孫東雷 卞能飛 王 幸 邢興華 沈 一 徐澤俊 齊玉軍 王曉軍，*

(1 江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 徐州 221131； 2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇 南京 210014)

花生(ArachishypogaeaL.)起源于熱帶美洲地區(qū)，對溫度尤為敏感。我國花生主產(chǎn)區(qū)為黃淮海地區(qū)，在花生春播期間，極易出現(xiàn)“倒春寒”天氣，對花生的萌發(fā)及出苗產(chǎn)生極大影響，帶來的經(jīng)濟(jì)損失不可估量。相比推遲播種期或覆蓋地膜等降低低溫危害的措施，研究不同花生品種的低溫耐性，篩選耐冷花生種質(zhì)是較為有效的途徑。

近年來，高油酸花生在我國的種植面積逐步擴(kuò)大，北方花生主產(chǎn)區(qū)正在進(jìn)行以高油酸品種為主體的第六次品種更新[1]。高油酸花生種子油酸含量大于等于75%[2]，相比普通花生，高油酸花生更有益于人體健康。高油酸花生制品能夠更好地保持風(fēng)味，延長貨架期。油酸含量是評價植物油品質(zhì)的重要指標(biāo)[2]。Norden等[3]在1987年首次報道了花生品種F435的油酸含量高達(dá)79.9%，從此開啟了美國高油酸花生育種進(jìn)程。國內(nèi)最早種植的高油酸花生品種為錦引花1號，為錦州農(nóng)業(yè)科學(xué)院引進(jìn)備案的高油酸花生品種，國內(nèi)首個自主創(chuàng)制的高油酸花生品種為花育32號[4]，從2002年至2018年底，我國共育成了54個高油酸花生品種[1]。低溫冷害是我國北方花生主產(chǎn)區(qū)春播的主要影響因子，開展對高油酸花生種質(zhì)資源耐冷性的綜合評價，篩選鑒定及應(yīng)用耐冷性強(qiáng)的高油酸花生種質(zhì)資源是應(yīng)對低溫冷害的主要途徑。

種子萌發(fā)期為植物生長中最脆弱，最關(guān)鍵的階段，包括吸脹、萌動及萌發(fā)3個階段[5]。依據(jù)主要限制因素選擇原則，冷浸發(fā)芽試驗可以作為花生種子低溫出苗能力強(qiáng)弱的檢驗方法[6]，而吸脹階段又是外部冷害對種子萌發(fā)影響最大的階段[7-8]。國內(nèi)學(xué)者普遍將2℃作為花生吸脹萌發(fā)期耐冷的鑒定溫度，并篩選出一批耐冷的花生種質(zhì)資源[5,7,9-12]。近年關(guān)于高油酸花生吸脹萌發(fā)期耐冷的報道集中在少數(shù)品種的研究上，常博文等[11]以2℃為處理溫度，以出苗率為標(biāo)準(zhǔn)篩選出了4個耐低溫的品種，其中2個是高油酸花生品種。陳昊等[5]篩選到的2個高油酸花生品種的相對發(fā)芽率接近耐冷品種的標(biāo)準(zhǔn)。張高華等[12]研究表明耐寒高油酸花生S53/S51種子2℃低溫浸泡后萌發(fā)率高于不耐寒高油酸花生品種HY661和L126。總體上，國內(nèi)關(guān)于高油酸花生種質(zhì)資源耐冷的研究相對缺乏。本研究擬以56份高油酸花生品種(系)為試驗材料，通過加權(quán)隸屬函數(shù)法、主成分分析及聚類分析，構(gòu)建高油酸花生耐冷性綜合評價體系，篩選耐冷性強(qiáng)的高油酸花生種質(zhì)資源，以期為高油酸花生種質(zhì)資源的評價、利用及研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究于2019年在江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室進(jìn)行。選用本單位最新培育和引進(jìn)的共計56份高油酸花生種質(zhì)資源作為試驗材料，種質(zhì)名稱、油酸含量、來源地及審(鑒)定、登記信息如表1所示。

