郝新宇，王彥剛，田雪嬌

化濁解毒方對慢性萎縮性胃炎大鼠Hippo信號通路相關(guān)蛋白RASSF1A、SAV1、MST2表達(dá)的影響

郝新宇1，王彥剛2，田雪嬌2

1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200； 2.河北中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河北 石家莊 050011

觀察化濁解毒方對慢性萎縮性胃炎（CAG）大鼠Hippo信號通路哺乳動(dòng)物不育系20樣激酶2（MST2）、RAS相關(guān)區(qū)域家族亞型A（RASSF1A）、含WW結(jié)構(gòu)域的人同源重組蛋白1（SAV1）表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。采用聯(lián)合造模法制備CAG大鼠模型，成模大鼠隨機(jī)分為模型組、維酶素組和化濁解毒方高、中、低劑量組，每組10只，同時(shí)設(shè)正常組10只。正常組和模型組給予蒸餾水灌胃，維酶素組給予維酶素混懸液灌胃，化濁解毒方高、中、低劑量組給予相應(yīng)劑量藥液灌胃，連續(xù)12周。HE染色觀察大鼠胃黏膜組織病理變化，RT-qPCR和Western blot分別檢測大鼠胃黏膜組織RASSF1A、SAV1、MST2 mRNA和蛋白的表達(dá)。與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜組織RASSF1A、SAV1、MST2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，化濁解毒方高、中劑量組和維酶素組大鼠胃黏膜組織RASSF1A、SAV1、MST2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高（＜0.05），其中化濁解毒方高劑量組升高最明顯。化濁解毒方具有干預(yù)CAG大鼠和延緩癌變進(jìn)展的作用，其機(jī)制可能與上調(diào)模型大鼠抑癌基因RASSF1A、SAV1、MST2的表達(dá)相關(guān)。

化濁解毒方；慢性萎縮性胃炎；Hippo信號通路；RAS相關(guān)區(qū)域家族亞型A；含WW結(jié)構(gòu)域的人同源重組蛋白1；哺乳動(dòng)物不育系20樣激酶2；大鼠

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是以胃黏膜固有腺體萎縮、數(shù)量減少、排列紊亂、黏膜層變薄為主要表現(xiàn)的一種慢性消化系統(tǒng)疾病，為胃癌前狀態(tài)[1]，其癌變率高，嚴(yán)重威脅人類健康。西醫(yī)對本病尚無有效治療方法，中醫(yī)治療本病積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，療效滿意[2-4]，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。Hippo信號通路主要參與細(xì)胞在發(fā)育器官中的增殖、分化和遷移[5]。有報(bào)道，Hippo信號通路參與胃癌、食管鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤進(jìn)展過程[6-7]。Hippo信號通路重要抑癌基因哺乳動(dòng)物不育系20樣激酶2（mammalian sterile 20-like kinase 2，MST2）、RAS相關(guān)區(qū)域家族亞型A（ras association domain family l A，RASSF1A）、含WW結(jié)構(gòu)域的人同源重組蛋白1（salvador homolog 1，SAV1）等在癌細(xì)胞的生長增殖、轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。本課題組前期研究均顯示化濁解毒方是治療CAG的有效方劑，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制可能與Hippo信號通路有關(guān)[8-11]。本實(shí)驗(yàn)觀察化濁解毒方對CAG大鼠Hippo信號通路相關(guān)蛋白RASSF1A、SAV1、MST2表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

70只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號SCXK（冀）2013-1-003。飼養(yǎng)于溫度20～25 ℃、相對濕度40%～70%環(huán)境，光照12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

