張東晨，王方略，王 濤，戴 雯

(安徽理工大學 材料科學與工程學院，安徽 淮南 232001)

0 引 言

隨著煤炭開采的不斷深入，煤炭分選加工難度增加，環(huán)境問題日漸凸顯，選煤工藝需進一步改善[1-3]。聚丙烯酰胺具有良好絮凝性、水溶性，主要應用于濕法選煤中煤泥水絮凝[4]。聚丙烯酰胺在自然條件下會自發(fā)緩慢降解，產生的丙烯酰胺單體有毒性，損害動物大腦[5]。此外，殘留的聚丙烯酰胺會減弱煤泥對浮選藥劑的吸附，降低浮選效果[6]，且聚丙烯酰胺會使煤泥水黏稠，流動性變差，增加煤泥水處理難度。因此，有必要處理選煤廠煤泥水中聚丙烯酰胺。含聚污水的處理方法主要包括物理法[7]、化學法[8]、化學與生物聯合法[9-10]和生物法[11]等。其中生物法具有環(huán)境友好、高效、安全、無二次污染等優(yōu)點。對聚丙烯酰胺有降解作用的微生物廣泛存在于污泥、土壤、污水中，且大多數是細菌。Yu等[12]從含聚丙烯酰胺干污泥中分離出一種惡臭假單胞菌，聚丙烯酰胺的降解率超過45%。但惡臭假單胞菌是一種少見的條件致病菌，對人類健康和環(huán)境生物有害。Wen等[13]從受聚丙烯酰胺污染的土壤和活性淤泥中分別分離出氟氏芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌，考察了對聚丙烯酰胺的降解效果，發(fā)現兩菌株皆以聚丙烯酰胺為唯一碳源。Li等[14]在大慶油田注水管道里檢測出假單胞菌屬、脫硫球莖菌科、草酸桿菌科、黃桿菌科、產堿桿菌科等，皆可將聚丙烯酰胺降解成低分子量聚合物和寡聚物。

近年來，研究者們開始利用菌種間協同作用降解聚丙烯酰胺。Kunichika等[15]從土壤里分離出2種純菌株復合體系，發(fā)現該復合體系可以打斷聚丙烯酰胺分子的碳主鏈，提供微生物生長所需的碳源。Bao等[16]從聚合物趨油水樣中分離出2種芽孢桿菌株，考察其協同降解效果，并對降解過程進行初探。研究表明，混合菌先將聚丙烯酰胺的側鏈酰胺基水解成羧基，再將聚丙烯酰胺碳骨架氧化分解。Liu等[17]利用液質聯動儀研究降解產物，發(fā)現好氧顆粒污泥水解聚丙烯酰胺的酰胺基側鏈，主要中間產物是低分子量的聚丙烯酸，無丙烯酰胺單體產生。Sang等[18]發(fā)現含有紅球菌和蠟樣芽孢桿菌的活性淤泥將聚丙烯酰胺碳骨架降解成高分子碎片，且碳骨架比側鏈酰胺基更難降解。徐敬堯等[19]發(fā)現球紅假單胞菌對褐煤有降解作用。張東晨等[20-21]發(fā)現球紅假單胞菌和黃孢原毛平革菌皆對煤炭有良好的絮凝效果，同時，有降解作用。黃孢原毛平革菌可有效降解交聯丙烯酸聚合物[22]。在限氮條件下，黃孢原毛平革菌分泌胞外酶對聚丙烯酰胺進行降解，降解效果好于氮源充足時[23]。

目前，聚丙烯酰胺生物降解研究的菌種選擇主要集中在細菌類，對真菌類降解菌的研究報道較少，且降解研究對象主要是石油領域的含聚廢水。本文將真菌類黃孢原毛平革菌與細菌類球紅假單胞菌按相同體積比混合，研究混合菌對煤泥水中聚丙烯酰胺的協同降解效果，確定了降解因素的最佳組合，并采用黏度法、紅外光譜、酶活測定等檢測手段，對降解產物和降解液進行分析，為探究和揭示混合菌的降解規(guī)律提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基和條件馴化

