林興濤，藍芳仁，孫從佼，楊 寧，李俊英

（中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，北京 100193）

禽肉、禽蛋等家禽產(chǎn)品具有豐富的營養(yǎng)物質，可為人類提供不可或缺的動物蛋白，與肉、奶素有國民營養(yǎng)“金三角”之稱。但當前我國養(yǎng)殖業(yè)因場址布局偏遠、生產(chǎn)環(huán)境封閉等因素而出現(xiàn)勞動力緊缺或人工成本昂貴的現(xiàn)象[1-2]；對種雞繁殖采用人工輸精，尤其是大型父母代種雞場，不僅在很大程度上增加人力成本，而且會對母雞生殖道造成一定的機械損傷損害，甚至發(fā)生疫病的交叉感染，對生物安全十分不利；此外，環(huán)保問題與動物福利問題也給養(yǎng)殖業(yè)施加重壓[3]，促進蛋雞養(yǎng)殖模式轉變。在此背景下，蛋種雞本交籠養(yǎng)模式作為一種新的養(yǎng)殖模式，迎來巨大的發(fā)展契機。相比于人工輸精模式，蛋種雞本交籠養(yǎng)模式更利于節(jié)約人工成本及蛋種雞飼養(yǎng)管理自動化、標準化和福利化的實現(xiàn)。

目前，在本交籠養(yǎng)中種雞死淘率較高、公母配比不當?shù)葐栴}普遍存在，而公雞遺傳貢獻率與公母配比是影響本交籠養(yǎng)種雞飼養(yǎng)效益的重要因素。因此，本實驗通過基于28 個微衛(wèi)星位點的親緣鑒定技術來度量本交籠中種公雞的遺傳貢獻率并對公母配比進行研究，同時檢測公雞血清激素水平及精液品質，進一步探究這些指標與公雞遺傳貢獻率的相關性，對提高種公雞利用率、種蛋受精率以及降低飼養(yǎng)成本等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗群體 實驗所選2 種本交籠養(yǎng)種雞群體分別來自江西華裕家禽育種有限公司與四川正鑫農(nóng)業(yè)科技有限公司。其中，前者所選200 只281 日齡海蘭褐父母代種雞，飼養(yǎng)在2 組星海泰本交籠（I 型）中，單組籠型規(guī)格：長×寬×高為4.80 m×1.20 m×1.20 m，每組養(yǎng)100只種雞，公母配比為1:9，公雞編號分別為HA-F01 至HA-F10，HB-F01 至HB-F10；后者所選200 只241 日齡羅曼粉父母代種雞，飼養(yǎng)在4 組大牧人本交籠（II 型）中，單組籠型規(guī)格：長×寬×高為2.40 m×1.20 m×1.20 m，每組養(yǎng)50 只種雞，公母配比為1:9，公雞編號分別為LA-F1 至LA-F5，LB-F1 至LB-F5，LC-F1 至LC-F5及LD-F1 至LD-F5。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗樣本采集 連續(xù)5 d 每天分別收集實驗組每組本交籠里所產(chǎn)的種蛋，孵化至5 胚齡將其逐個打破并收集胚胎，收集的每個胚胎分別置于盛有400 μL PBS的1.5 mL 離心管中。

使用一次性2 mL 采血針于實驗組每只雞右翅下進行靜脈采血，每只母雞采集血液約1.5 mL 置于2 mL抗凝管中，每只公雞采集血液約2 mL，分裝0.5 mL 于2 mL 抗凝管中，余下1.5 mL 置于2 mL 離心管中，并呈45～60°角于室溫下放置1 h 后，8 000 r/min 離心20 min，吸取上層血清于1.5 mL 離心管。所有樣品-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA 提取與PCR 反應 采用北京天根生化科技有限公司的組織及血液DNA 提取試劑盒提取樣品基因組DNA，并統(tǒng)一稀釋至80～100 ng/μL。依據(jù)文獻[4-5]中的28 個微衛(wèi)星位點確定引物，送往北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成，并在引物上游序列5'端添加相應的熒光標記（表1）。采用溫度梯度PCR 技術在引物退火溫度±5℃范圍內確定最佳退火溫度，對所有DNA 樣本在每對引物最佳退火溫度下進行PCR 反應。反應體系15 μL：DNA 模板1 μL（濃度為80～100 ng/μL）、上下游 引物各0.6 μL（終濃度 為0.2 μmol/L）及2×EasyTaq?PCR SuperMix 7.5 μL，ddH2O 定容至15 μL。將PCR 產(chǎn)物按引物序號順序每3 對進行混勻，置于96孔板中，其中第19、20 號2 對引物混合，27 號與28號2 對引物混合。將混勻的PCR 產(chǎn)物送往北京擎科新業(yè)生物技術有限公司進行毛細管電泳。