化濁解毒方（茵陳15 g，黃芩12 g，黃連12 g，藿香9 g，佩蘭9 g，白花蛇舌草15 g，半邊蓮15 g，半枝蓮15 g，板藍(lán)根15 g，苦參10 g，絞股藍(lán)15 g），飲片由河北省中醫(yī)院中藥房提供，該院煎藥室煎制，煎煮2次，各50 min，將2次煎液混勻濃縮為含原藥材2.8、1.4、0.7 g/mL藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜谆趸鶃喯趸遥∕NNG），東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號NH8JH-LE；鹽酸雷尼替丁膠囊，石家莊四藥有限公司，批號LN16050402；維酶素膠囊，德州博成制藥有限公司，批號W20151003。

1.3 主要試劑與儀器

Western LightningTMChemiluminescence Reagent，美國PerkinElmer，貨號NEL103001EA；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗，英國Abcam，貨號ab6721；HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗，英國Abcam，貨號ab6728；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，日本Takara，貨號2641A；RNA酶抑制劑，日本Takara，貨號D2310C；SYBR Premix Ex Taq試劑盒，日本Takara，貨號DRR041A；RASSF1A 多克隆抗體，美國Santa，貨號sc-58470；SAV1多克隆抗體，美國Santa，貨號sc-374366；MST2多克隆抗體，美國Proteintech，貨號66637-1-Ig。HQ-350XT型顯影、定影設(shè)備（蘇州虎丘影像設(shè)備有限公司），SuperRX感光膠片（日本FUJIFILM公司），TS-1型脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），DYCZ-24DN型垂直電泳裝置（北京六一儀器廠），VE-386型轉(zhuǎn)移電泳槽（北京原平皓生物技術(shù)有限公司），5415D型離心機(jī)（德國Eppendorf公司），Real-Time PCR擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 分組、造模和給藥

實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)抽取12只大鼠作為正常組，余58只大鼠作為實(shí)驗(yàn)組。參照聯(lián)合造模法[12-13]制備CAG大鼠模型。0.04 g/mL MNNG溶液自由飲用，結(jié)合隔日禁食法，空腹當(dāng)日予0.003 g/mL雷尼替丁溶液灌胃。造模20周后，隨機(jī)抽取2只行胃組織病理觀察，以胃黏膜層變薄，固有腺體減少，排列紊亂，上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，表明造模成功。再將實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為模型組、維酶素組和化濁解毒方高、中、低劑量組，每組10只。正常組和模型組大鼠每日給予蒸餾水灌胃，維酶素組每日給予維酶素（0.06 g/kg）混懸液灌胃，化濁解毒方高、中、低劑量組（中藥高、中、低劑量組）按28、14、7 g/kg分別給予化濁解毒方藥液灌胃，給藥體積10 mL/kg，連續(xù)12周。

1.5 病理觀察

第12周末，實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉處死并取材。將組織切片置于二甲苯Ⅰ5 min，二甲苯Ⅱ5 min，梯度乙醇脫水，蘇木素染色10 min，PBS沖洗，10%鹽酸酒精分色3～5 s，PBS沖洗，置于1%伊紅染液2 min，PBS沖洗，梯度乙醇脫水，中性樹脂封片。鏡下觀察胃黏膜組織病理變化。

1.6 RT-qPCR檢測胃黏膜組織RASSF1A、SAV1、MST2 mRNA表達(dá)

按照試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄條件：65 ℃、10 min，42 ℃、1 h，75 ℃滅活10 min。引物序列見表1。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量，ΔΔCt＝（Ct待測組目的基因－Ct待測組內(nèi)參基因）－（Ct對照組目的基因－Ct對照組內(nèi)參基因）。

表1 各基因PCR引物序列

基因名稱引物序列產(chǎn)物長度/bp RASSF1A上游：5’- GCACGTTCTGTCACGAACAC-3’ 92 下游：5’-AGAGTGCAAACTTGCGAGGA-3’ SAV1上游：5’-CCTCGGGAATACGGCTCATC-3’ 78 下游：5’-TCGGGAACCAGAGTCTCCAT-3’ MST2上游：5’-ACAGCACCATGCTAGAGTCG-3’100 下游：5’-TGGGGTGACGTTGCATTTCT-3’ GAPDH上游：5’-TGGCCTCCAAGGAGTAAGAAAC-3’ 69 下游：5’-GGCCTCTCTCTTGCTCTCAGTATC-3’