1.1.1菌種來源

球紅假單胞菌屬于紅螺菌科紅假單胞菌屬，兼性厭氧、革蘭氏陰性細菌，適合在中性室溫環(huán)境下生長。試驗所用的球紅假單胞菌來自中國礦業(yè)大學化工學院生物實驗室，密封保存于冰箱中。黃孢原毛平革菌屬擔子菌綱，好氧型嗜熱真菌，適合在pH=4～5下生長。試驗用黃孢原毛平革菌編號為GIM 3.393，購于廣東省微生物菌種保藏中心，密封保存于冰箱中。將上述菌種活化后，分別進行平板劃線，生長情況如圖1所示，具體性質見文獻[20-21]。

圖1 菌種生長情況

1.1.2培養(yǎng)基

基礎培養(yǎng)基(L-1)：馬鈴薯淀粉 20 g、葡萄糖 20 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、維生素B18 mg、pH=6。 降解培養(yǎng)基(L-1)：酒石酸銨 0.2 g、聚丙烯酰胺 500 mg、MgSO4·7H2O 1 g、KH2PO43 g、維生素B18 mg、微量元素溶液 10 mL、pH=6。微量元素溶液(L-1)：CuSO4·5H2O 0.8 g、MnCl2·4H2O 1 g、ZnSO4·7H2O 1.2 g。

以上培養(yǎng)基均在120 ℃滅菌30 min。

1.1.3條件馴化

將20 mL人工配制含聚丙烯酰胺無菌的煤泥水試樣和80 mL基礎培養(yǎng)基混合；采用接種環(huán)挑取單菌落進行真菌或細菌接種；置于溫度30 ℃、轉速120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。每隔24 h倒出20 mL上清液，加入20 mL人工配制含聚丙烯酰胺無菌的煤泥水試樣。5 d后，將2 mL真菌孢子懸液與細菌菌液分別接種于錐形瓶(含50 mL基礎培養(yǎng)基和150 mL人工配制含聚丙烯酰胺無菌的煤泥水試樣)。3 d后，每隔24 h倒出50 mL上清液，再加入50 mL人工配制含聚丙烯酰胺無菌的煤泥水試樣，持續(xù)7 d。

1.2 試驗材料

聚丙烯酰胺購自河南省鞏義市水處理材料公司，屬于陰離子型，分子量1 200萬，分子結構如圖2所示。煤泥水試樣取自淮南礦業(yè)集團望峰崗選煤廠的濃縮池溢流液，pH=7.2，煤泥水濃度為39.1 g/L，煤泥水中煤泥粒度組成及灰分見表1。由表1可知，粒徑小于45 μm顆粒占比近50%，灰分偏高，說明該煤泥水中含有大量細粒高灰煤泥。

圖2 陰離子型PAM分子結構

表1 煤泥粒度組成和灰分

煤泥水中煤泥的XRD分析圖譜如圖3所示，可知該煤泥水中礦物組成為高嶺石、石英、方解石、硬石膏、黃鐵礦和赤鐵礦等，其中高嶺石和石英親水性極強，是煤泥水難沉降的主要因素。為模擬實際選煤廠的聚丙烯酰胺，人工配置成濃度500 mg/L的含聚丙烯酰胺煤泥水試樣，滅菌后備用。

圖3 煤泥XRD分析圖譜

1.3 降解試驗

先將0～10 g/L葡萄糖和100 mL降解培養(yǎng)基添加至250 mL錐形瓶，將等體積混合的球紅假單胞菌懸液和黃孢原毛平革菌孢子懸液接種于錐形瓶，然后調pH至設定值，在一定溫度和轉速下搖床振蕩培養(yǎng)6 d，最后經6 000g高速離心10 min。取上清液采用淀粉-碘化鎘法[24]，在585 nm處測吸光度A。每次試驗平行進行3次，取平均值。試驗儀器為UV-5100紫外可見分光光度計。根據標準曲線計算降解后聚丙烯酰胺的濃度。標準曲線回歸方程為

y=0.013 29x-0.705 78，

(1)

式中，y為吸光度A；x為聚丙烯酰胺質量濃度，mg/L。

聚丙烯酰胺的降解率η為

(2)