1.2.3 公雞血清激素水平檢測 為探究公雞血清中的甲狀腺激素及生殖激素對公雞遺傳貢獻率的影響，本實驗對公雞血清進行采集，并送往北京華英生物技術研究所，采用放免試劑盒法測定血清中的三碘甲狀腺原氨酸（T3）、促甲狀腺激素釋放激素（Thyrotropin Releasing Hormone，TRH）、促卵泡素（Follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）、促黃體素（Luteinizing Hormone，LH）、促甲狀腺素受體（Thyrotmpin Receptor，TSHR）及睪酮（TESTO，T）含量。

表1 文獻中28 個微衛(wèi)星位點信息[4-5]

1.2.4 公雞精液品質檢測 公雞的精液品質主要包括采精量、精子密度及精子活力3 項指標。公雞精子活力依據(jù)顯微鏡視野中呈直線前進運動的精子數(shù)所占精子總數(shù)的百分比進行評價，采用十級評定方法；精子密度測定采用血球計數(shù)板計數(shù)法。將采精量、精子密度與精子活力3 項指標折算成有效精子數(shù)，作為綜合指標來評價公雞精液品質。

2.1 統(tǒng)計分析 使用軟件GeneMarker v2.2.0 對毛細管電泳峰圖進行基因型數(shù)據(jù)整理；使用軟件Cervus v3.0 進行遺傳多樣性分析及親緣鑒定。所有數(shù)據(jù)通過Excel 2016進行初步處理后利用R 軟件進行數(shù)據(jù)分析及可視化。

2 結果與分析

2.1 本交籠群體遺傳多樣性及微衛(wèi)星親緣鑒定效率 在I 型本交籠中，28 個位點中有2 個純合位點，26 個雜合位點，共檢測到104 個等位基因，平均等位基因數(shù)為3.71；平均多態(tài)信息含量與期望雜合度分別為0.46、0.52；無效等位基因數(shù)介于-0.09～0.07。在II 型本交籠中，28 個位點均為雜合位點，共檢測到158 個等位基因，平均等位基因數(shù)為4.16；平均多態(tài)性信息含量與期望雜合度分別為0.51、0.54；無效等位基因數(shù)介于-0.07～0.08。結果表明每個微衛(wèi)星位點在2 類本交籠群體遺傳上均有不同程度的變異，可用于遺傳學相關的分析。使用軟件Cervus v3.0 進行親子鑒定，置信度設為95%，I 型本交籠群體中，累計排除概率（NE-1P）達到99.63%，HA、HB 組鑒定成功率分別為96.75%、98.18%。II 型本交籠群體中，累計排除概率幾乎達到100%，鑒定成功率均為100%。

2.2 本交籠中公雞遺傳貢獻率 從圖1 可以看出，在I型本交籠HA、HB 組中，各公雞在后代數(shù)量上存在一個明顯排序，累計遺傳貢獻率曲線呈上凸弧形，表明邊際遺傳貢獻率逐漸減小，即每增加1 只公雞，所帶來的遺傳貢獻率增量逐漸減小。

