程凱森 張美芳 黃玲玲 周化斌 楊海龍

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

黃酒是以大米為原料添加發(fā)酵劑釀造而成的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，富含氨基酸、低聚糖、多糖等功能成分，營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特、歷史悠久，為世界三大釀造酒之一[1]。紅曲黃酒是以紅曲或?yàn)跻录t曲為發(fā)酵劑釀造的一種特色黃酒，以色紅、味醇、香濃而著稱[2-4]。傳統(tǒng)黃酒釀造過程是在開放的發(fā)酵系統(tǒng)中完成，參與釀造的微生物來自酒曲、釀造用水、發(fā)酵容器及空氣等，其中酒曲中的微生物最豐富，研究人員運(yùn)用MiSeq高通量測(cè)序、PCR-變性梯度凝膠電泳(PCR-gradient gel electrophoresis)以及分子生物學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)分析等技術(shù)分析了福州紅曲、古田紅曲、烏衣紅曲中的微生物菌群結(jié)構(gòu)，確定優(yōu)勢(shì)微生物包括紫紅曲霉(Monascuspurpureus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、黃曲霉(A.flavus)、米根霉(Rhizopusoryzae)、芽孢桿菌(Bacillussp.)、魏斯氏菌(Weasellasp.)、片球菌(Staphylococcussp.)以及扣囊復(fù)膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、季也蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、光滑假絲酵母(Candidaglabrata)等大量的絲狀真菌、細(xì)菌和酵母[2-4]，這些微生物共同作用成就了黃酒獨(dú)特的風(fēng)味。

不同的微生物在紅曲黃酒釀造中發(fā)揮著不同的作用，紅曲霉、黑曲霉等絲狀真菌的主要功能是分泌淀粉酶將淀粉分解為可發(fā)酵糖。酵母菌在釀造中尤為重要，不但將糖轉(zhuǎn)化成為乙醇和二氧化碳，并通過其他一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)生成甘油、脂肪酸、雜醇、醛類及酯類等風(fēng)味物質(zhì)[5]。黃酒釀造中的酵母以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為主，但畢赤酵母(Pichia)、 假絲酵母(Candida)、隱球酵母(Cryptococcus)、紅酵母(Rhodotorula)、復(fù)膜孢酵母(Saccharomycopsis)等非釀酒酵母(non-Saccharomyces)也參與其中[6]。不同菌株間生長代謝存在顯著的差異，使酒體產(chǎn)生不同的口感、風(fēng)味及香氣，賦予黃酒地域特色。本研究對(duì)紅曲中的非釀酒酵母菌株進(jìn)行分離鑒定，并采用純種發(fā)酵的方式釀造黃酒，分析非釀酒酵母對(duì)紅曲黃酒風(fēng)味成分的影響，以期探究紅曲黃酒風(fēng)味物質(zhì)的形成規(guī)律，為優(yōu)良非釀酒酵母菌株的選育提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料和試劑 紅曲收集于溫州和平陽；紫紅曲霉由溫州大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室篩選，保藏于中國微生物菌種保藏管理中心(保藏號(hào)CGMCC16790)；黃酒釀造活性干酵母，購自安琪酵母股份有限公司(湖北宜昌)。3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)、鄰苯二甲醛(ortho-phthalaldehyde, OPA)、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、乳酸、乙酸、酒石酸、蘋果酸，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜純甲醇、乙腈，購自美國Sigma公司。

1.1.2 分離培養(yǎng)基 馬鈴薯培養(yǎng)基(potato-dextrose-agar, PDA)，制備平板前加入硫酸鏈霉素，濃度100 U·mL-1。

1.1.3 主要儀器 1260 InfinityⅡ型高效液相色譜儀、氣相色譜-質(zhì)譜儀(7980A GC-5975C MS)，美國Agilent公司；UV-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用分析儀器有限公司；VS-840K-U潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-25OA生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；FE20 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；50 μm CAR/PDMS/DVB萃取纖維頭，美國SUPELCO公司；5424R冷凍高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；T100TMPCR儀，美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離 取適量紅曲加入無菌水，按10-4、10-5、10-6梯度稀釋，分別取100 μL稀釋液均勻涂布于PDA培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落。菌落表面濕潤、光滑、黏稠，顏色單調(diào)，生長在培養(yǎng)基表面，質(zhì)地均勻，正、反面、中央與邊緣顏色一致的可能是酵母菌[7]。挑選單個(gè)菌落進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，3代后為純種。