1.7 Western blot檢測胃黏膜組織RASSF1A、SAV1、MST2蛋白表達(dá)

提取并測定胃組織蛋白含量，取適量蛋白樣品上樣，電泳，4 ℃、350 mA轉(zhuǎn)膜2 h，置于含RASSF1A（1∶500）、SAV1（1∶500）和MST2（1∶500）一抗的Blotto溶液，4 ℃孵育過夜，TBST沖洗5 min×4次，二抗孵育1.5 h，TBST洗5 min×4次，ECL化學(xué)發(fā)光顯色液曝光，采用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行分析。計(jì)算每個(gè)目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參（GAPDH）條帶灰度值的比值，得校正后蛋白相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 胃黏膜形態(tài)變化

肉眼觀察，正常組大鼠后胃胃黏膜呈暗紅色，黏膜光滑、有光澤，可見規(guī)則排列黏膜皺襞（見標(biāo)記1），前胃胃黏膜較薄，呈白色或淡粉色，黏膜光滑，皺襞排列整齊（見標(biāo)記2）；模型組大鼠后胃胃黏膜呈淡紅色，局部黏膜發(fā)白，光澤度差，黏膜皺襞減少（見標(biāo)記3），前胃胃黏膜增厚，呈灰白色，表面粗糙，存在顆粒狀隆起，黏膜皺襞消失（見標(biāo)記4）；各給藥組大鼠胃黏膜顏色、光澤度、皺襞排列均有所改善，中藥高劑量組胃黏膜改善最明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜形態(tài)

2.2 病理觀察結(jié)果

正常組大鼠胃黏膜厚度正常，上皮細(xì)胞完整，腺體排列整齊，數(shù)量適中，無充血、水腫，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠胃黏膜變薄，上皮細(xì)胞壞死、脫落，固有腺體減少，排列紊亂，胃小凹延長，大量炎性細(xì)胞浸潤；中藥高劑量組大鼠胃黏膜病理改善最明顯，表現(xiàn)為黏膜厚度適中，上皮細(xì)胞較完整，腺體排列較整齊，數(shù)量適中，充血、水腫減輕；中藥中劑量組和維酶素組大鼠胃黏膜部分改善，中藥低劑量組大鼠胃黏膜改善不明顯。見圖2。

2.3 化濁解毒方對模型大鼠胃黏膜RASSF1A、SAV1、MST2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜RASSF1A、SAV1、MST2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，化濁解毒方高、中劑量組和維酶素組大鼠胃黏膜RASSF1A、SAV1、MST2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高（＜0.05），中藥高劑量組升高最明顯。結(jié)果見表2、圖3。

表2 各組大鼠胃黏膜組織RASSF1A、SAV1、MST2 mRNA和蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

