程福建 吳仲 林玲

摘要 為了研究茶皂素是否能抑制紅色毛癬菌真菌生長(zhǎng)以及抑制程度，采用牛津杯法，通過抑菌圈大小判斷茶皂素是否存在抑制紅色毛癬菌作用，結(jié)果表明紅色毛癬菌對(duì)茶皂素敏感程度為高度敏感，后通過立體顯微鏡進(jìn)一步驗(yàn)證茶皂素能破壞菌絲結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致菌絲斷裂、自溶，茶皂素存在抑制紅色毛癬菌作用。然后采用體外抑菌方法研究茶皂素抑制紅色毛癬菌機(jī)制，茶皂素最小抑菌濃度（MIC）為50 mg/mL。茶皂素溶液濃度與菌絲徑向生長(zhǎng)抑制率成正比，100、50和25 mg/mL茶皂素溶液濃度徑向生長(zhǎng)抑制率分別為96.10%、76.90%和57.60%。茶皂素溶液濃度與孢子萌發(fā)率成反比，茶皂素溶液濃度為25、50和100 mg/mL時(shí)，孢子萌發(fā)率分別為47.82%、31.43%、11.70%。

關(guān)鍵詞 茶皂素;體外抑菌;紅色毛癬菌

Abstract In order to study whether tea saponin can inhibit the growth of T. rubrum fungi and the degree of inhibition， the oxford cup was used to judge whether tea saponin can inhibit T. rubrum or not. The results showed that T. rubrum was highly sensitive to tea saponin， and then it was further verified by stereo microscope that tea saponin could destroy hypha structure， resulting in hypha breakage and autolysis. Then， the mechanism of tea saponin inhibiting T. rubrum was studied by in vitro antibacterial method， and the minimum inhibitory concentration（MIC）of tea saponin was 50 mg/mL. The concentration of tea saponin solution was directly proportional to the radial growth inhibition rate of mycelium. The radial growth inhibition rate of 100， 50 and 25 mg/mL tea saponin solution concentration was 96.10%， 76.90% and 57.60%， respectively.The concentration of tea saponin solution was inversely proportional to the spore germination rate. When the concentration of tea saponin solution was 25， 50， and 100 mg/mL， the spore germination rate was 47.82%， 31.43%， and 11.70%， respectively.

Key words Tea saponin;Bacteriostasis in vitro;T. rubrum

皂苷，又名皂素，是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖苷類化合物，有糖鏈與三萜類、甾類或甾體生物堿通過碳氧鍵相連而構(gòu)成。茶皂素是一類齊墩果烷型五環(huán)三萜類皂苷的混合物，它不僅是一種性能優(yōu)良的純天然非離子表面活性劑，而且具有較強(qiáng)的起泡、乳化、分散和潤(rùn)濕性能[1]，抗癌、抗炎、抗菌作用[2-3]，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)方面。相關(guān)研究表明，茶皂素對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有良好的抑菌作用，其最低抑菌濃度（MIC）分別為1.0和0.5 mg/mL[4];茶葉皂苷對(duì)皮膚致病真菌表現(xiàn)出良好的抑制活性，其對(duì)小孢子霉屬病菌的MIC值為10 μg/mL。皮膚癬菌（Trichophyton rubrum）感染所導(dǎo)致的淺部真菌病是人類最常見的皮膚疾病之一，其中，紅色毛癬菌是皮膚癬菌總菌株中最為主要的病原菌，它同時(shí)也是目前國(guó)際上重點(diǎn)研究極力防治的一種皮膚癬菌[5]。茶皂素抗紅色毛癬菌的研究鮮見報(bào)道。

該試驗(yàn)通過牛津杯抑菌圈方法初步確定茶皂素抑菌作用，采用體外抑菌試驗(yàn)結(jié)合立體顯微鏡觀察來研究茶皂素抑制紅色毛癬菌機(jī)理，以期為天然抗菌劑以及茶皂素治療皮膚癬菌藥用價(jià)值的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

茶皂素（純度95%以上），購(gòu)自陜西貝農(nóng)科技有限公司;紅色毛癬菌（T.rubrum），購(gòu)自上海瑞楚科技有限公司;沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA），購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB），購(gòu)自南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司;0.9%氯化鈉溶液，購(gòu)自福州海王福藥制藥有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器及設(shè)備