1.2.2 酵母菌的分子鑒定 采用Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒(SK8257，上海生工生物工程有限公司)提取純培養(yǎng)目標(biāo)菌株的基因組DNA。以酵母通用引物擴(kuò)增其26S rDNA D1/D2基因區(qū)，引物分別為NL1(G C A T A T C A A T A A G C G G A G G A A A AG)和NL4(G G T C C G T G T T T C A A G A C GG)。25 μL反應(yīng)液(模板DNA 0.5 μL，10×緩沖液2.5 μL，dNTP 1.0 μL，反應(yīng)酶0.2 μL，引物各0.5 μL， 雙蒸水19.8 μL)的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30次循環(huán)；最后72℃充分延伸10 min，4℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物，在1.0%瓊脂糖凝膠電泳中分離(150 V, 20 min)。用FR980型凝膠成像系統(tǒng)(上海復(fù)日科技儀器有限公司)進(jìn)行分析，將含有目標(biāo)片段的產(chǎn)物送生工(上海)生物工程有限公司測(cè)序，將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，利用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，與數(shù)據(jù)庫中已知酵母的26S rDNA 基因序列進(jìn)行比對(duì)，利用 MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 黃酒的釀造 分離的酵母菌種和活性干酵母在PDA液體培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)2 d；紅曲菌活化后接入10%的糯米粉培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5 d制備純種液體曲。在500 mL錐形瓶中加入100 g糯米和60 mL蒸餾水，浸泡過夜，紗布封口，在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌20 min；冷卻后每瓶接入100 mL紅曲液體曲以及5 mL酵母菌液，混勻，置于生化培養(yǎng)箱中28℃恒溫培養(yǎng)。每隔2 d在無菌條件下進(jìn)行攪拌，發(fā)酵10 d。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵醪用濾布過濾，90℃滅菌30 min，置于4℃冰箱用于黃酒風(fēng)味成分的測(cè)定。

1.2.4 還原糖、乙醇、總酸含量和pH值的測(cè)定 還原糖含量采用DNS法測(cè)定[8]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品；樣品蒸餾后采用酒精計(jì)測(cè)定乙醇含量；使用酸度計(jì)測(cè)定pH值；總酸含量采用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定法測(cè)定。

1.2.5 氨基酸含量的測(cè)定 樣品經(jīng)2 000 r·min-1離心10 min后，上清液過0.45 μm濾膜，采用OPA柱前衍生化，然后采用HPLC法測(cè)定，外標(biāo)法對(duì)各氨基酸含量進(jìn)行定量[8]。吸取400 μL硼酸緩沖液(pH值10.4)于色譜樣品瓶，加入160 μL OPA溶液和80 μL樣液，反應(yīng)5.0 min后進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL。色譜條件：AdvanceBio AAA色譜柱(4.6 mm×100 mm，2.7 μm，美國Agilent公司)，柱溫40℃；采用梯度洗脫，流動(dòng)相A為0.01 mol·L-1NaH2PO4-Na2B4O7(pH值8.2 )緩沖溶液，流動(dòng)相B為乙腈-甲醇-水(45∶45∶10)，洗脫程序見表1；流速1.5 mL·min-1；檢測(cè)波長338 nm，參比波長390 nm。

1.2.6 有機(jī)酸含量的測(cè)定 樣品經(jīng)2 000 r·min-1離心10 min后，上清液過0.45 μm濾膜，采用HPLC法測(cè)定，外標(biāo)法對(duì)樣品中酒石酸、蘋果酸、乳酸和乙酸進(jìn)行定量[9]。HPLC條件：Zorbax C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm，美國Agilent公司)；柱溫30℃；流動(dòng)相為0.01 mol·L-1磷酸氫二銨溶液(pH值2.7)；流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長210 nm，參比波長310 nm。