式中，C0、Ct分別為降解前、后聚丙烯酰胺的質量濃度，mg/L。

1.4 降解產物

將降解前后的降解液經6 000g離心10 min，添加甲醇以去除無機鹽，取上清液于50 ℃真空干燥備用。經溴化鉀壓片，采用美國伯樂公司的BIO-RAD FTS3000型紅外光譜儀進行紅外光譜分析[13,16]。用黏度法[25]分別測定降解前后聚丙烯酰胺的黏均分子量，其中馬克-豪溫經驗公式為

[η]=KMα，

(3)

式中，K、α為經驗常數，K=4.75×10-3，α=0.80；[η]為特性黏度，mL/g；M為黏均分子量。

1.5 酶的提取與活性測定

將降解后的降解液經10 000 r/min離心10 min，取上清液30 mL分裝于3個錐形瓶；分別添加酒石酸緩沖液(pH=3)、丁二酸緩沖液(pH=4.5)和檸檬酸鹽緩沖液(pH=5)，振蕩提取1 h；經4 200 r/min離心10 min，取上清液經0.45 μmol濾膜過濾，得濾液備用[26-27]。

1)木質素過氧化物酶(Li P)：將濾液0.4 mL、0.1 mol/L酒石酸緩沖液1.5 mL、10 mmol/L黎蘆醇1.0 mL及10 mmol/L過氧化氫0.1 mL依次添加至小燒杯，在310 nm處測反應1 min前后吸光度的變化。一個酶活力(U)定義為每分鐘使1 μmol黎蘆醇氧化成黎蘆醛所需的酶量。

2)錳過氧化物酶(Mn P)：將濾液0.4 mL、0.05 mol/L丁二酸緩沖液2.0 mL、15 mmol/L MnSO40.5 mL及10 mmol/L過氧化氫0.1 mL依次添加至小燒杯，在240 nm處測定反應1 min前后吸光度的變化。一個酶活力(U)定義為每分鐘使1 μmol Mn2+氧化成Mn3+所需的酶量。

3)漆酶(Lac)：將濾液0.5 mL、0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液2.0 mL及1.0 mmol/L ABTS 0.5 mL依次添加至小燒杯，在420 nm處測定反應1 min前后吸光度的變化。一個酶活力(U)定義為每分鐘使1 μmol ABTS氧化成ABTS+所需的酶量。

2 結果與討論

2.1 單菌種與混合菌降解能力比較

為了比較單菌種與混合菌降解效果，在接菌量2 mL、葡萄糖濃度2 g/L、30 ℃、pH= 6和搖床轉速130 r/min反應條件下，設計了單菌種和混合菌對比試驗，結果如圖4所示?？芍蚣t假單胞菌、黃孢原毛平革菌和混合菌的降解率分別為24.9%、30.2%和34.3%，混合菌降解率最高。這是因為菌種之間的協同效應，能更有效降解底物聚丙烯酰胺[15]。因此，選擇混合菌作為后續(xù)試驗菌種。

圖4 單菌種與混合菌降解能力比較

2.2 葡萄糖濃度的影響

在接菌量2 mL、35 ℃、pH=6和搖床轉速130 rmin反應條件下，葡萄糖濃度對聚丙烯酰胺降解效果如圖5所示。葡萄糖是傳統的碳源，在該降解體系中作為共基質，低濃度的葡萄糖促進微生物降解。葡萄糖濃度過高時，微生物傾向于利用葡萄糖作為碳源，進而不利于聚丙烯酰胺的降解?？芍惶砑悠咸烟菚r，降解率僅為14.9%，此時培養(yǎng)基中沒有任何外加碳源，體系以聚丙烯酰胺為唯一碳源。葡萄糖濃度低于2 g/L時，隨著葡萄糖濃度的升高，降解率從14.9%升至35.9%，這是由于混合菌利用低濃度的葡萄糖作為共基質底物，共代謝促進降解[28]；另一方面，低濃度葡萄糖刺激混合菌分泌更高水平的降解酶[13]。葡萄糖濃度由2 g/L升至10 g/L，降解率下降至24.3%，這是由于混合菌利用過量的葡萄糖作為主要碳源，而不以聚丙烯酰胺為碳源去滿足微生物的生長和代謝[29]。因此，選2 g/L作為后續(xù)培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度。

