顧艷麗 ，劉秋晨，林 洋，劉 恩，李 娟，李志興，劉 艷,*

（1.大連三儀動物藥品有限公司，遼寧大連 116036；2.江蘇三儀科研質(zhì)量控制中心，江蘇邳州 221300）

在飼料中添加低于治療劑量的抗生素可以促進動物生長，提高飼料轉(zhuǎn)換效率，降低畜禽發(fā)病率和死亡率[1-2]，但長期添加抗生素所引起的耐藥菌株的抗藥性、動物源食品藥物殘留、對環(huán)境污染等已經(jīng)成為全球關(guān)注的問題[3]，禁止將飼用抗生素用于動物生產(chǎn)已成為必然趨勢。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號公告規(guī)定，自2020 年1 月1 日起退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種。

發(fā)酵中藥集合中藥、酶制劑、益生菌、發(fā)酵后產(chǎn)生新的有效物質(zhì)等眾多優(yōu)點，具有吸收快、藥效強、無毒副作用等特點[4-5]，成為一種極具潛力飼料添加劑，成為減抗替抗的重點研發(fā)內(nèi)容。研究已經(jīng)證實，本試驗選用的復方中藥發(fā)酵液可以替代抗生素治療由大腸桿菌O78 引起的禽大腸桿菌病[6-7]。本試驗旨在研究飲水中添加復方中藥發(fā)酵液對愛拔益加白羽肉雞的生長性能、腸道結(jié)構(gòu)和免疫功能的影響，為開發(fā)高品質(zhì)飼料添加劑提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 愛拔益加（AA）白羽肉雞購自大連普灣新區(qū)炮臺齊泰隆種雞養(yǎng)殖場；98%恩拉霉素購自南昌某藥業(yè)有限公司。復方中藥發(fā)酵液由穿心蓮、白頭翁、黃連、黃柏、木香、敗醬草和甘草按比例混合，于55℃干燥，含水量7%～13%，粉碎，按照1:15 的體積比加入75%乙醇水溶液進行提取，提取2 次，每次1 h，將中藥原料提取產(chǎn)物于4℃靜置24 h 后濃縮成含有1 g/mL 生藥量的藥液，得到復方中藥提取液。將枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母的活菌數(shù)量比按2:1:1.5:2 混合，得到種子液，在含有10%復方中藥提取物的培養(yǎng)基中接種種子液進行發(fā)酵，37℃下培養(yǎng)3 d，使發(fā)酵液中有效活菌數(shù)達到1.0×108CFU/mL，即為復方中藥發(fā)酵液[8]。4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗設計及飼養(yǎng)管理 選取1 日齡健康、體重相近的AA 肉雛雞270 只，隨機分成3 組，每組3 個重復，每個重復30 只。對照組飼喂基礎飼糧，抗生素組4 日齡開始飼喂基礎飼糧+5 mg/kg 恩拉霉素，中藥復方發(fā)酵液組飼喂基礎日糧并從4 日齡開始在半天的飲水中按肉雞體重添加1mL/kg 中藥復方發(fā)酵液。試驗期42 d，自由飲水。參照NRC（1994），并結(jié)合《肉雞飼養(yǎng)標準》（NY/T 33-2004）制定肉雞基礎飼糧[9]。基礎飼糧組成及營養(yǎng)成分見表1。試驗雞只采用復層式籠養(yǎng)，飼養(yǎng)管理和常規(guī)免疫均按《AA 肉仔雞飼養(yǎng)管理手冊》進行，每日觀察并記錄雞只健康狀況。

表1 肉雞基礎飼糧組成及營養(yǎng)成分（飼喂基礎）

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生長性能 按照試驗設計對各組1 日齡肉雞稱重，作為試驗初始體重。記錄每天喂料量和剩余量，分別在肉雞14、28、42 日齡禁飼12 h 后，進行空腹稱重作為試驗末期體重。計算各重復的平均日增重（ADG）、日均采食量（ADFI）和耗料增重比（F/G）[10]。