注：A.正常組；B.模型組；C.中藥高劑量組；D.中藥中劑量組；E.中藥低劑量組；F.維酶素組

3 討論

CAG是正常胃黏膜向胃癌轉(zhuǎn)化過程中的重要階段，屬中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”范疇。研究表明，本病發(fā)病機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡、炎癥因子、基因的異常表達(dá)及幽門螺桿菌感染等有關(guān)[14]。CAG多因濕熱濁毒損傷胃絡(luò)，以致清陽不升，濁氣不降，脾胃運(yùn)化失職，津液輸布失司，腺體失于濡養(yǎng)，終而萎縮。本研究所用化濁解毒方為王彥剛教授治療CAG經(jīng)驗(yàn)方，該方清熱利濕、化濁解毒，以清熱利濕之茵陳、黃連、黃芩為君藥，芳香化濕和胃之藿香、佩蘭為臣藥，佐以清熱燥濕解毒之白花蛇舌草、半邊蓮、半枝蓮、絞股藍(lán)、板藍(lán)根、苦參，諸藥合用，可明顯緩解CAG引起的不適癥狀，改善胃黏膜病理變化，阻止病情進(jìn)一步發(fā)展。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的綜合調(diào)節(jié)作用，化濁解毒方中一些重要成分可能在CAG的治療方面起協(xié)同作用。如茵陳、黃連、藿香、苦參、白花蛇舌草、半邊蓮、半枝蓮、絞股藍(lán)中均含有黃酮類化合物槲皮素。研究表明，槲皮素可顯著降低中性粒細(xì)胞浸潤、幽門螺桿菌定植和幽門竇內(nèi)脂質(zhì)過氧化物濃度[15]。此外，黃芩、半邊蓮、板藍(lán)根還含有黃酮類化合物金合歡素。研究表明，金合歡素具有較強(qiáng)的抗菌活性，能明顯抑制幽門螺桿菌[16]，以及誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡[17]。粗毛豚草素為天然黃酮類化合物，存在于板藍(lán)根和半枝蓮中，可抑制人胃腺癌細(xì)胞生長[18]。提示黃酮類化合物可能在治療CAG方面起關(guān)鍵作用，這些成分作為化濁解毒方治療CAG可能的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，有待后續(xù)進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。

繼Wnt/β-Catenin、PI3K/AKT、NF-κB等經(jīng)典信號通路之后，Hippo信號通路自發(fā)現(xiàn)以來，被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的中心信號網(wǎng)絡(luò)，通過Hippo途徑的信號涉及多種生理病理過程，由于其在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，以及控制器官生長和再生中起著核心作用，故Hippo信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。MST是體內(nèi)普遍表達(dá)的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，作為上游激酶及抑癌基因，當(dāng)細(xì)胞無限增殖時(shí)，可通過多位點(diǎn)進(jìn)行自身磷酸化或通過激活相關(guān)信號通路直接或間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。因此，MST缺失可導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。研究顯示，同時(shí)敲除小鼠肝臟MST1與MST2，可導(dǎo)致小鼠肝臟增大和肝癌的發(fā)生[20]。Xu等[21]研究發(fā)現(xiàn)，MST2在腺瘤及正常胃黏膜中的表達(dá)明顯高于胃癌組織。

RASSF1A位于3p21.3染色體區(qū)域，參與細(xì)胞凋亡、微管動(dòng)態(tài)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和周期調(diào)控等生理病理過程，其主要作為接頭蛋白發(fā)揮抑癌作用[22]。作為Hippo信號通路重要的抑癌基因，RASSF1A能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，破壞RAF1-MST2復(fù)合物，同時(shí)可增強(qiáng)MST2與LATS1/2的結(jié)合，激活的MST2可調(diào)節(jié)LATS激酶活性，進(jìn)而使YAP1磷酸化，抑制YAP1的促癌作用[23]。由于RASSF1A基因是近年來在腫瘤中發(fā)現(xiàn)的甲基化程度最高、最普遍的基因之一，故RASSFlA基因甲基化在腫瘤中的作用受到廣泛關(guān)注。研究表明，原發(fā)性胃癌組織RASSF1A表達(dá)明顯缺失或低下，且與腫瘤分化程度及分期相關(guān)[24]。也有研究顯示，RASSF1A甲基化是胃癌非侵入性診斷指標(biāo)[25-26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CAG大鼠胃黏膜組織RASSF1A表達(dá)顯著低于正常胃黏膜組織，而CAG的發(fā)生、發(fā)展是否與RASSF1A的甲基化有關(guān)，化濁解毒方是否可影響RASSF1A的甲基化狀態(tài)，有待今后進(jìn)一步研究。

