞的自噬過程。Hp介導(dǎo)的細胞自噬機制復(fù)雜，目前認為與活性氧、炎癥因子的釋放密切相關(guān)，蝦青素作為一種天然化合物，具有抗炎、抗氧化的作用，因而可以有效抑制自噬過程。

細胞凋亡是細胞在一系列基因激活下進行的一種死亡過程，通過這種過程，人體可消除無功能或異常細胞。Hp感染細胞后，會誘發(fā)細胞啟動凋亡過程以清除被感染的細胞。TUNEL染色是最常用的一種凋亡研究方法，主要是通過特定的染料標(biāo)記凋亡細胞，從而區(qū)分凋亡、正常細胞[18]。本研究結(jié)果顯示，蝦青素能顯著降低Hp感染后AGS細胞TUNEL的陽性表達率。Bcl-2家族是調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，主要包括抗凋亡蛋白(Bcl-2)和促凋亡蛋白(Bax)。Bcl-2通過結(jié)合Bax蛋白，形成二聚體，使Bax蛋白處于失活狀態(tài)，導(dǎo)致細胞不能啟動凋亡途徑[19]。當(dāng)Bcl-2表達被抑制后，則與Bax分離，引起凋亡的發(fā)生。雷艷杰等[20]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中Bcl-2蛋白高表達，其含量與Hp感染呈正相關(guān)。蔣漫琦等[21]研究結(jié)果表明,Bcl-2蛋白在Hp感染的慢性萎縮性胃炎組織中高表達。本研究結(jié)果顯示，加入蝦青素后,Bcl-2蛋白含量增加,Bax蛋白含量降低，且抑制作用具有濃度依賴性，進一步說明了蝦青素可抑制Hp感染后AGS細胞的凋亡，且濃度越高，這種抑制性越強。岳亮等[22]研究結(jié)果顯示，蝦青素可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡。Hp感染細胞過程中會發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的自由基，而蝦青素具有抗氧化、清除自由基的功效，因而可以抑制細胞的凋亡過程。

IL-17是重要的促炎性細胞因子，其可誘導(dǎo)多種細胞釋放炎癥介質(zhì),IL-17不僅與炎性反應(yīng)密切相關(guān)，還與消化道惡性腫瘤等相關(guān)[23]。研究[24]表明,IL-17廣泛存在于乳腺癌、肝癌及胃癌等多種腫瘤中。IL-17具有促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用，同時腫瘤所處的微環(huán)境可直接誘導(dǎo) IL-17細胞因子。本研究結(jié)果顯示，加入蝦青素后IL-17含量降低，且抑制作用具有濃度依賴性，進一步說明了蝦青素可抑制Hp感染后炎癥反應(yīng)，且濃度越高，這種抑制性越強。

綜上所述，蝦青素可抑制Hp感染后AGS細胞的凋亡及自噬過程，具有濃度依賴性，為Hp的治療及胃癌的防治提供了新的思路。但本研究只是初步研究，具體機制有待深入、全面的探索。