表1 HPLC洗脫程序

1.2.7 揮發(fā)性成分的測(cè)定 揮發(fā)性成分的測(cè)定參考Cao等[10]的方法，以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)，固相微萃取后采用氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)法測(cè)定。固相微萃取：20 mL頂空瓶中加入6 mL酒樣、5 μL內(nèi)標(biāo)(2-辛醇，30 mg·L-1)、 1 g氯化鈉，于60℃平衡5 min后，用固相微萃取纖維頭萃取40 min。GC-MS分析：色譜柱為HP-INNOWAXS毛細(xì)管柱子(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司)；載氣為He，流速1 mL·min-1，分離比5∶1；進(jìn)樣溫度為250℃；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0℃，保持5 min，以8℃ min-1升至250℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：EI電離源，能量70 eV；離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，接口溫度250℃，掃描范圍30～500 m/z。通過與NIST11、Wiley 等標(biāo)準(zhǔn)譜圖的比對(duì)檢索，以及與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的香氣成分和保留指數(shù)相比較，確認(rèn)所檢出的揮發(fā)性成分。

1.2.8 感官評(píng)定 根據(jù)《GB/T 13662-2018 黃酒》[11]中的感官要求及檢查方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)不同酵母發(fā)酵的酒樣進(jìn)行編號(hào)，由10名評(píng)價(jià)人員組成品評(píng)小組對(duì)酒樣的色澤、香氣、口味和風(fēng)格進(jìn)行評(píng)分，分值為0～10分。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株的分離鑒定

根據(jù)酵母菌落的形態(tài)學(xué)特征挑選單個(gè)酵母菌菌落，分離獲得了4株酵母菌，分別為CKS-2、CKS-3、CKS-4和CKS-7，傳代3次后，確定為純種酵母菌。提取4株酵母菌株的總DNA，擴(kuò)增26S rDNA 近5’端的D1/D2 序列并進(jìn)行測(cè)序。將序列提交GenBank，各菌株的登錄號(hào)分別為MK696269.1、MK696270.1、MK696271.1和MK696272.1。由系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)可知，菌株CKS-2為威克漢姆酵母(Wickerhamomycessp.)，CKS-3為季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)，CKS-4為膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)，CKS-7為德爾布有孢酵母(Torulasporadelbrueckii)。

圖1 紅曲中分離獲得的非釀酒酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 不同酵母發(fā)酵酒樣還原糖、乙醇、總酸含量及pH的比較

淀粉在微生物酶的作用下被分解為糖類化合物，不僅為釀造微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)，在酵母菌的代謝作用下生成乙醇，而且殘留的糖類可賦予黃酒甜味。由表2可知，不同菌株發(fā)酵的酒樣中還原糖含量存在差異，其中菌株CKS-3發(fā)酵酒樣中還原糖含量較高。菌株CKS-7和活性干酵母(對(duì)照)發(fā)酵酒樣中還原糖含量較低，乙醇含量較高，說明這2株酵母可以較好地利用還原糖進(jìn)行代謝。活性干酵母發(fā)酵酒樣中的總酸含量(6.00 g·L-1)顯著高于非釀酒酵母菌株發(fā)酵的酒樣，而所分離非釀酒酵母菌株發(fā)酵酒樣中的總酸含量差異均不顯著。菌株CKS-7和活性干酵母發(fā)酵酒樣的pH值較低，而菌株CKS-2、CKS-3和CKS-4發(fā)酵酒樣的pH值較高。