表1 供試材料信息匯總

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 2018年對56份試驗材料進(jìn)行單位擴(kuò)繁種植，收獲并測定油酸食量，保證試驗材料油酸的純度和穩(wěn)定性，2019年繼續(xù)種植收獲用于低溫試驗。參照劉海坤等[13]的方法將高油酸花生種子種皮于通風(fēng)櫥進(jìn)行消毒，選取粒型一致、無霉變、成熟度好的種子，置于連接氯氣生成裝置的密閉容器中。氯氣消毒可降低花生種皮的污染破損率，提高試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。

56份高油酸花生種質(zhì)資源分為56個組別，每個組別分為處理組和對照組，每個組設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)選取飽滿無破損的滅菌種子30粒，依據(jù)劉海龍等[10]低溫冷浸發(fā)芽試驗方法。處理組將滅菌種子浸于2℃滅菌的雙蒸水中，浸種48 h后，置于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，轉(zhuǎn)移至25℃人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)芽試驗。對照組于25℃條件下浸種6 h，置于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，轉(zhuǎn)移至25℃人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)芽試驗。

1.2.2 測定方法 調(diào)查取樣：發(fā)芽試驗開始后24、48、72、96和120 h分別統(tǒng)計處理組和對照組的發(fā)芽數(shù)(胚根長度≥3 cm)、露白數(shù)(胚根突破種皮)[9]，120 h時統(tǒng)計測量培養(yǎng)皿中試驗材料的胚根長，子葉鮮重、胚(胚芽、胚根、胚軸)鮮重。

露白率(percentage of the number of seeds with radicals breaking through testa, PSWRBT)=(72 h露白的種子總粒數(shù)/供試的種子總粒數(shù))×100%[9]

(1)

發(fā)芽率(germination rate, GR)=(120 h發(fā)芽的種子總粒數(shù)/供試的種子總粒數(shù))×100%[14]

(2)

發(fā)芽勢(germination energy, GE)=(48 h發(fā)芽的種子總粒數(shù)/供試的種子總粒數(shù))×100%[14]

(3)

發(fā)芽指數(shù)(germination index, GI)=∑(Gt1/Dt1)

(4)

式中，Gt1表示不同時間下的發(fā)芽數(shù)，Dt1表示相對應(yīng)的發(fā)芽時間[15]。

露白指數(shù)(seeds with radicals breaking through testa index, SWRBTI)=∑(Gt2/Dt2)

(5)

式中，Gt2表示不同時間下的露白數(shù)，Dt2表示相對應(yīng)的露白時間[9]。

活力指數(shù)(vigor index, Ⅵ)=∑(Gt1/Dt1)×S

(6)

式中，S為發(fā)芽到120 h時胚根長度[16]。

平均發(fā)芽時間(mean germination time, MGT)=∑(dn)/∑n

(7)

式中，h為從培養(yǎng)之日起算的天數(shù)，n為各日種子的發(fā)芽數(shù)[17]。

萌發(fā)耐冷指數(shù)(germination cold tolerant index, GCTI)=(1.00)nd1+(0.80)nd2+(0.60)nd3+(0.40)nd4+(0.20)nd5

(8)

式中，nd1、nd2、nd3、nd4和nd5分別為24、48、96、120和144 h的種子發(fā)芽率，1.00、0.80、0.60、0.40、0.20分別為相應(yīng)發(fā)芽時間所賦予的耐冷系數(shù)[18-19]；

露白耐冷指數(shù)(seeds with radicals breaking through testa cold tolerant index, SWRBTCTI)=(1.00)nt1+(0.80)nt2+(0.60)nt3+(0.40)nt4+(0.20)nt5

(9)

式中，nt1、nt2、nt3、nt4和nt5分別為24、48、96、120和144 h的種子露白率，1.00、0.80、0.60、0.40、0.20分別為相應(yīng)露白時間所賦予的耐冷系數(shù)[18-19]。

