王玉輝， 李智淵， 劉 慧， 沈 今， 朱珍琴， 張 金， 徐德立

(曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，273165，山東省曲阜市)

動物的免疫系統(tǒng)在防御環(huán)境中的病原體如病毒、細(xì)菌和真菌等方面發(fā)揮著重要作用[1-3].動物的免疫能力受多種激素的影響，其中腎上腺分泌的糖皮質(zhì)激素是通過內(nèi)分泌途徑調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要激素[4].應(yīng)激環(huán)境下腎上腺糖皮質(zhì)激素的分泌通常會增加，而糖皮質(zhì)激素等應(yīng)激激素往往會抑制動物的免疫反應(yīng)[4-7].

研究發(fā)現(xiàn)，腎上腺切除可以減弱SD(Sprague-Dawley)大鼠的先天免疫力，同時在創(chuàng)傷中表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)和組織損傷[8].腎上腺切除后，瑞士白化小鼠(Swissalbino)的血液學(xué)參數(shù)，如血紅蛋白濃度，紅細(xì)胞壓積值，總白細(xì)胞計數(shù)增加[9].腎上腺切除后，Balb/c大鼠體液免疫指標(biāo)如IL-2、胸腺系數(shù)、血清IgG含量明顯升高[10].動物的應(yīng)激反應(yīng)主要由糖皮質(zhì)激素如皮質(zhì)酮介導(dǎo)，以對抗具有挑戰(zhàn)性的環(huán)境條件[11].例如，部分皮質(zhì)酮耗竭的大鼠顯示出降低的細(xì)胞內(nèi)殺傷能力[9]，補(bǔ)充外源性皮質(zhì)酮使小鼠胸腺重量減輕90%，而橙腹草原田鼠(Microtusochrogaster)胸腺降低37%[12-13].急性應(yīng)激使雄性大鼠血漿皮質(zhì)酮升高，先天免疫功能下降[14].皮質(zhì)酮還能降低雛雞胸腺和脾臟的相對重量[15].補(bǔ)充皮質(zhì)酮會降低鳥類的體液免疫，但不影響其細(xì)胞免疫能力[16-19].皮質(zhì)酮也會抑制野生鳥類如褐頭牛鸝(Molothrusater)、家麻雀(Passerdomesticus)的先天免疫活性，并且增加感染風(fēng)險[20-22].其他研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)酮處理對雄性大鼠的PHA反應(yīng)影響較小，對雌性大鼠的PHA反應(yīng)沒有顯著影響[23].皮質(zhì)酮對免疫反應(yīng)的影響可能與其劑量有關(guān)，例如，小劑量皮質(zhì)酮或腎上腺素可顯著增強(qiáng)SD大鼠反映細(xì)胞免疫能力的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(Delayed Type Hypersensitivity,DTH)，而大劑量皮質(zhì)酮則顯著抑制皮膚的DTH[24].因此對皮質(zhì)酮的研究還需在多個物種中展開.

細(xì)胞免疫是動物適應(yīng)性免疫的組成部分，主要防御細(xì)胞內(nèi)病原體如病毒等，常用植物血凝素反應(yīng)進(jìn)行評估[25-27].免疫器官如胸腺和脾臟也可以反映動物的免疫能力，通常情況下，免疫器官越重，免疫能力越強(qiáng)[28-30].

為了研究腎上腺在動物免疫功能中的作用，我們將雌性昆明小鼠分為腎上腺假切除組和腎上腺切除組，腎上腺切除后可能會導(dǎo)致皮質(zhì)酮分泌減少，因此，我們預(yù)測，腎上腺切除后昆明小鼠細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)，免疫器官如脾臟和胸腺的重量會增加.