表2 不同酵母發(fā)酵酒樣還原糖、總酸、乙醇含量及pH

2.3 不同酵母發(fā)酵酒樣氨基酸含量分析

黃酒中含有豐富的氨基酸，主要來源于釀造過程中原料蛋白質(zhì)的分解和酵母的自溶?；钚愿山湍负退蛛x4株非釀酒酵母發(fā)酵酒樣中各氨基酸含量見表3，不同氨基酸的含量存在差異?；钚愿山湍赴l(fā)酵酒樣中甘氨酸、精氨酸的含量較高；菌株CKS-2發(fā)酵酒樣中酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸的含量較高；菌株CKS-3發(fā)酵酒樣中谷氨酸、丙氨酸、異亮氨酸含量較高；菌株CKS-4發(fā)酵酒樣中天冬氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸含量較高；菌株CKS-7發(fā)酵酒樣中絲氨酸、組氨酸、色氨酸、亮氨酸含量較高，但是各酵母菌株發(fā)酵酒樣間總氨基酸含量無顯著差異。聚類分析表明(圖2)，菌株CKS-2、CKS-3和CKS-4發(fā)酵的酒樣中各種氨基酸含量較為相似，而與對(duì)照活性干酵母和菌株CKS-7發(fā)酵的酒樣差異較大。

表3 不同酵母發(fā)酵的紅曲黃酒氨基酸含量

圖2 不同酵母發(fā)酵酒樣中氨基酸組分熱圖分析

2.4 不同酵母發(fā)酵酒樣有機(jī)酸含量分析

有機(jī)酸是黃酒的重要風(fēng)味成分，乳酸、蘋果酸等不揮發(fā)酸能增加酒的醇厚感、延長回味時(shí)間[12]。由表4可知，菌株CKS-7發(fā)酵酒樣中蘋果酸含量最高(1 347.71 mg·L-1)，為對(duì)照活性干酵母酒樣含量的9.95倍；酒石酸含量在對(duì)照活性干酵母和CKS-3發(fā)酵酒樣中較高，而CKS-4發(fā)酵酒樣中含量最低(26.54 mg·L-1)；乳酸含量除CKS-3發(fā)酵酒樣中較低外，在其他酒樣中的含量差異不顯著；乙酸含量在對(duì)照照活性干酵母發(fā)酵酒樣中最高(1 926.72 mg·L-1)，為CKS-7發(fā)酵酒樣的4.56倍。

2.5 不同酵母發(fā)酵酒樣揮發(fā)性成分分析

由表5可知，除乙醇外， CKS-2、CKS-3和CKS-4發(fā)酵酒樣中檢出的揮發(fā)性物質(zhì)組分較少(分別為17、21和24種)；而CKS-7發(fā)酵酒樣中檢出的揮發(fā)性組分?jǐn)?shù)量與活性干酵母發(fā)酵酒樣中相近(分別為27和28種)，但熱圖分析(圖3)表明兩者在種類組成和含量方面差異較大，在CKS-7發(fā)酵酒樣中檢出的乙酸乙酯、3-乙氧基丙醇、甲酸己酯和十五酸乙酯，在對(duì)照活性干酵母發(fā)酵酒樣中未檢出，而且CKS-7發(fā)醇酒樣中2-苯乙醇的含量達(dá)4.102 mg·L-1， 為對(duì)照發(fā)酵酒樣中含量的1.21倍；而對(duì)照發(fā)酵酒樣中的正己醇、乙酸異戊酯、9-十六碳烯酸乙酯、苯甲醛和3-羥基-2-丁酮在CKS-7發(fā)酵酒樣中未檢出。

表4 不同酵母發(fā)酵酒樣中有機(jī)酸的含量

表5 不同酵母發(fā)酵的酒樣中揮發(fā)性組分含量

圖3 不同酵母發(fā)酵酒樣中揮發(fā)性組分熱圖分析

所有酒樣中揮發(fā)性成分的組成都是以醇和酯為主，乙醇除外，醇和酯的含量占揮發(fā)性成分總含量的比例分別為86.68%(對(duì)照發(fā)酵酒樣)、85.89%(CKS-2發(fā)酵酒樣)、85.47%(CKS-3發(fā)酵酒樣)、82.94%(CKS-4發(fā)酵酒樣)和89.05%(CKS-7發(fā)酵酒樣)。