SAV1又稱WW45，是Hippo信號通路中激酶級聯(lián)反應(yīng)鏈中的一員，起銜接和活化MST1/2、LATS1/2蛋白的作用，SAV1與MST1/2通過SARAH結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成二聚體，使SAV1自身發(fā)生磷酸化并增加其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，磷酸化SAV1可抑制PP2A-STRIPAK磷酸酶復(fù)合物的形成，從而激活MST1/2，進(jìn)而促進(jìn)LATS1/2、MOB1活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。SAV1基因缺失或被抑制，影響腫瘤尤其是消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，SAV1是酒精性脂肪肝和肝癌最常見的突變基因之一，肝特異性敲除SAV1后能促進(jìn)肝脂肪蓄積、肝細(xì)胞凋亡及纖維化，最終將加快肝腫瘤的發(fā)生[28]。Jiang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，SAV1在人結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，其通過使Hippo信號通路磷酸化，抑制癌基因YAP轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制Akt-mTOR信號通路活化，從而發(fā)揮抗癌作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CAG大鼠胃黏膜組織RASSF1A、SAV1、MST2低表達(dá)，而在正常胃黏膜組織中高表達(dá)，提示CAG大鼠胃黏膜病理變化可能與RASSF1A、SAV1、MST2異常表達(dá)有關(guān)。經(jīng)藥物干預(yù)后，化濁解毒方高劑量組大鼠胃黏膜組織病理改善明顯優(yōu)于化濁解毒方中、低劑量組及維酶素組，同時(shí)RASSF1A、SAV1、MST2表達(dá)明顯高于其他給藥組，表明高劑量化濁解毒方療效存在明顯優(yōu)勢，其治療CAG的作用機(jī)制可能是通過干預(yù)Hippo信號通路實(shí)現(xiàn)的。本研究可為臨床CAG的診治與胃癌的防治提供新思路，為揭示化濁解毒方治療CAG提供依據(jù)。

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Effects ofPrescription on Expressions of RASSF1A, SAV1 and MST2 Proteins in Hippo Signaling Pathway of Rats with Chronic Atrophic Gastritis

HAO Xinyu1, WANG Yangang2, TIAN Xuejiao2

To observe the effects ofPrescription on expressions of RASSF1A, SAV1 and MST2 protein in Hippo signaling pathway of rats with chronic atrophic gastritis; To discuss its possible mechanism of action.CAG rat model was established by joint modeling method. After the CAG rat models were established successfully, they were randomly divided into model group, vitacoenzyme group, andPrescription high-, medium- and low-dosage groups, with 10 rats in each group, and 10 rats in the normal group. Rats in the normal group and model group were given distilled water for gavage, vitacoenzyme suspension solution for gavage in vitacoenzyme group, and relative dosage ofPrescription for gavage inPrescription high-, medium- and low-dosage groups. Animals were administered with corresponding drugs for 12 weeks. HE staining was used to observe the histopathological changes of gastric mucosa, and the expressions of RASSF1A, SAV1, MST2 proteins and mRNA in gastric mucosa were detected by Western blot and real-time quantitative PCR.Compared with the normal group, the expressions of RASSF1A, SAV1, MST2 mRNA and protein in gastric mucosa tissue of model group were significantly reduced (<0.05); compared with the model group, the expressions of RASSF1A, SAV1, MST2 mRNA and protein in gastric mucosa tissue significantly increased inPrescription high- and medium-dosage groups and vitacoenzyme group (<0.05), among which,Prescription high-dosage group increased the most.Prescription has the effects of intervening CAG and delaying the progression of cancer. Its mechanism may be related to the up-regulation of the expressions of the suppressor genes RASSF1A, SAV1 and MST2 in model rats.

Prescription; chronic atrophic gastritis; Hippo signaling pathway; RASSF1A; SAV1; MST2; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)04-0069-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202007494

河北省自然科學(xué)基金（H2020423207）

王彥剛，E-mail：piwei001@163.com

（收稿日期：2020-02-05）

（修回日期：2020-08-16；編輯：華強(qiáng)）