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

本實驗所用的動物為雌性昆明小鼠，年齡為3月齡，購自濟(jì)南朋悅動物有限公司，小鼠單籠(規(guī)格：30 cm×15 cm×20 cm)飼養(yǎng)，自由取食和飲水，溫度為23±1 ℃，光周期為12L:12D(Light:Dark)，飼料是標(biāo)準(zhǔn)的大小鼠飼料(北京科奧協(xié)力飼料有限公司)，墊料為鋸末，昆明小鼠飼養(yǎng)至體重穩(wěn)定后，將14只昆明小鼠隨機(jī)分為腎上腺假切除組(Adrenal sham removed group,ASR,n=8)和腎上腺切除組(Adrenal removed group,AR,n=6)，每3天測定一次體重(精確到0.1 g)，腎上腺切除后第34天處死動物.

1.2 腎上腺切除

實驗用具如手術(shù)、剪刀、縫合針線、鑷子等洗凈干燥后進(jìn)行高溫滅菌，實驗還需要酒精、麻醉劑、手術(shù)板等實驗用品.昆明小鼠用0.5%的戊巴比妥鈉采用腹腔注射方式進(jìn)行麻醉，然后在手術(shù)板上固定好昆明小鼠.用75%酒精對小鼠的腹中部處進(jìn)行消毒，再用酒精棉簽對手術(shù)縫合針、剪刀以及鑷子消毒.用手術(shù)剪刀在腹中部靠近腎臟處剪開一小塊皮膚，迅速找出腎臟，用鑷子小心將腎臟露出，找到腎上腺，小心地切除.檢查好之后，立刻用手術(shù)縫合針將剪開部位小心縫合，注意速度快并且要將傷口縫合緊密，用酒精擦拭傷口消毒，然后把動物放回鼠盒中，讓其身體恢復(fù)一周.

1.3 細(xì)胞免疫

腎上腺切除后第31天，測定PHA反應(yīng).測定方法為用酒精對小鼠左后足足墊處進(jìn)行消毒，用數(shù)顯電子測微尺(精確度為± 0.01 mm)測定小鼠左后足足墊處的厚度，之后，在小鼠左后足足墊中央部分注射0.03 mL PHA溶液(將25 mg PHA溶于7.5 mL無菌磷酸緩沖液)，在注射之后6 h、12 h、24 h、48 h，分別測定小鼠左后足足墊中心處的厚度，每只動物每個時間點測量6次，計算平均值.PHA反應(yīng)的計算方法為：(注射PHA后的足墊平均厚度-注射PHA前的足墊平均厚度)/注射PHA前的足墊平均厚度[26-27].

1.4 身體成分與器官

腎上腺切除后第34天，將昆明小鼠進(jìn)行頸部取血處死，然后根據(jù)文獻(xiàn)中的方法解剖小鼠[7].具體來說，用手術(shù)剪將小鼠腹腔和胸腔小心剪開，然后將心臟、胸腺、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟、腎上腺、性腺等小心地取出，將器官周圍的結(jié)締組織小心地剔除，器官表面的液體等用吸水紙吸干，用電子天平(0.0001 g)稱量.取出小鼠的消化道，將腸系膜脂肪(附著在消化道周圍的脂肪)取出，將消化道展開，仔細(xì)分辨出胃、盲腸、小腸以及結(jié)腸的位置，展開并測量消化道各部分的長度及重量，將消化道各部分縱向剖開，分離出消化道內(nèi)容物，用生理鹽水清洗后再次進(jìn)行稱重，即消化道鮮重.將小鼠腦和下丘腦取出稱重，并分離出肩胛間褐色脂肪組織(IBAT)、皮下脂肪、腹膜后脂肪，皮下脂肪、腹膜后脂肪和腸系膜脂肪總重為脂肪總重，皮下脂肪、腹膜后脂肪、腸系膜脂肪分別除以小鼠的脂肪總重即為每部分的脂肪含量[31-32].