1.3.2 腸道結(jié)構(gòu) 分別于試驗期第14、28、42 天時，每重復選取3 只接近平均體重的肉雞，頸靜脈放血處死，取空腸中段腸組織1 cm 左右，用生理鹽水沖洗干凈，固定于10%的福爾馬林溶液，經(jīng)蘇木精-伊紅HE 染色，再用中性樹膠加蓋玻片封片，在光學顯微鏡下觀察，每個樣品選擇3 個容貌完整/走向平直的視野單元，每個試驗組取3 個樣品共9 個視野單元，對絨毛高度和隱窩深度進行測定，計算絨隱比（VH/CD）[11]。

1.3.3 免疫器官指數(shù) 分別于試驗期第28 和42 天時，每重復選取6 只接近平均體重的肉雞進行采樣，采樣前禁飼12 h，不禁水，分別采集胸腺、脾臟和法氏囊，剔除干凈表面結(jié)締組織和脂肪，精確稱量鮮重，計算免疫器官指數(shù)。

1.3.4 血清免疫球蛋白 分別于試驗期第28 和42 天時，每重復選取6 只接近平均體重的肉雞進行翅靜脈采血，收集的全血37℃靜置30 min 后，3 000 r/min 離心10 min，收集血清。采用ELISA 試劑盒測定血清中IgG、IgM、IgA 含量[12]。試劑盒購自江蘇科晶生物科技有限公司。

1.4 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進行整理，采用SPSS 20.0 軟件進行方差分析，結(jié)果以平均值±標準差表示。P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 復方中藥發(fā)酵液對肉雞生長性能的影響 由表2 可知，與對照組相比，1～14 d，飲水中添加復方中藥發(fā)酵液能夠顯著提高雛雞的體重、ADG 和ADFI，降低F/G（P＜0.05）；15～28 d，飲水中添加復方中藥發(fā)酵液對體重和ADG 無顯著影響，可降低ADFI 和F/G（P＜0.05）；29～42 d，飲水中添加復方中藥發(fā)酵液對肉雞體重、ADG、ADFI 和F/G 影響顯著，體重增加11.41%。與抗生素組相比，15～42 d，飲水中添加復方中藥發(fā)酵液降低了F/G（P＜0.05），體重增加7.96%。

2.2 復方中藥發(fā)酵液對肉雞腸道結(jié)構(gòu)的影響 由表3可知，與對照組比，飲水中添加復方中藥發(fā)酵液在1～14 d 能夠提高空腸絨毛高度和VH/CD、降低隱窩深度（P＜0.05），在15～28 d 能夠提高空腸VH/CD、降低隱窩深度（P＜0.05），在29～42 d 能夠提高空腸絨毛高度和VH/CD（P＜0.05），有降低隱窩深度的趨勢（P＞0.05）。與抗生素組相比，飲水中添加復方中藥發(fā)酵液在1～14 d 內(nèi)絨毛高度和隱窩深度差異顯著、VH/CD 差異不顯著，在15～42 d 絨毛高度、隱窩深度和VH/CD 差異均顯著。試驗組各組空腸絨毛完整性良好，絨毛排列整齊。

表2 復方中藥發(fā)酵液對肉雞生長性能的影響

表3 復方中藥發(fā)酵液對肉雞腸道形態(tài)的影響

2.3 復方中藥發(fā)酵液對肉雞免疫器官的影響 由表4 可知，28 日齡時，與對照組和抗生素組相比，復方中藥發(fā)酵液組的胸腺指數(shù)分別提高了13.94%、22.80%（P＜0.05），法氏囊指數(shù)分別顯提高了21.70%、32.99%（P＜0.05），脾臟指數(shù)差異不顯著。42 日齡時，與對照組和抗生素組相比，復方中藥發(fā)酵液組的胸腺指數(shù)分別提高了22.04%、43.75%（P＜0.05），法氏囊指數(shù)分別提高了21.88%、37.32%（P＜0.05）。脾臟指數(shù)全程差異不顯著。

表4 復方中藥發(fā)酵液對肉雞免疫器官指數(shù)的影響 mg/g

2.4 復方中藥發(fā)酵液對肉雞免疫球蛋白的影響 由表5 可知，28 日齡時，飲水中添加復方中藥發(fā)酵液組的IgG、IgM 和IgA 高于對照組和抗生素組（P＜0.05）；42 日齡時，復方中藥發(fā)酵液組的IgM 和IgA 高于對照組和抗生素組（P＜0.05），IgG 有提高趨勢（P＞0.05）。