電子分析天平，瑞士Sartorius公司（北京）;滅菌器 G180TW，北京美國(guó)致微ZWALWAY;數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4，常州國(guó)華電器有限公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱GNP-9160，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;潔凈工作臺(tái)SW-CJ-1FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;徠卡立體顯微鏡LEICA M80。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制。

1.3.1.1

沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）配制。蛋白胨10 g/L、葡萄糖40 g/L、瓊脂15 g/L、氯霉素0.1 g/L，取沙氏瓊脂培養(yǎng)基 65 g 溶于1 000 mL蒸餾水中，加熱煮沸充分溶解，分裝1 000 mL錐形瓶中，放滅菌鍋115 ℃高溫高壓滅菌15 min，備用。

1.3.1.2

沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）配制。動(dòng)物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物10 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 5.6±0.2（25 ℃），取沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基30 g，置于1 L蒸餾水中，加熱攪拌至完全溶解，分裝1 000 mL錐形瓶中，121 ℃ 高壓滅菌15 min，放置冷卻，備用。

1.3.2 菌液配制。

1.3.2.1

T.rubrum活化。用接種環(huán)挑取甘油斜面保存的T.rubrum，劃線接種于SDA平板培養(yǎng)基和試管斜面上，于28 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，備用。

1.3.2.2

T.rubrum菌懸液配制。向活化后T.rubrum斜面加入滅菌后的0.9%氯化鈉溶液3 mL，用接種環(huán)刮取T.rubrum，于120 r/min離心機(jī)離心1 min，調(diào)整菌懸液濃度為5×107～8×107 CFU/mL，備用。

1.3.3 抑菌指標(biāo)判定。

試驗(yàn)采用牛津杯法，根據(jù)抑菌圈大小判定T.rubrum對(duì)茶皂素敏感強(qiáng)度（表1）。稱取2 g茶皂素溶于10 mL滅菌純水中，加熱充分溶解，作為母液，取配制好的菌懸液100 μL均勻涂布SDA平板培養(yǎng)基上，靜置風(fēng)干后，等距在平板培養(yǎng)基上放置4個(gè)滅菌牛津杯，對(duì)角分別是2個(gè)空白純水對(duì)照、2個(gè)同濃度茶皂素試驗(yàn)對(duì)照，培養(yǎng)5 d，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小，初步判定抑菌效果。并通過立體成像顯微鏡觀察抑菌圈內(nèi)及最外圈T.rubrum形態(tài)。

1.3.4 抑制紅色毛癬菌MIC測(cè)定。

準(zhǔn)確稱取2 g（接近最大溶解濃度）茶皂素，溶于10 mL純水中，加熱充分溶解，配制成200 mg/mL的母液。

根據(jù)改良CLSI M38-A2方案，在潔凈工作臺(tái)中吸取500 μL SDB培養(yǎng)基依次加入48孔板的第1、2、3行試驗(yàn)組的2～8列中，第4、5、6行空白對(duì)照組的1～8 列中，將茶皂素母液吸取500 μL加入第1、2、3行的第1列孔中，再吸取500 μL茶皂素母液加入第1、2、3行的第2列孔中，混合均勻后，吸取500 μL到第1、2、3行第3孔，依次進(jìn)行2倍梯度稀釋，最后得到茶皂素藥液濃度為200.00～3.12 mg/mL，吸取50 μL配制好的T.rubrum菌懸液加入48孔板，混合均勻后，置于28 ℃ 隔水式恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后觀察能100%抑制T.rubrum生長(zhǎng)的濃度為MIC。

1.3.5 對(duì)紅色毛癬菌徑向生長(zhǎng)的影響。

將滅菌后SDA固體培養(yǎng)基定量量取10 mL 于試管中，冷卻到50 ℃左右加入5 mL不同濃度的茶皂素溶液混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中，使含茶皂素溶液固體培養(yǎng)基終濃度為100、50、25 mg/mL，空白組不加茶皂素溶液處理，冷卻凝固后，在不同濃度茶皂素平板的中心重疊放置直徑6 mm的空白濾紙多層，最上一層為浸染稀釋的T.rubrum濾紙片，每個(gè)平板等距放置3個(gè)作為平行試驗(yàn)，置于28 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱中孵育3 d，每天按時(shí)觀察菌絲徑向生長(zhǎng)情況，用十字交叉法測(cè)量菌絲生長(zhǎng)直徑。