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析.首先確定實驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，采用One-sample Kolmogorov-Simirnov test進(jìn)行檢驗，采用多因變量協(xié)方差方法(General Linear Model Multivariate)以體重為協(xié)變量分析器官鮮重，采用獨立樣本t-檢驗(Independent-samplest-test )分析小鼠的身體成分、PHA反應(yīng)，利用重復(fù)測量的方差分析(repeated measurement analysis)分析體重以及PHA反應(yīng)隨時間的變化，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，P<0.05表示統(tǒng)計學(xué)差異顯著，P<0.01表示統(tǒng)計學(xué)差異極顯著.

2 結(jié) 果

2.1 體重

在小鼠切除腎上腺前，對兩組小鼠進(jìn)行稱重，Day1(t=-0.329,df=12,P=0.748)，Day4(t=-0.55,df=12,P=0.592)，Day7(t=-0.444,df=12,P=0.665)，數(shù)據(jù)表明腎上腺切除組和腎上腺假切除組之間在體重方面無顯著差異，切除腎上腺后，切除腎上腺對Day15(t=0.541,df=12,P=0.598)到Day45(t=0.643,df=12,P=0.532)之間的體重均無顯著差異(圖1).體重隨處理時間顯著增加(F13,156=14.096,P<0.001)，而時間與組別無交互作用(F13, 156=0.920,P=0.534).腎上腺假切除組體重隨時間顯著增加(F13,91=14.341,P<0.001).腎上腺切除組體重也隨時間顯著增加(F13,65=3.816,P<0.001).

圖1 切除腎上腺對昆明小鼠體重的影響

2.2 身體成分

切除腎上腺對昆明小鼠的初始體重、終體重、胴體濕重、皮下脂肪及含量、腹膜后脂肪及含量、腸系膜脂肪及含量以及總脂重均無顯著差異(表1).

表1 切除腎上腺對昆明小鼠身體成分的影響

2.3 器官鮮重

切除腎上腺對昆明小鼠的腦、下丘腦、IBAT、心臟、肺臟、肝臟、腎臟、胃、小腸、盲腸、結(jié)腸長度及內(nèi)容物、總消化道長度均無顯著差異(表2).

表2 切除腎上腺對昆明小鼠器官鮮重的影響

2.4 免疫器官

切除腎上腺顯著增加了小鼠胸腺鮮重(F1,11=5.113,P=0.045)，但不影響脾臟鮮重(F1,11=0.113,P=0.743)(圖2 A,B)，小鼠的胸腺(r=0.072,P=0.807)和脾臟(r=0.029,P=0.920)與脂肪總重不具有相關(guān)性.

圖2 切除腎上腺對昆明小鼠胸腺(A)和脾臟(B)的影響，柱子上不同字母表示組間差異顯著

2.5 細(xì)胞免疫反應(yīng)

切除腎上腺對注射PHA后的6 h(t=-0.393,df=12,P=0.701)、12 h(t=1.234,df=12,P=0.241)、24 h(t=-1.586,df=12,P=0.142)、48 h(t=-1.708,df=12,P=0.116)均無顯著影響(圖3)，脂肪總重與注射PHA后的6 h(r=-0.384,P=0.175)、12 h(r=-0.078,P=0.791)、24 h(r=-0.228,P=0.434)、48 h(r=0.165,P=0.572)均不具有相關(guān)性.PHA反應(yīng)隨處理時間顯著降低(F3,36=37.493,P<0.001)，而時間與組別無交互作用(F3,36=2.281,P=0.096)，腎上腺假切除組PHA反應(yīng)隨時間顯著降低(F3,21=27.206,P<0.001)，腎上腺切除組PHA反應(yīng)也隨時間顯著降低(F3,15=14.379,P<0.001).

圖3 切除腎上腺對昆明小鼠PHA反應(yīng)的影響

3 討 論

腎上腺切除對昆明小鼠不同的免疫指標(biāo)影響不同，腎上腺切除后胸腺鮮重顯著增大，對脾臟鮮重和PHA反應(yīng)則沒有影響.

