彭俊付，王振彪，彭繼升，王 銳，劉 超

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是人類致命的惡性腫瘤之一[1-2]。盡管在過去10年中，癌癥篩查和治療方法的改進使CRC的病死率有所下降，但其依舊是世界上癌癥死亡的第3大原因，每年新發(fā)病例超100萬，死亡病例60萬，嚴重危害了人類的身體健康[3-4]。MicroRNAs(miRNAs)是長度為18～25個核苷酸的非編碼小RNA，可直接與靶基因mRNAs的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)結合，導致目的基因降解或抑制目的基因編碼蛋白的表達，從而調(diào)控目的基因的表達[5-6]。大量的研究表明，在CRC患者中，組織相關的miRNAs和循環(huán)miRNAs表達下調(diào)，其中包括miR-142-3p[7]。最近的證據(jù)表明，miR-142-3p在癌癥、病毒感染、炎癥和免疫耐受中具有重要作用[8]。已有研究表明，CRC患者腫瘤組織中miR-142-3p與健康人相比表達減少，并隨腫瘤分化程度升高而降低，提示miR-142-3p在腫瘤的發(fā)生和癌癥的預防中起著非常關鍵的作用[9]。Wnt/β-鏈蛋白(β-catenin)信號通路的過度活化常見于癌癥患者，尤其是CRC[10-11]。Wnt/β-catenin信號通路在CRC中具有重要作用[10,12-13]。在乳腺癌的研究中，miR-142-3p可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin等通路調(diào)控腫瘤細胞的增殖、細胞周期進程、血管生成、侵襲和轉移[14-15]。然而，miR-142-3p是否可調(diào)控CRC中Wnt/β-catenin信號通路仍未知。因此，本研究探討分析miR-142-3p通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路對CRC疾病進展的影響。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月—2020年10月首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院行根治術的66例CRC患者的腫瘤組織及其相鄰正常組織(距離腫瘤組織>5 cm)。男31例，女35例；年齡(58.6±7.2)歲；結腸癌42例，直腸癌24例；TNM分期Ⅰ期14例，Ⅱ期45例，Ⅲ期7例。所有患者術前均沒有接受過任何治療。

1.2材料 正常人結腸上皮細胞NCM460、CRC細胞系HT29、LoVo、HCT116、Caco2、SW480細胞(ATCC，美國)。DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen，美國)、FBS(Gibco，美國)、Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)、CCK-8試劑盒(碧云天，中國)、實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa，日本)、蛋白濃度定量試劑盒(Thermo，美國)、兔抗人β-catenin(Abcam，美國)、兔抗人Cyclin D1(Abcam，美國)、兔抗人c-myc(Abcam，美國)、鼠抗人β-actin(Abcam，美國)、anti-Ki67-PE(Thermo，美國)、雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Promega，美國)。

1.3方法

1.3.1qRT-PCR：Trizol試劑提取組織和細胞的總RNA。反轉錄為cDNA，反向轉錄參數(shù)如下：95℃預變性2 min，95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，miR-142-3p表達量采用2-ΔΔCt計算。實驗重復3次，取平均值。引物序列見表1。

表1 miR-142-3p和U6基因的引物序列

1.3.2免疫蛋白印跡：經(jīng)RIPA裂解提取總蛋白，經(jīng)變性處理，10%分離膠進行SDS-PAGE電泳。將目的蛋白轉至PVDF膜上，然后封閉1 h；加入一抗4℃孵育過夜，TBST清洗3次；加入二抗孵育1 h，TBST清洗3次；滴加顯影液顯影，采集圖片，ImageJ 1.52v軟件進行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參，比較灰度值。

1.3.3細胞轉染：轉染前24 h將Caco2、LoVo和HT29細胞接種于24孔板中，待細胞貼壁密度約80%。設計并合成miR-NC、miR-142-3p mimic的片段，使用opti-MEM分別稀釋miR-NC、miR-142-3p mimic為20 μl，加入Lipofectamine 2000 10 μl，5 min內(nèi)將稀釋液混合作用20 min。然后分別將各組混合液加入孔板中混勻，加入無血清DMEM培養(yǎng)6 h，更換加有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h，行功能實驗。

1.3.4細胞增殖檢測：應用CCK-8法進行檢測，各組轉染后的Caco2、LoVo和HT29細胞，以每孔5×103個細胞接種于96孔板中，分別培養(yǎng)24、48、72 h。每組設置3個復孔。培養(yǎng)結束后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，經(jīng)酶標儀測定吸光度值。實驗重復3次。應用Ki67-流式細胞術檢測細胞增殖：培養(yǎng)結束，收集各組細胞，將細胞用anti-Ki67-PE孵育30 min，上機檢測。

1.3.5雙熒光素酶報告系統(tǒng)：Caco2細胞以1.0×106/cm2鋪板至6孔板中，待細胞貼壁密度約80%時，將100 ng WT-CTNNB1(β-catenin編碼基因)或MUT-CTNNB1和miR-142-3p經(jīng)Lipofectamine 2000共轉染，檢測各組熒光強度。

2 結果

2.1CRC患者組織中miR-142-3p表達水平 結果表明，與腫瘤相鄰的正常組織相比，腫瘤組織miR-142-3p相對表達水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 結直腸癌患者正常組織和腫瘤組織中miR-142-3p表達水平