表5 復方中藥發(fā)酵液對肉雞血清免疫球蛋白含量的影響 μg/mL

3 討 論

3.1 復方中藥發(fā)酵液對肉雞生長性能的影響 發(fā)酵中藥能夠增強肉雞的免疫力，提高腸道消化吸收功能，同時能夠補充腸道有益微生物，維持肉雞生產(chǎn)全過程處于健康狀態(tài)，降低F/G，提高肉雞整體生產(chǎn)性能[13]。本試驗以中獸醫(yī)的基礎理論為依據(jù)，選擇具有清熱解毒、燥濕止痢、行氣導滯作用的穿心蓮、黃連、白頭翁、木香等復方中藥[6]，選用多株產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶強的芽孢菌、產(chǎn)酸能力強并有一定抑菌作用的乳酸菌、產(chǎn)纖維素酶高的酵母菌等微生物作為目標菌，制成復方中藥發(fā)酵液。該復方中藥發(fā)酵液不僅能夠拮抗動物機體病原菌，增強機體免疫力和抗病能力[7]，而且能夠提高飼料利用率。中草藥中的多糖類活性物質(zhì)有助于提高畜禽的生長性能[14]；黃連素憑借抑菌、抑炎、抗氧化等多方面的生物學功能，在維持動物機體健康，尤其提高禽類生產(chǎn)性能方面有顯著效果[15]；乳酸菌作能夠競爭性的定植于家禽消化道，分泌多種消化酶，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收和飼料轉(zhuǎn)化率[16]。Gu 等[17]研究表明，使用益生菌發(fā)酵中藥不僅能夠治療由大腸桿菌引起的腹瀉，還可以不同程度地促進生長。本試驗結(jié)果表明，與對照組相比，復方中藥發(fā)酵液對肉雞中期的ADG 影響不顯著，但在出欄時（42 日齡）增重11.39%，F(xiàn)/G 降低7.85 %，可顯著提高雞的ADG、ADFI。各菌種在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等[18]物質(zhì)對中草藥的細胞進行破壁，使有效物質(zhì)迅速釋放出來；木香行氣健脾，敗醬草多糖和甘草多糖提高ADG，促進生長；枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和植物乳桿菌促生長，改善腸道菌群環(huán)境[19]，提高飼料轉(zhuǎn)化率。

3.2 復方中藥發(fā)酵液對肉雞腸道結(jié)構(gòu)的影響 腸道結(jié)構(gòu)包括絨毛高度、隱窩深度和VH/CD，是機體對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的關(guān)鍵，常常被用做反映腸道健康的重要指標[20]。小腸絨毛作為肉雞消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的特有部位，絨毛高度增高，食糜吸收面積就會增大，吸收養(yǎng)分的能力就越強。腸道隱窩是絨毛基部的上皮細胞下陷至固有層內(nèi)形成的管狀結(jié)構(gòu)，隱窩深度反映細胞生成率，隱窩變淺，成熟細胞數(shù)量增加，分泌功能也隨之增強，腸道發(fā)育越好[21]。VH/CD 綜合反映小腸絨毛吸收功能，比值越高，說明絨毛對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力增強。夏億等[22]研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌能改善感染肉雞28 d十二指腸和空腸腸道形態(tài)的發(fā)育。凝結(jié)芽孢桿菌有產(chǎn)生孢子的能力，在復雜的胃腸道環(huán)境中可順利到達腸道，通過產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、酶和營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境，增強腸道消化和吸收功能，緩解損傷保護腸黏膜的完整性，促進腸絨毛的發(fā)育。張志鵬等[23]發(fā)現(xiàn)在基礎飼糧中添加中草藥提取物可以顯著增加肉雞的小腸絨毛高度和隱窩深度。陳家祥等[24]在基礎飼糧中添加地衣芽孢桿菌飼喂麻羽肉雞，結(jié)果表明地衣芽孢桿菌有保護腸黏膜和促進絨毛生長的作用，且隨著添加量的增加效果有提高的趨勢。本試驗結(jié)果表明，在試驗組飲水中添加復方中藥發(fā)酵液可明顯促進小腸黏膜絨毛的生長發(fā)育，改善消化道黏膜結(jié)構(gòu)與形態(tài)，進而增加肉雞對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力。一方面可能是組方中穿心蓮能促進肉雞腸絨毛生長，降低隱窩深度，使腸壁變薄，讓營養(yǎng)物質(zhì)更容易被吸收[25]。另一方面酵母發(fā)酵物中的核苷酸能促進腸道上皮細胞增殖發(fā)育，促進腸道形態(tài)改變[26]；中草藥經(jīng)過微生物發(fā)酵后可能直接或間接刺激肉雞的腸道菌群，與肉雞腸道黏膜上皮細胞結(jié)合，在腸道內(nèi)形成一層防護膜，進而發(fā)揮改善腸道組織形態(tài)的作用[27]。