圖5 葡萄糖濃度對聚丙烯酰胺降解的影響

2.3 環(huán)境條件對聚丙烯酰胺降解效果的影響

2.3.1溫度的影響

在接菌量2 mL、pH=6和搖床轉速130 r/min反應條件下，考察混合菌液降解體系在不同溫度下對聚丙烯酰胺的降解效果，如圖6所示。可知低于35 ℃時，隨溫度升高，降解率從23.2%升至35.9%，這是由于升高溫度會使反應速率常數變大，促進降解反應的進行；另一方面，在一定范圍內升高溫度會增強微生物新陳代謝，加快降解酶的分泌。溫度由35 ℃升至50 ℃時，降解率下降至9.8%，這是由于降解酶的本質是具有催化活性的蛋白質，溫度過高使酶變性失活[29]。因此，適宜溫度為35 ℃。

圖6 溫度對聚丙烯酰胺降解的影響

2.3.2初始pH的影響

在接菌量2 mL、35 ℃和搖床轉速130 r/min反應條件下，不同初始pH對降解體系聚丙烯酰胺降解效果的影響如圖7所示。可知初始pH由4增至6時，降解率從20.1%升至35.9%，這是由于pH過高或過低都會影響混合菌的生長，同時影響降解酶的活性。適宜的pH能保證混合菌生長快速和分泌酶的活性高，所以適宜的pH有利于降解[30]。初始pH增加至9時，降解率反而下降，這是由于在極端pH條件下，降解酶變性失活，代謝停止，生長量快速減少[31]。因此，最適初始pH為6。

圖7 初始pH對聚丙烯酰胺降解的影響

2.3.3接種劑量的影響

在35 ℃、pH=6和搖床轉速130 r/min下，不同接種劑量對聚丙烯酰胺降解效果如圖8所示。可知接種劑量從1 mL增至2 mL后，降解率從19.6%升至35.9%，這是因為增加接種劑量會縮短微生物生長的遲滯階段，從而快速進入指數增長階段，有利于底物的降解[30]。接種劑量增至5 mL時，降解率反而下降，這是由于過量的接菌量不利于微生物對營養(yǎng)物質的利用，增強了菌種間的競爭，導致降解效果下降。文獻[32]考察銅綠假單胞菌的接種量對聚丙烯酰胺降解的影響，呈現相似的降解趨勢。因此，最佳接種劑量為2 mL。

圖8 接種劑量對聚丙烯酰胺降解的影響

2.3.4搖床轉速的影響

試驗所用菌種是好氧菌，通過控制搖床轉速可以調節(jié)降解培養(yǎng)基中含氧量，搖床轉速越大，表明微生物生長的環(huán)境含氧量越大。在反應條件接菌量2 mL、35 ℃和pH=6下，搖床轉速對聚丙烯酰胺降解效果的影響如圖9所示。

由圖9可知，搖床轉速從70 r/min增至140 r/min時，降解率從22.8%上升至37.5%，這是由于降解培養(yǎng)基中含氧量的增加促進微生物的代謝，進而加快對聚丙烯酰胺的降解。搖床轉速從140 r/min增至160 r/min時，降解率幾乎不變，可知降解培養(yǎng)基中的含氧量達到飽和，不再增加。因此，最佳搖床轉速為140 r/min。

圖9 搖床轉速對聚丙烯酰胺降解的影響

2.4 多因素對聚丙烯酰胺降解效果的影響

2.4.1正交試驗

為考察多因素對聚丙烯酰胺降解效果的影響，采用正交試驗設計[33]。試驗因素水平見表2，試驗結果分析見表3。

表2 正交試驗因素和水平

表3 正交試驗結果分析

通過極差分析，因素影響順序為溫度>初始pH>接種劑量>搖床轉速。搖床轉速對降解效果影響最小，后續(xù)方差分析中作為誤差處理。最優(yōu)因素組合為A2B2C1D2，即溫度35 ℃、初始pH=6、接種劑量2 mL和搖床轉速140 r/min。試驗結果與單因素試驗最佳組合結果一致。