1.2.3 耐冷性狀評價指標(biāo)計算 以相對值評價高油酸花生種質(zhì)資源萌發(fā)期的耐冷性，可避免種質(zhì)資源本身的差異對研究結(jié)果的影響。

性狀相對值(relative value of traits)=2℃冷脅迫性狀平均值/25℃對照性狀平均值[20]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究通過公式

Xij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

(10)

把56份高油酸花生種質(zhì)資源的11個耐冷性狀函數(shù)值定義在[0,1]區(qū)間內(nèi)，Xjmin、Xjmax分別為耐冷性狀指標(biāo)最小值和最大值，Xij表示種質(zhì)i在耐冷指標(biāo)j的測定值。耐冷指標(biāo)均方差系數(shù)(Vj)通過公式(11)計算所得

(11)

耐冷指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)Wj的計算公式

(12)

高油酸花生種質(zhì)耐冷綜合評價D值的計算公式：

(13)。

試驗采用Excel 2019對高油酸花生耐冷指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用SPSS 20.0分析高油酸花生耐冷指標(biāo)，主要包括描述統(tǒng)計、KMO檢驗、Bartlett’s檢驗、主成分分析、相關(guān)性分析及聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高油酸花生種質(zhì)萌發(fā)期耐冷系數(shù)的差異

露白率、發(fā)芽率分別反映了高油酸花生種子露白、發(fā)芽的多少，發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)分別反映了高油酸花生種子發(fā)芽的整齊性、綜合活力，平均發(fā)芽時間、萌發(fā)耐冷指數(shù)分別反映了高油酸花生種子發(fā)芽所需時間的長短、整個萌發(fā)期耐冷性的綜合表現(xiàn)。由表2可知，56份高油酸花生種質(zhì)資源調(diào)查性狀相對值差異明顯。11個耐冷指標(biāo)的平均變異系數(shù)為34.54%，相對發(fā)芽勢變異系數(shù)最大，變化幅度從0～58.00%，其次是相對活力指數(shù)和相對胚鮮重；相對平均發(fā)芽時間的變異系數(shù)最小，變化幅度從120.00%～208.54%。

表2 高油酸花生萌發(fā)期耐冷指標(biāo)的描述性統(tǒng)計

2.2 高油酸花生萌發(fā)期耐冷指標(biāo)的因子分析

2.2.1 KMO檢驗和Bartlett’s檢驗 在主成分因子分析前，利用SPSS對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行KMO檢驗和Bartlett’s球狀檢驗，檢驗結(jié)果如表3所示。KMO檢驗值0.775大于0.5，適合進(jìn)行因子分析[22]；Bartlett’s球狀檢驗結(jié)果為P<0.05，說明試驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布[22]。因此，本研究試驗數(shù)據(jù)適合做因子分析。

表3 KMO和Bartlett’s適合性檢驗

2.2.2 高油酸花生萌發(fā)期耐冷指標(biāo)的因子分析 由表4可知，前3個主成分的累計貢獻(xiàn)率達(dá)到了79.934%，能夠反映11個耐冷指標(biāo)的大部分信息，因此選取前3個主成分作為高油酸花生萌發(fā)期耐冷性評價指標(biāo)[23]。其中第1主成分的貢獻(xiàn)率最大，為58.207%，第2主成分的貢獻(xiàn)率為12.858%，第3主成分的貢獻(xiàn)率為8.869%。