3.3 復方中藥發(fā)酵液對肉雞免疫功能的影響 機體免疫器官指數(shù)在一定程度上反映機體的免疫功能狀態(tài)和免疫機能的高低以及抗感染能力，是衡量機體免疫功能的初步指標，免疫器官的發(fā)育狀況直接反映出機體的免疫應答水平[28]。胸腺、脾臟和法氏囊分別是家禽中樞免疫、外周免疫和體液免疫的主要器官，對機體的細胞免疫和體液免疫均發(fā)揮重要功能[29]。免疫器官細胞生長發(fā)育及分化會使免疫器官指數(shù)增加，而免疫抑制會使免疫器官指數(shù)降低。郭宏偉等[30]研究表明，在肉雞日常飲水中添加發(fā)酵扶正解毒口服液可顯著提高其肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)。張桂枝等[31]研究表明，飼料中添加一定劑量的復方中藥混菌發(fā)酵劑可顯著提高肉雞胸腺、腔上囊和脾臟指數(shù)，促進肉雞淋巴器官的生長發(fā)育和迅速成熟。徐亞慧等[32]研究發(fā)現(xiàn)在飲水中添加4 mL/L 馬齒莧發(fā)酵液可以提高雛雞免疫器官指數(shù)，氟苯尼考抗生素明顯抑制了免疫器官的發(fā)育。鄧文瓊[25]研究表明，飼糧中添加穿心蓮超微粉能夠提高三黃雞的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)，且所有指標與抗生素相當或高于抗生素。Li 等[33]研究表明，玉屏風散可以通過調(diào)節(jié)非特異性和細胞免疫來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用并增強免疫力。本試驗在飲水中添加復方中藥發(fā)酵液組的免疫器官指數(shù)均顯著高于對照組和抗生素組，說明中藥復方經(jīng)過復合菌劑發(fā)酵后顯著增加了肉雞胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)，但對脾臟指數(shù)影響不顯著；同時與對照組相比，抗生素組抑制了胸腺和法氏囊的發(fā)育。隨著抗生素對雞只的影響，日齡越大發(fā)酵中藥對免疫器官指數(shù)的影響越顯著，復方中藥發(fā)酵液組和抗生素組相比，28 日齡時胸腺指數(shù)增加22.8%，43 日齡時胸腺指數(shù)增加43.75%，說明該復方中藥發(fā)酵液促進了胸腺發(fā)育，有利于提高機體的細胞免疫機能。一方面可能是由于組方中的黃連素等活性成分不僅可以抑制病原微生物的生長，在調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮重要作用[34]，調(diào)節(jié)血清IgG，并參與肉雞體液免疫[35]；另一方面中藥經(jīng)過微生物的轉(zhuǎn)化，大分子活性物質(zhì)轉(zhuǎn)變成易吸收的小分子物質(zhì)，更有助于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收?？梢?，該復方中藥發(fā)酵液可提高抗病和免疫能力。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果顯示，由穿心蓮、白頭翁、敗醬草、黃連等中藥組成的復方中藥，經(jīng)過植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌等菌株發(fā)酵后的復方中藥發(fā)酵液，按肉雞體重將1mL/kg 發(fā)酵液添加到半天的飲水中可顯著提高雞的ADG、ADFI，降低F/G，改善腸道結(jié)構(gòu)、提高免疫功能。