2.6 不同酵母發(fā)酵酒樣感官品質(zhì)的比較

從色澤、香氣、口味和風(fēng)格4個(gè)方面對(duì)各酵母菌株發(fā)酵的酒樣進(jìn)行感官品評(píng)(表6)，結(jié)果表明，各菌株發(fā)酵的酒樣色澤之間差異不顯著(P>0.05)，均呈紅色；香氣方面，菌株CKS-7發(fā)酵的酒樣得分最高，但與對(duì)照發(fā)酵酒樣間差異不顯著(P>0.05)；口味和風(fēng)格方面，可以分為兩組，菌株CKS-7和活性干酵母發(fā)酵的酒樣為一組，得分顯著高于菌株CKS-2、CKS-3和CKS-4發(fā)酵的酒樣(P<0.05)。

3 討論

紅曲黃酒是以糯米為主要原料，添加紅曲或?yàn)跻录t曲作為糖化發(fā)酵劑，在多種微生物共同作用下發(fā)酵而成的一種低度黃酒，為浙江南部和福建等地具有鮮明特色的一種黃酒[13-14]，不僅營養(yǎng)豐富，而且含有莫納可林K(Monacolin K)及其衍生物、天然紅曲紅色素、γ-氨基丁酸等功能活性物質(zhì)[15]。酵母菌是釀酒過程中最重要的微生物之一，不僅能進(jìn)行糖的分解、轉(zhuǎn)化或同化，產(chǎn)生乙醇，而且能產(chǎn)酸和脂類物質(zhì)，其代謝物種類和數(shù)量決定黃酒的品質(zhì)[9]。紅曲黃酒釀造過程中，除釀酒酵母外，還有多種非釀酒酵母參與，包括畢赤酵母、假絲酵母、隱球酵母、紅酵母、復(fù)膜孢酵母等[6]，這些酵母雖然發(fā)酵效率較低，但能合成多種酶，代謝生產(chǎn)酯、酸、高級(jí)醇和醛等成分，對(duì)黃酒風(fēng)味的形成具有重要的作用[16]。呂旭聰?shù)萚17]對(duì)福建紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造過程的酵母菌群進(jìn)行跟蹤分析，分離獲得扣囊復(fù)膜孢酵母、季也蒙畢赤酵母和粘性紅圓酵母3株非釀酒酵母。本研究從浙江南部釀造紅曲中分離獲得4株非釀酒酵母菌株，經(jīng)鑒定分別為威克漢姆酵母、季也蒙畢赤酵母、膠紅酵母和德爾布有孢酵母。

表6 不同酵母發(fā)酵酒樣感官品質(zhì)

紅曲黃酒釀造過程中，微生物將糯米中的淀粉降解轉(zhuǎn)化為還原糖、醇類等成分，蛋白質(zhì)分解成肽類和氨基酸，酒液中還原糖、乙醇、總酸、氨基酸的含量可反應(yīng)微生物的代謝活動(dòng)。分離獲得的4株非釀酒酵母中，CKS-7代謝能力較強(qiáng)，發(fā)酵酒樣中乙醇、總酸含量較高(表2)。氨基酸是釀造微生物生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)，也是風(fēng)味物質(zhì)的前體，可被轉(zhuǎn)化為高級(jí)醇，并且可與糖發(fā)生美拉德反應(yīng)影響酒體的色澤，另外，不同的氨基酸本身具有鮮味、甜味、苦味、酸味和咸味，組合在一起賦予酒體豐富的口感[18-19]，本研究分離獲得的非釀酒酵母菌株發(fā)酵的酒樣中氨基酸總含量差異不顯著，但單體間存在差異(表4)。乳酸、乙酸、酒石酸、琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、草酸、富馬酸等有機(jī)酸普遍存在于傳統(tǒng)釀造的黃酒中，其中以乳酸、乙酸和琥珀酸為主[16,20]。蘋果酸是三羧酸循環(huán)代謝的中間產(chǎn)物，本研究采用純種發(fā)酵，結(jié)果表明對(duì)照分離的非釀酒酵母菌株產(chǎn)蘋果酸能力較強(qiáng)，顯著高于釀酒酵母，尤其是菌株CKS-7發(fā)酵酒樣中蘋果酸含量最高(表4)。各菌株發(fā)酵酒樣中還含有較高濃度的乳酸和乙酸，其合成途徑為，葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑形成的丙酮酸，可在乳酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化生成乳酸，也能在乙醇脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為乙醇，并在甲酸裂解酶的作用下產(chǎn)生乙酸[20]。