對第1主成分進(jìn)行分析得出，相對發(fā)芽指數(shù)、相對萌發(fā)耐冷指數(shù)、相對露白耐冷指數(shù)、相對露白指數(shù)、相對發(fā)芽率、相對露白率的相關(guān)系數(shù)分別為0.960、0.954、0.930、0.906、0.895及0.893，表明第1主成分主要反映了高油酸花生露白及萌發(fā)指標(biāo)，定義為露白萌發(fā)性狀因子；第2主成分中，相對平均發(fā)芽時間的相關(guān)系數(shù)為0.903，定義為發(fā)芽時間性狀因子，第3主成分中，相對子葉鮮重的相關(guān)系數(shù)為0.952，定義為子葉鮮重性狀因子。因此，本研究利用主成分分析把多個高油酸花生萌發(fā)期耐冷指標(biāo)歸為了具有代表性的因子，進(jìn)一步量化變量數(shù)目，獲取了高油酸花生萌發(fā)期耐冷性主要影響指標(biāo)。

表4 高油酸花生萌發(fā)期耐冷指標(biāo)的主成分分析

2.3 高油酸花生種質(zhì)萌發(fā)期耐冷指標(biāo)的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析表明(表5)，露白萌發(fā)性狀指標(biāo)間存在顯著正相關(guān)性，相對露白指數(shù)和相對露白耐冷指數(shù)、相對發(fā)芽指數(shù)和相對萌發(fā)耐冷指數(shù)之間的相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)分別為0.977和0.965，相對露白率和相對露白耐冷指數(shù)、相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽指數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.943和0.888，相對露白率和相對露白指數(shù)、相對發(fā)芽率之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.876和0.862，相對發(fā)芽率和相對露白耐冷指數(shù)、相對萌發(fā)耐冷指數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.843和0.826。相對平均發(fā)芽時間與相對發(fā)芽勢呈極顯著負(fù)相關(guān)。相對胚鮮重與相對發(fā)芽指數(shù)之間的相關(guān)性也達(dá)到了極顯著水平，相對胚鮮重與相對露白率、相對發(fā)芽率、相對活力指數(shù)、相對露白耐冷指數(shù)、相對萌發(fā)耐冷指數(shù)之間的相關(guān)性也都達(dá)到了顯著水平。

表5 高油酸花生種質(zhì)萌發(fā)期耐冷指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4 高油酸花生萌發(fā)期耐冷性綜合評價

本研究利用隸屬函數(shù)法對56份高油酸花生萌發(fā)期耐冷指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過公式(11)與(12)計算得出11個耐冷指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，權(quán)重系數(shù)分別為相對露白率DRPSWRBT(0.076)、相對發(fā)芽率RGR(0.078)、相對發(fā)芽勢RGE (0.124)、相對露白指數(shù)RSWRBTI (0.064)、相對發(fā)芽指數(shù)RGI (0.079)、相對活力指數(shù)RVI (0.121)、相對平均發(fā)芽時間RMGT (0.109)、相對露白耐冷指數(shù)RSWRBTCTI (0.066)、相對萌發(fā)耐冷指數(shù)RGCTI (0.082)、相對子葉鮮重RCFW (0.074)以及相對胚鮮重REFW(0.126)，根據(jù)公式(13)計算得出56份高油酸花生萌發(fā)期耐冷指標(biāo)的綜合得分(D值)，對其進(jìn)行綜合評價。結(jié)果如表6所示，高油酸花生萌發(fā)期耐冷性狀綜合值(D值)均值為0.497，不同高油酸花生品種在萌發(fā)期耐冷性存在較大差異，品種15L17的D值最高(0.754)，品種15S11的D值最低(0.080)，表明15L17耐冷性最好、15S11耐冷性最差。

56份高油酸花生萌發(fā)期耐冷性綜合評價D值變化范圍為0.080～0.754，綜合評價D值與11個耐冷指標(biāo)的相關(guān)性分析(表7)，D值與9個性狀的相關(guān)性達(dá)到了極顯著水平，從高至低分別為相對發(fā)芽率RGR(0.921)、相對發(fā)芽指數(shù)RGI(0.911)、相對萌發(fā)耐冷指數(shù)RGCTI(0.894)、相對露白耐冷指數(shù)RSWRBTCTI(0.891)、相對露白率RPSWRBT(0.881)、相對露白指數(shù)RSWRBTI(0.851)、相對活力指數(shù)RVI(0.741)、相對發(fā)芽勢RGE(0.629)、相對胚鮮重REFW(0.441)，由此表明D值可以作為高油酸花生萌發(fā)期耐冷性綜合評價指標(biāo)，D值越大表明高油酸花生萌發(fā)期耐冷性越強(qiáng)。