圖1 2 組I 型本交籠公雞遺傳貢獻率

在II 型本交籠中，如圖2 所示，4 組公雞在遺傳貢獻率上均存在一個明顯的排序，在LA 組中，編號為LA-F3 的公雞其遺傳貢獻為0，而在LB、LC、LD 3 組中，前4 只高遺傳貢獻的公雞對遺傳總量的貢獻和達到90% 左右。2 類本交籠中，各組內公雞在遺傳貢獻上均存在較大變異，尤其是在高遺傳貢獻率的公雞與低遺傳貢獻率的公雞之間差異極顯著，高者比低者高出150%～400%。

圖2 4 組II 型本交籠公雞遺傳貢獻率

2.3 公雞遺傳貢獻率相關指標特性 運用Spearman 法對II 型本交籠中公雞遺傳貢獻率與其有效精子數(shù)、血清激素水平進行相關性分析，結果如圖3 所示。公雞遺傳貢獻率與公雞有效精子數(shù)及血清中的FSH、T3水平相關性較高，相關系數(shù)分別為0.79、0.8 與-0.8（P值均小于0.05)。因此，在生產(chǎn)實踐中，可以將公雞精液品質與血清中FSH 及T3含量相結合，來評價公雞遺傳貢獻率，據(jù)此對低遺傳貢獻率的公雞予以淘汰。

圖3 II 型本交籠公雞遺傳貢獻率與有效精子數(shù)及血清激素水平相關系數(shù)矩陣

2.4 本交籠公母雞配比 為探究本交籠中不同公母配比對種蛋受精率的影響，實驗根據(jù)II 型本交籠中各組公雞遺傳貢獻率排序結果，在LA、LD 2 組各剔除2 只低遺傳貢獻率的公雞，LB、LC 2 組各剔除1 只低遺傳貢獻率的公雞。如圖4 所示，在各組剔除公雞之前每組各收蛋2 d（垂線左邊），剔除公雞之后每組本交籠各收蛋10 d（垂線右邊），在剔除公雞之后，每組種蛋受精率均有所波動，在第6 天之后逐漸趨于平穩(wěn)。

圖4 4 組II 型本交籠種蛋受精率變化

將4 組本交籠剔除公雞前的2 d 種蛋受精率作為5 只公雞組，將LB、LC 2 組中后5 d 種蛋受精率作為4 只公雞組，并將LA、LD 2 組中后5 d 種蛋受精率作為3 只公雞組，方差分析各組種蛋受精率差異并使用TukeyHSD 方法進行多重比較，結果如圖5 所示。公雞數(shù)為3 的組與公雞數(shù)為4 或5 的組間P值分別為0.003 7與0.000 12，而公雞數(shù)為4 的組與公雞數(shù)為5 的組組間P值為0.289。結果表明，在II 型本交籠中剔除最低遺傳貢獻率的1 只公雞后，公母配比由1:9 提高到1:11，種蛋受精率略有下降，但在統(tǒng)計學上并不具有顯著性；剔除2 只低遺傳貢獻率的公雞后，公母配比提高到1:15，種蛋受精率下降極顯著（P＜0.001），但仍能維持在90%左右。

圖5 II 型本交籠中不同公母配比下種蛋受精率比較

3 討 論

3.1 微衛(wèi)星應用于親緣關系鑒定效率分析 使用一組微衛(wèi)星遺傳標記在封閉小群體中進行親子鑒定時，隨著代數(shù)的變化鑒定效率會有所下降[6]，盡管本實驗所選雞群樣本均被單組本交籠分成若干封閉小群體，但所選后代均為子一代，對鑒定效率影響不大，而且在親本基因多樣性較低時可通過增加適量的微衛(wèi)星位點來提高親子鑒定的準確性[7]。本實驗選擇28 個微衛(wèi)星位點，在2 類本交籠群體中鑒定效率較好。2 組I 型本交籠群體鑒定成功率分別為96.75% 與98.18%；4 組II型本交籠群體鑒定成功率均為100%，均高于I 型本交籠，可能是因為品種差異，微衛(wèi)星標記在近緣品種間具有很好的遷移性，同時也會表現(xiàn)出不同程度的變異[8]。微衛(wèi)星位點的多態(tài)性決定親緣關系鑒定效率[9]，28 個微衛(wèi)星位點在II 型本交籠群體中均為雜合狀態(tài)，而在I 型本交籠群體中有2 個位點為純合狀態(tài)，多態(tài)性有所下降。使用似然值作為親子鑒定依據(jù)時，其中一個假設前提就是所選標記位點應相互不連鎖，遵循哈代溫伯格平衡。在2 類本交籠群體中，均有一些微衛(wèi)星位點顯著偏離哈代溫伯格平衡，但這并不代表所選位點不適用于基于最大似然法的親子鑒定分析，這是因為所選樣本均是閉鎖繁育群體，長期育種選擇導致純系雞遺傳多樣性下降。因此，本實驗所選的28 個微衛(wèi)星位點具有較好的鑒定效率，為后續(xù)對公雞遺傳貢獻率的準確分析奠定基礎。