黃酒的揮發(fā)性風(fēng)味成分主要為醇類、酯類、醛類以及少量的酮類和酚類化合物，如異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇、正己醇、3-乙氧基丙醇、2-庚醇、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、苯乙醇、2,3-丁二醇、正辛醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、十四酸乙酯、庚酸乙酯、棕櫚酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、乙醛、己醛、糠醛、2-苯基-2-丁烯醛、壬醛、苯甲醛、苯乙醛、3-羥基-2-丁酮、1-辛烯-3-酮、2-壬酮、苯乙酮、愈創(chuàng)木酚、2,3,5-三甲基吡嗪等[21-23]。紅曲黃酒中的關(guān)鍵揮發(fā)性成分有異丁醇、異戊醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、2-壬酮、愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、糠醛、苯甲醛和β-苯乙醇等[24]，其中，高級(jí)醇是釀造過程中由蛋白質(zhì)、氨基酸及糖類化合物的分解代謝而成，在釀造酒的香氣物質(zhì)中占有較大的比例，而酯類物質(zhì)是酒體果香的主要來源[25]。不同產(chǎn)地的黃酒風(fēng)味各異，其主要原因是釀造微生物的不同， 即便是菌株的差異也會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)性風(fēng)味成分的極大變化[26]。釀酒酵母除代謝產(chǎn)生乙醇外，也會(huì)合成一些高級(jí)醇和酯類風(fēng)味成分[27]；而非釀酒酵母在酒體風(fēng)味物質(zhì)形成方面具有重要的作用，畢赤酵母與酒體中揮發(fā)性醇和酯的含量直接相關(guān)[28]；卡利比克畢赤酵母(P.caribbicaUFLA CAF733) 發(fā)酵可提高2-苯乙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯和苯乙酸乙酯等揮發(fā)性成分的含量[29]；原苗苗等[30]比較了不同非釀酒酵母產(chǎn)香的差異，結(jié)果表明美極梅氏酵母產(chǎn)生的發(fā)酵香氣濃度最高(206.27 mg·L-1)， 主要成分為苯乙醇和3-甲基丁醇，葡萄有孢漢遜酵母能夠產(chǎn)生乙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、辛酸乙酯、辛酸-3-甲基丁酯、乙酸-2-苯乙酯、辛酸和香茅醇等豐富的香氣成分；德布爾有孢酵母可形成乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙醛等風(fēng)味成分[31]，本研究分離獲得的CKS-7屬于德布爾有孢酵母菌株，具有相似的效果，而且能產(chǎn)生大量的2-苯乙醇，該成分具有蜜香玫瑰味的清雅香氣，是黃酒的主體香味成分之一[16,32]；感官評(píng)定結(jié)果也表明，菌株CKS-7發(fā)酵酒樣香氣指標(biāo)得分較高，與揮發(fā)性成分的分析結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)初步研究了浙江南部紅曲中的酵母，分離獲得4株非釀酒酵母菌株，CKS-2為威克漢姆酵母(Wickerhamomycessp.)、CKS-3為季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)、CKS-4為膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、CKS-7為德爾布有孢酵母(Torulasporadelbrueckii)。純種發(fā)酵試驗(yàn)表明，這些菌株發(fā)酵酒樣在有機(jī)酸、氨基酸及揮發(fā)性成分組成方面與釀酒酵母存在顯著的差異，其中菌株CKS-7產(chǎn)蘋果酸、2-苯乙醇等風(fēng)味成分的性能良好，可提升紅曲黃酒的品質(zhì)，是潛在的可應(yīng)用于紅曲黃酒釀造的優(yōu)良菌株，但其風(fēng)味成分形成機(jī)理及其與釀酒酵母間的相互作用需作進(jìn)一步研究。