表6 高油酸花生萌發(fā)期耐冷性綜合評價

表7 綜合評價D值與11個耐冷指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)

2.5 高油酸花生萌發(fā)期耐冷性聚類分析

根據(jù)56份高油酸花生萌發(fā)期耐冷性綜合評價D值進(jìn)行聚類分析，在歐式距離為10處可聚為5類，結(jié)果如圖1所示。依據(jù)D值變化范圍將56份高油酸花生耐冷等級劃為5個級別，耐冷分級結(jié)果如表8所示，56份高油酸花生材料被分為5個組群，15L17為耐冷較強(qiáng)材料(1級)、15L16等20份種質(zhì)為中等耐冷材料(2級)、花育917等29份種質(zhì)為耐冷較差材料(3級)、開農(nóng)176等5份種質(zhì)為耐冷差材料(4級)、15S11為冷敏感材料(5級)。對56份高油酸花生萌發(fā)期耐冷性綜合評價D值進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov檢驗，P值(0.2) > 0.05，表明參試材料D值符合正態(tài)分布，因此這種耐冷等級的劃分具有統(tǒng)計學(xué)意義[24]。

圖1 56份高油酸花生萌發(fā)期耐冷性聚類分析

表8 56份高油酸花生萌發(fā)期耐冷性的分級結(jié)果

3 討論

萌發(fā)期是種子對低溫最敏感的時期之一[25]，該時期遭遇低溫，種子發(fā)芽及之后的生產(chǎn)進(jìn)程均將受到影響，最終導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。盡管在植物生長的任何時期都可以通過低溫鑒定其耐冷性，但萌發(fā)期具有用時短、易操作、效率高的特點，已成為耐冷鑒定的首選方法，且在水稻[26]、大豆[27]、花生[28]等作物上研究表明，作物在萌發(fā)期耐冷性和生長后期的耐冷具性有一致性。因此，明確作物萌發(fā)期耐冷指標(biāo)并篩選耐冷性品種，可為耐冷品種資源選育、大田抗冷栽培提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

本研究采取了常溫對照與低溫處理下各耐冷指標(biāo)的相對值進(jìn)行分析，消除了不同高油酸花生本身品種固有的特性，使得試驗指標(biāo)數(shù)據(jù)更具有科學(xué)性[29]。高油酸花生萌發(fā)期各性狀指標(biāo)之間以及多數(shù)指標(biāo)與耐冷指標(biāo)之間相關(guān)性極顯著或顯著，表明性狀信息之間有較多重疊，采用單個性狀指標(biāo)來評價高油酸花生萌發(fā)期耐冷性有明顯的局限性[30]。本試驗基于耐逆脅迫萌發(fā)指標(biāo)露白率、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽時間，將露白耐冷指數(shù)、萌發(fā)耐冷指數(shù)、子葉鮮重及胚鮮重作為高油酸花生萌發(fā)耐冷指標(biāo)，可較準(zhǔn)確、全面地反映高油酸花生在萌發(fā)期的耐冷特性。