菌絲徑向生長(zhǎng)直徑（cm）=菌落直徑-0.6 cm（空白濾紙直徑）（1）

菌絲徑向生長(zhǎng)抑制率=（空白組菌落直徑-試驗(yàn)組菌落直徑）/空白組菌落直徑×100%（2）

1.3.6 對(duì)紅色毛癬菌孢子萌發(fā)的影響。

1.3.6.1 平板制作。

將滅菌后SDA固體培養(yǎng)基定量量取10 mL 于試管中，冷卻到50 ℃左右加入5 mL不同濃度的茶皂素溶液混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中，使含茶皂素溶液平板終濃度為100、50、25 mg/mL，空白組不加茶皂素溶液處理，冷卻凝固后，用移液槍在不同濃度茶皂素平板的中心滴加100 μL稀釋的孢子菌懸液，置于隔水式恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)72 h后取出。

1.3.6.2 觀察孢子萌發(fā)情況。

用打孔器取等量的菌塊平穩(wěn)放置在培養(yǎng)皿上，以芽管長(zhǎng)度超過孢子直徑長(zhǎng)度的50%作為萌發(fā)的孢子[6]，每塊菌塊選2個(gè)顯微鏡視野計(jì)數(shù)孢子總數(shù)和萌發(fā)孢子數(shù)，即每個(gè)茶皂素溶液濃度下的6個(gè)觀察數(shù)據(jù)平均后作為試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

根據(jù)下列公式計(jì)算出孢子的萌發(fā)率：孢子萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)/孢子總數(shù)×100%（3）

1.3.7 對(duì)紅色毛癬菌菌絲形態(tài)的影響。

稱取4 g茶皂素溶于20 mL純水中作為母液，采用瓊脂稀釋法，將滅菌后SDA固體培養(yǎng)基定量量取10 mL于試管中，冷卻到50 ℃左右加入10 mL不同濃度的茶皂素溶液混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中，使含茶皂素溶液平板終濃度為100、50、25 mg/mL，空白組不加茶皂素溶液處理，冷卻凝固后，在不同濃度茶皂素平板上放置3個(gè)浸染T.rubrum的濾紙片作為3個(gè)平行試驗(yàn)，設(shè)置2組，即6個(gè)平行試驗(yàn)，置于隔水式恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5 d后取出，置于立體成像顯微鏡觀察菌絲形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌指標(biāo)判定結(jié)果

牛津杯抑菌指標(biāo)判定結(jié)果如圖1所示，牛津杯內(nèi)的溶液會(huì)緩慢向杯外擴(kuò)散，有抑菌作用即能形成抑菌圈，圈內(nèi)菌種無法生長(zhǎng)。培養(yǎng)5 d可以明顯看出空白對(duì)照長(zhǎng)滿菌絲，試驗(yàn)組有明顯的抑菌圈效果，圈內(nèi)無菌絲生長(zhǎng)，培養(yǎng)基為固體，且菌絲并未向抑菌圈內(nèi)延伸，排除滲透壓引起菌絲死亡。對(duì)抑菌圈測(cè)量結(jié)果（表2）顯示，抑菌圈大于15 mm，說明T.rubrum對(duì)200 mg/mL茶皂素屬于高敏，初步判定茶皂素對(duì)T.rubrum有抑制作用。

為區(qū)分不是因?yàn)椴柙硭厝芤侯伾绊懸志Ч袛?，進(jìn)一步確定茶皂素存在抑制T.rubrum效果，該試驗(yàn)通過立體顯微鏡觀察平板培養(yǎng)基上正常的菌絲生長(zhǎng)形態(tài)和茶皂素溶液抑菌圈邊緣菌絲形態(tài)來驗(yàn)證茶皂素抑菌效果。結(jié)果顯示（圖2），無茶皂素處理下菌絲肥壯、有光澤、分割明顯，經(jīng)茶皂素處理后，其抑菌圈邊緣菌絲形態(tài)出現(xiàn)斷裂、無光澤，分割模糊且能看到有內(nèi)含物質(zhì)流出痕跡，說明茶皂素能破壞菌絲細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響其正常生長(zhǎng)，進(jìn)一步驗(yàn)證茶皂素具有抑制T.rubrum生長(zhǎng)的效果。