2.4.2方差分析

根據正交試驗可視化分析得到的數據，進一步分析變量。臨界F值表明數據的顯著性。計算各變量的F值，然后與臨界F值比較，具體見表4?？芍谠囼炓蛩厮椒秶鷥?，溫度對降解效果影響顯著，是主要的影響因素。

表4 方差分析

2.4.3試驗結果預測

采用Minitab軟件的預測田口結果功能，選取最優(yōu)水平組合A2B2C1D2進行預測，優(yōu)化結果預測見表5，可知最優(yōu)試驗組合的預測均值為37.1%，這與實際值37.5%相差不大，說明正交試驗正確。

表5 優(yōu)化結果的預測

2.5 混合菌以聚丙烯酰胺為氮源的生長結果

在接菌量2 mL、葡萄糖濃度2 g/L、35 ℃、pH=6和搖床轉速140 r/min的最優(yōu)試驗條件下，將混合菌接種于不添加酒石酸銨的降解培養(yǎng)基，與上述降解情況進行對比，結果如圖10所示。

圖10 聚丙烯酰胺作為唯一氮源的降解

由圖10可知在無外加氮源的條件下，隨著降解反應的進行，在6 d內從3.2% 升至33.1%，說明混合菌以聚丙酰胺作為唯一氮源進行降解。在相同條件下，添加酒石酸銨時降解率為37.5%，這可能因為添加少量酒石酸銨時，誘導混合菌分泌更多的生物酶，更高效催化降解聚丙烯酰胺[22-23]。繼續(xù)延長時間至10 d時，降解率幾乎不變，表明聚丙烯酰胺只能部分降解[13]。

2.6 降解產物紅外光譜

圖11 聚丙烯酰胺降解前后的紅外光譜

2.7 降解前后黏均分子量變化

聚丙烯酰胺是長鏈高分子聚合物，黏性與分子量、結構、水解等有關。其他條件不變時，采用黏性表征分子量。一般側鏈對聚合物分子量的影響很小，只有分子的主鏈斷裂才能引起分子量變化。對降解前后的聚丙烯酰胺進行黏均分子量測定，結果見表6?？芍到夂缶郾０返姆肿恿堪l(fā)生很大變化，這可能是由于混合菌分泌強氧化酶，將碳鏈主鏈氧化斷裂，混合菌利用聚丙烯酰胺作為碳源[34]。

表6 聚丙烯酰胺降解前后黏均分子量的變化

2.8 降解后酶活測定

對降解后的培養(yǎng)基進行酶活測定，結果如圖12所示?？芍到夂蟮呐囵B(yǎng)基存在木質素過氧化物酶(Li P)、錳過氧化物酶(Mn P)及漆酶(Lac)3種強氧化酶，酶活分別為6.73、12.09和16.48 U/mL，說明在Li P、Mn P和Lac等強氧化酶作用下，混合菌將聚丙烯酰胺分解成低聚物，導致分子量降低。

圖12 不同酶的活性

3 結 論

1)由于混合菌具有協同增效降解作用，其降解效果優(yōu)于單一菌種。球紅假單胞菌、黃孢原毛平革菌及混合菌的降解率分別為24.9%、30.2%和34.3%。葡萄糖作為共基質，低于2 g/L時，對聚丙烯酰胺的降解具有促進作用；高于2 g/L時，對聚丙烯酰胺的降解具有抑制作用。

2)單因素試驗與正交試驗相互驗證，得到的最佳組合為接種劑量2 mL、溫度35 ℃、pH=6、搖床轉速140 r/min。，此時聚丙烯酰胺的降解率達到37.5%。在試驗設計的因素水平范圍內，因素影響順序為溫度>初始pH>接種劑量>搖床轉速，溫度是主要的影響因素。

3)在最優(yōu)條件、不添加酒石酸銨時，降解率達33.1%，低于添加酒石酸銨的37.5%，說明添加少量酒石酸銨可促進微生物降解。紅外光譜證明混合菌以聚丙烯酰胺為氮源。黏均分子量及酶活測定表明，在混合菌分泌的胞外酶木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶等強氧化酶作用下，聚丙烯酰胺的碳主鏈氧化斷裂，為微生物生長提供碳源。