國內(nèi)外關(guān)于花生萌發(fā)期及苗期耐冷性品種鑒定篩選的研究報道較多[31-34]，但涉及高油酸花生萌發(fā)期耐冷性的報道只針對少數(shù)幾個品種開展[5,11-12]，且對高油酸花生資源萌發(fā)期耐冷性鑒定及綜合評價的研究鮮見報道。利用主成分分析與隸屬函數(shù)法相結(jié)合對種質(zhì)資源進(jìn)行耐冷性評價，可以避免單一指標(biāo)評價資源耐冷的片面性，此方法已在水稻[35]、棉花[36]、黃瓜[37]耐冷性綜合評價中得到應(yīng)用。本研究中，56份高油酸花生種質(zhì)資源萌發(fā)期的11個耐冷指標(biāo)按貢獻(xiàn)率高低可歸為露白萌發(fā)因子、發(fā)芽時間因子及子葉鮮重因子3類。各因子得分不同，其中露白率、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)得分較高，說明在高油酸花生耐冷性鑒定中有較大貢獻(xiàn)，此結(jié)論與常博文等[11]、薛云云等[28]、Wang等[33]、呂建偉等[38]在普通油酸花生中的研究結(jié)果一致。關(guān)于萌發(fā)耐冷指數(shù)、露白耐冷指數(shù)在高油酸花生萌發(fā)期耐冷性評價中的貢獻(xiàn)，國內(nèi)外尚鮮有報道。本研究認(rèn)為發(fā)芽指數(shù)及萌發(fā)耐冷指數(shù)可作為高油酸花生萌發(fā)期耐冷性的最優(yōu)鑒定指標(biāo)，此結(jié)論進(jìn)一步補(bǔ)充和完善了高油酸花生萌發(fā)期耐冷評價指標(biāo)，可為今后高油酸花生耐冷鑒定提供理論支持。

56份高油酸花生耐冷性按綜合評價D值大小排序，既克服了各指標(biāo)之間信息重疊導(dǎo)致的誤差，又利用了各指標(biāo)之間內(nèi)在聯(lián)系，D值作為一個[0,1]的純數(shù)，保證綜合評價更準(zhǔn)確。高油酸花生萌發(fā)期耐冷性狀綜合評價D值范圍為0.080～0.754，均值為0.497，表明不同高油酸花生品種在萌發(fā)期耐冷性存在較大差異，這與張高華等[12]、Balota等[34]研究結(jié)論一致。由56份高油酸花生綜合評價D值得分顯示，山東省花生研究所育成的15L17萌發(fā)期耐冷性最好、15S11萌發(fā)期耐冷性最差，上述結(jié)論可為高油酸花生耐冷性理論研究提供參考，也可為實際生產(chǎn)中品種選擇提供指導(dǎo)性意見。

通過對綜合評價D值進(jìn)行聚類分析，將來源、耐性不同的品種劃歸為不同的類群是種質(zhì)資源多樣性鑒定評價的主要方法[39-40]。本研究將56份高油酸花生根據(jù)耐冷強(qiáng)弱分為5個類群，各類群的材料次數(shù)分布符合正態(tài)分布，耐冷較強(qiáng)材料及冷敏感材料占比極少，中等耐冷材料和耐冷較差材料占比最大，因此試驗中篩選到的耐冷種質(zhì)，可作為高油酸花生耐冷育種和耐冷機(jī)理研究材料，陳昊等[5]、薛曉夢等[41]的報道中也得到類似研究結(jié)果。因此，在今后的高油酸耐冷育種工作中，選擇親本時既要考慮來源也要兼顧親本歸屬的類群。

4 結(jié)論

本研究綜合采用隸屬函數(shù)法、主成分分析及聚類分析方法對56份高油酸花生11項耐冷指標(biāo)進(jìn)行評價分析， 按貢獻(xiàn)率高低11個耐冷指標(biāo)歸為露白萌發(fā)因子、發(fā)芽時間因子及子葉鮮重因子。發(fā)芽指數(shù)和萌發(fā)耐冷指數(shù)可作為高油酸花生萌發(fā)期耐冷性的最優(yōu)鑒定指標(biāo)。不同高油酸花生品種萌發(fā)期耐冷性存在較大差異，篩選到了1份萌發(fā)期耐冷性較高的油酸花生材料15L17、20份中等耐冷材料、29份耐冷較差材料、5份耐冷差材料、1份冷敏感材料15S11。本研究篩選到的耐冷種質(zhì)，可作為高油酸花生耐冷育種和耐冷機(jī)理研究材料。