2.2 茶皂素對(duì)紅色毛癬菌的最小抑菌濃度

使用48孔板在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，每板不同茶皂素溶液濃度做3個(gè)重復(fù)，兩板共6個(gè)重復(fù)，由多人在自然光線用肉眼觀察判斷，判斷結(jié)果顯示，48孔板中，第1、2、3行1～8孔分別為200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、0 mg/mL不同茶皂素溶液濃度，從第4孔開始出現(xiàn)不同程度渾濁，6次重復(fù)結(jié)果一致，故試驗(yàn)組第3孔即是茶皂素最小抑菌濃度，即最小抑菌濃度為50 mg/mL;第4、5、6行均為空白對(duì)照，培養(yǎng)第2天便全部出現(xiàn)大量絮狀渾濁，T.rubrum生長(zhǎng)良好。

2.3 茶皂素對(duì)紅色毛癬菌徑向生長(zhǎng)的影響

2.3.1 紅色毛癬菌徑向生長(zhǎng)情況。

為了直觀觀察茶皂素對(duì)菌絲徑向生長(zhǎng)的影響，該試驗(yàn)采用濾紙片法，將浸染過菌懸液的濾紙片分別接種到不同濃度茶皂素溶液SDA固體平板培養(yǎng)基上，在同等環(huán)境培養(yǎng)基上各放置3個(gè)濾紙片為平行試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。100 mg/mL茶皂素溶液濃度幾乎完全抑制T.rubrum徑向生長(zhǎng)，徑向生長(zhǎng)直徑僅為1 mm，且為散狀、點(diǎn)狀，斷續(xù)出現(xiàn);50 mg/mL茶皂素溶液濃度，T.rubrum徑向生長(zhǎng)直徑為6 mm左右;25 mg/mL茶皂素溶液濃度，T.rubrum徑向生長(zhǎng)直徑為11 mm;無茶皂素處理，T.rubrum自然徑向生長(zhǎng)直徑為26 mm?？梢姴柙硭匾种芓.rubrum作用與茶皂素溶液濃度成正比。

2.3.2 茶皂素對(duì)紅色毛癬菌徑向生長(zhǎng)抑制率的影響。

通過游標(biāo)卡尺測(cè)量和菌絲徑向生長(zhǎng)抑制率公式（2）計(jì)算，由圖4可知，茶皂素溶液濃度與菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)有顯著負(fù)相關(guān)，100、50、25 mg/mL茶皂素溶液濃度對(duì)T.rubrum徑向生長(zhǎng)抑制率分別為96.10%、76.90%、57.60%。茶皂素溶液濃度與T.rubrum抑制率成正比，對(duì)菌絲的正常生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。

2.4 茶皂素對(duì)孢子萌發(fā)的影響

為了觀察孢子萌發(fā)情況，該試驗(yàn)將稀釋后的孢子菌懸液接種在不同濃度茶皂素溶液與SDA培養(yǎng)基混合平板上，在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，并利用公式（3）計(jì)算孢子萌發(fā)率。結(jié)果顯示（圖5），茶皂素對(duì)T.rubrum孢子萌發(fā)存在抑制作用，隨著茶皂素溶液濃度升高，對(duì)T.rubrum孢子萌發(fā)抑制越強(qiáng)，孢子萌發(fā)率越低，茶皂素溶液濃度為25和50 mg/mL時(shí)，孢子萌發(fā)率分別為47.82%和31.43%;茶皂素溶液濃度為100 mg/mL時(shí)，孢子萌發(fā)率僅為11.70%。

2.5 茶皂素對(duì)紅色毛癬菌菌絲形態(tài)的影響

為針對(duì)性地探究茶皂素對(duì)T.rubrum菌絲形態(tài)的影響，該試驗(yàn)分別在0.5MIC濃度（25 mg/mL）茶皂素、MIC濃度（50 mg/mL）茶皂素、2MIC濃度（100 mg/mL）茶皂素、無茶皂素處理平板培養(yǎng)基上試驗(yàn)。由圖6可知，無茶皂素處理，菌絲生長(zhǎng)飽滿肥壯，分叉明顯;0.5MIC濃度茶皂素處理，菌絲開始出現(xiàn)斷裂，分隔模糊;MIC濃度茶皂素處理，菌絲大量斷裂，內(nèi)含物質(zhì)泄漏明顯，部分菌絲粉碎，分割十分模糊;2MIC濃度茶皂素處理，菌絲幾乎無法生成，僅剩部分點(diǎn)狀內(nèi)含物質(zhì)，說明茶皂素能破壞菌絲結(jié)構(gòu)，影響其生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致其死亡。