3.1 腎上腺切除對昆明小鼠體重、身體成分和器官的影響

切除腎上腺對昆明小鼠的體重沒有顯著影響，這與切除腎上腺的Waster大鼠體重下降的結(jié)果不同[33].不同的實驗方式，動物的種類、實驗條件以及處理方式的不同可能是造成這些差異的原因.本實驗中，切除腎上腺不影響昆明小鼠的皮下脂肪及含量、腹膜后脂肪及含量、腸系膜脂肪及含量、總脂肪重以及胴體濕重，切除腎上腺對大多數(shù)器官鮮重包括腦、肺臟、腎臟、心臟、小腸重量及長度、盲腸重量及長度、結(jié)腸重量及長度、消化道總長均無顯著影響.

3.2 腎上腺切除對昆明小鼠免疫功能的影響

切除腎上腺后顯著增加了胸腺鮮重，可能與腎上腺切除導(dǎo)致皮質(zhì)酮濃度降低，免疫功能抑制作用被解除有關(guān)，這與Balb/c小鼠、Waster大鼠的研究結(jié)果一致[10,34,35].此外，切除腎上腺均不影響6 h、12 h、24 h、48 h后的PHA反應(yīng)，前人研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充皮質(zhì)酮對雄性大鼠的PHA反應(yīng)影響較小，不影響雌性大鼠的PHA反應(yīng)[23]，不同濃度的皮質(zhì)酮補(bǔ)充對雄性斑馬雀(Pseudotropheuslombardoi)的PHA反應(yīng)沒有影響[36]，因此，切除腎上腺后皮質(zhì)酮濃度變化對PHA反應(yīng)影響較小.前人研究顯示，腎上腺切除可消除應(yīng)激引起的DTH增強(qiáng).急性給予腎上腺切除動物生理濃度的皮質(zhì)酮可增強(qiáng)皮膚DTH[24]，與假切除組相比，切除腎上腺的SD大鼠注射KLH(Keyhole-Limpet-Hemocyanin)后的IgG、IgM反應(yīng)降低，補(bǔ)充生理劑量的皮質(zhì)酮后的腎上腺切除大鼠部分恢復(fù)了抗KLH-IgM，但仍抑制了抗KLH-IgG[37].可見，切除腎上腺或補(bǔ)充皮質(zhì)酮對免疫功能的影響與檢測的免疫指標(biāo)、動物品種的不同有關(guān)，因此，切除腎上腺或補(bǔ)充皮質(zhì)酮對免疫功能的影響需要進(jìn)一步研究.

生物體的能量貯存是影響動物免疫能力強(qiáng)弱的重要因素之一.已經(jīng)證明，脂肪不僅可以為動物的生存提供能量，還是動物體內(nèi)重要的免疫器官和內(nèi)分泌器官[38-42].低能量儲備的動物比高能量儲備的動物分配更少的能量用于免疫防御.因此，體脂質(zhì)量的減少會損害免疫力[7,43,44].切除腎上腺不影響小鼠的皮下脂肪及含量、腹膜后脂肪及含量、腸系膜脂肪及含量、總脂肪重，脾臟鮮重和PHA反應(yīng)與總脂重不存在相關(guān)性，胸腺鮮重與總脂肪重也不存在相關(guān)性，表明胸腺鮮重的增加可能與脂肪無關(guān).

切除腎上腺后，皮質(zhì)酮分泌相應(yīng)減少，這可能是動物免疫功能增強(qiáng)的原因[45-46].皮質(zhì)酮是否介導(dǎo)了昆明小鼠的免疫能力的強(qiáng)弱，其內(nèi)在機(jī)制還需要進(jìn)一步研究.

總之，切除腎上腺對昆明小鼠不同的免疫指標(biāo)影響不同，胸腺鮮重顯著增加，細(xì)胞免疫和脾臟鮮重不受切除腎上腺影響，因此，切除腎上腺是否會導(dǎo)致血液皮質(zhì)酮濃度的降低進(jìn)而影響免疫功能，還需要進(jìn)一步研究.