2.2CRC細胞系中miR-142-3表達水平 與正常人結腸上皮細胞NCM460相比，HT29、LoVo、HCT116、Caco2、SW480細胞中miR-142-3p表達水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3CRC細胞系中β-catenin表達水平 免疫蛋白印跡檢測CRC細胞系中β-catenin表達水平，檢測結果顯示，與正常人結腸上皮細胞NCM460相比，HT29、LoVo、HCT116、Caco2、SW480細胞中β-catenin表達水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 結直腸癌細胞系中β-catenin表達水平

2.4過表達miR-142-3p對細胞增殖的影響 Caco2、LoVo和HT29細胞經(jīng)轉染后，胞內(nèi)miR-143-3p表達量顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。并且，過表達miR-143-3p可顯著抑制CRC細胞系Caco2、LoVo和HT29細胞的增殖，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。流式細胞術檢測結果顯示，過表達miR-143-3p可顯著抑制CRC細胞系Caco2、LoVo和HT29的Ki67+細胞比例，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6。

圖4 轉染miR-142-3p mimic后Caco2、LoVo和HT29細胞內(nèi)miR-142-3p表達情況

2.5過表達miR-142-3p對Wnt/β-catenin信號通路的影響 與轉染miR-NC相比，轉染miR-143-3p mimic后，CRC細胞系Caco2、LoVo和HT29細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin、c-myc和Cyclin D1表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖7。

圖5 CCK-8法檢測過表達miR-142-3p對細胞增殖的影響

圖6 流式細胞術檢測過表達miR-142-3p對Ki67+細胞的影響

2.6miR-142-3p靶向調(diào)控β-catenin的表達 TargetScan軟件預測miR-142-3p與β-catenin編碼基因CTNNB1的3'-UTR存在互補位點，預測結果見圖8。隨后，構建WT-CTNNB1 3'-UTR和MUT-CTNNB1 3'-UTR質(zhì)粒，分別與miR-NC、miR-142-3p共轉染至Caco2細胞中，熒光素酶報告基因顯示，只有轉染miR-142-3p+WT細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見圖9。

3 討論

CRC是全世界公認嚴重危害人類身體健康的惡性腫瘤之一[16]。目前，手術、放化療及免疫治療是臨床治療CRC主要的手段。盡管一些治療手段在一定程度上可延長患者生存期，改善預后，但癌癥復發(fā)、轉移和耐藥給治療策略帶來了很大的挑戰(zhàn)[17]。新興的免疫治療可選擇性增強宿主對惡性疾病的免疫反應，是治療惡性腫瘤重要的方式，但其使用也僅限于幾種癌癥[18]。

圖7 過表達miR-142-3p對Wnt/β-catenin信號通路的影響

圖8 TargetScan軟件預測miR-142-3p與CTNNB1的結合位點

圖9 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-142-3p靶向結合CTNNB1

越來越多的證據(jù)證實，miRNAs作為表觀遺傳調(diào)節(jié)因子可通過與靶基因的相互作用，影響不同的信號通路，在腫瘤的發(fā)生和癌癥的預防中起著非常關鍵的作用[19-20]。在CRC中，miRNAs處于“失控”狀態(tài)，其通過與多種癌基因和抑癌基因(APC、KRAS、p53等)相互作用，或通過調(diào)節(jié)下游信號通路，在CRC的發(fā)生和發(fā)展中起關鍵作用[21]。許多miRNAs已經(jīng)成為治療干預CRC潛在藥物靶點，并可能成為大腸癌替代治療的候選藥物。

有研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。如在體外miR-142-3p可靶向CDK4誘導細胞周期停止，降低體外細胞活力和集落形成；并且在裸鼠異種移植腫瘤模型中，miR-142-3p可顯著抑制腫瘤的生長，使用其抑制劑后該效應則消失[22]。在另一項研究中發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p表達降低，結腸癌分化程度低，并且腫瘤體積較大[23-24]。另外，轉染miR-142-3p后可抑制CRC中Cyclin D1的表達，提高細胞對5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性[25]。此外，最新的研究提出，血清中miR-142-3p具有作為CRC臨床診斷和預后標志物的潛力[26]。本研究表明，miR-142-3p在CRC患者腫瘤組織和CRC細胞系中表達顯著降低；經(jīng)免疫蛋白印跡法檢測CRC細胞系中β-catenin表達發(fā)現(xiàn)，HT29、LoVo、HCT116、Caco2、SW480細胞中β-catenin表達水平均顯著性升高。而當轉染miR-142-3p mimic后，Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin、Cyclin D1、c-myc蛋白水平顯著降低，CRC細胞系Caco2、LoVo和HT29細胞增殖活力顯著降低。本研究結果與Troschel等[14]研究結果一致，提示miR-142-3p可抑制Wnt/β-catenin信號通路，在CRC中發(fā)揮抑癌的作用。本研究進一步經(jīng)TargetScan生物信息學軟件預測miR-142-3p與β-catenin編碼基因CTNNB1的3'-UTR是否存在互補位點，結果顯示，miR-142-3p具有兩段能與CTNNB1特異性結合的序列。經(jīng)進一步驗證，miR-142-3p確實可與CTNNB1直接結合。上述結果表明，miR-142-3p可在轉錄后水平調(diào)節(jié)β-catenin編碼基因CTNNB1的表達。

綜上所述，miR-142-3p在CRC腫瘤組織和細胞系中低表達，且miR-142-3p可特異性結合CTNNB1基因，靶向Wnt/β-catenin信號通路，繼而調(diào)控CRC細胞增殖。因此，miR-142-3p有望成為CRC的診斷標志物和治療潛在的靶點。