3.2 公雞遺傳貢獻率與相關指標特性分析 本實驗發(fā)現(xiàn)II 型本交籠中公雞遺傳貢獻率與血清中FSH 與T3含量分別呈高度正相關與高度負相關，相關系數(shù)分別為0.8與-0.8?！跋虑鹉X-垂體-性腺”軸在調節(jié)公雞性激素分泌方面具有重要作用，F(xiàn)SH 由垂體神經(jīng)分泌細胞所分泌，作用于支持細胞，對睪丸的內分泌功能具有直接的調節(jié)作用[10]。劉立文等[11]在研究蜂花粉對公雞血漿中促性腺激素的影響時發(fā)現(xiàn)，蜂花粉能夠提高血漿中FSH濃度，從而促進睪酮分泌，可見正常的高水平FSH 能夠促進公雞精子的生成；在本實驗中，血清中FSH 水平與T 水平相關系數(shù)為0.2，公雞遺傳貢獻率與FSH 相關系數(shù)為0.8，本實驗結果與劉立文等[11]的研究結果相一致。血清FSH 水平可能通過調節(jié)公雞精子的生成來影響公雞遺傳貢獻率，F(xiàn)SH 經(jīng)垂體分泌后，通過體液運輸作用于支持細胞，能夠促進生精上皮細胞的分裂，從而刺激精原細胞增殖，并促進機體合成雄激素結合蛋白，該蛋白是精子生成過程中的必須物質，可影響血液中T濃度?？梢?，血清FSH 水平可以作為衡量公雞遺傳貢獻率的重要指標。秦緒光[12]研究發(fā)現(xiàn)公雞精液品質與血漿T、LH、FSH 濃度顯著正相關，并認為這些激素可直接用于公雞繁殖能力的判別，該結論與本實驗結果基本一致。

T3是甲狀腺激素（TH）的主要形式之一，在血液中呈游離狀態(tài)，作用于機體各處組織，可促進機體新陳代謝，提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性。臨床研究表明，甲狀腺激素水平偏高會伴隨易激惹等情緒問題，繼而出現(xiàn)沖動控制障礙[13]。精神分裂癥患者的攻擊行為與血清中的T3及睪酮含量有關[14]，而T3可能參與了情感反應的激活[15]。本實驗中，具有較強斗性的公雞其后代卻不是最多的，斗性最弱的公雞的后代卻是最少的，因此，血清T3水平可能通過調控公雞的斗性行為而影響公雞的遺傳貢獻率，其詳細機制還需進一步探究。公雞遺傳貢獻率與公雞精液品質相關系數(shù)為0.79，可見公雞遺傳貢獻率受血清激素水平及精液品質的雙重影響。在生產(chǎn)實踐中，可根據(jù)公雞血清中FSH、T3水平及精液品質來綜合判別公雞的遺傳貢獻率，從而剔除生產(chǎn)性能較低的公雞，降低公雞飼養(yǎng)數(shù)量。

4 結 論

本實驗結果顯示，在本交籠養(yǎng)模式中，同一籠內不同公雞的遺傳貢獻率差異顯著；可根據(jù)公雞精液品質、血清中FSH 及T3水平綜合判定，剔除低遺傳貢獻率的公雞，選留高繁殖性能的公雞，從而提高本交籠中公母配比到1:10 以上，降低飼養(yǎng)成本。