3 討論與結(jié)論

致病性真菌對(duì)于現(xiàn)有抗真菌藥物的耐藥性逐漸增強(qiáng)，臨床上廣泛使用抗生素、抗癌藥物及免疫抑制劑加上化療、器官移植、外科手術(shù)等治療方法可能會(huì)造成病人相關(guān)免疫系統(tǒng)功能的損傷，是真菌易發(fā)感染的主要原因，因此，真菌病已經(jīng)成為影響人們健康的重大醫(yī)學(xué)問題之一。天然抗菌劑擁有著豐富的化合物結(jié)構(gòu)資源，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)尋找安全性好、抗菌譜廣、療效高的抗真菌藥物的一個(gè)非常重要的研究方向，對(duì)紅色毛癬菌相關(guān)研究表明，鞣花酸的抗真菌作用較顯著，其對(duì)T.rubrum最敏感，最低抑菌濃度（MIC）為64 μg/mL[5];用芳樟醇處理后，紅色毛癬菌細(xì)胞壁降解模糊，表面粗糙且厚度不均勻，細(xì)胞內(nèi)膜皺縮破損，輪廓不清，部分細(xì)胞器損壞表現(xiàn)為膜碎片以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物泄露[6];從茶樹中提取的精油成分[7]，可以通過改變膜的性質(zhì)和破壞膜的相關(guān)功能，破壞白念珠菌的滲透性和膜流動(dòng)性，同時(shí)還可導(dǎo)致菌絲壁變薄和變形，促使細(xì)胞壁破裂，最后使菌絲頂端變平或者變?yōu)檠繝罱Y(jié)構(gòu)[8];地錦草提取物256 μg/mL時(shí)，可顯著降低紅色毛癬菌中角鯊烯環(huán)氧化酶的活性（P<0.01），其抗真菌機(jī)制可能與抑制角鯊烯環(huán)氧化酶的活性、影響麥角甾醇的生物合成有關(guān)[9]，說明部分天然提取抑菌劑具有較好的抗皮膚癬菌效果。除了研究開發(fā)單一天然抑菌劑外，聯(lián)合抗真菌合成藥物將有助于提高治療效果，減弱抗生素副作用，是研究開發(fā)天然抑菌劑的價(jià)值之一。王彭[10]對(duì)80例由紅色毛癬菌引起的足癬、股癬、體癬、手癬患者進(jìn)行觀察，通過試驗(yàn)表明，達(dá)克寧與水楊酸聯(lián)合治療紅色毛癬菌病5周后，其痊愈率為82%;王丹等[11]研究丹參酮聯(lián)合抗真菌藥物對(duì)紅色毛癬菌的體外藥敏表明，丹參酮與伊曲康唑、卡泊芬凈聯(lián)合具有協(xié)同作用并可抑制紅色毛癬菌活性。

該試驗(yàn)通過茶皂素抗紅色毛癬菌（T.rubrum）體外抑菌研究，發(fā)現(xiàn)T.rubrum對(duì)茶皂素高敏，在200 mg/mL的茶皂素溶液濃度下，采用牛津杯培養(yǎng)法形成的抑菌圈并非是十分規(guī)則的圓形，說明并不是真菌細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓引起的真菌死亡，可能是茶皂素某些生化活性物質(zhì)能抑制其菌絲生長(zhǎng)，且能抑制其孢子萌發(fā)，破壞其菌絲結(jié)構(gòu)，使菌絲斷裂破碎，影響其正常生長(zhǎng)，該試驗(yàn)研究目標(biāo)希望進(jìn)一步細(xì)化明確天然抑菌劑茶皂素組成活性成分抑菌結(jié)構(gòu)，為天然抑菌劑的高效利用做貢獻(xiàn)。由于尚未看到茶皂素抑制紅色毛癬菌的報(bào)道，試驗(yàn)下一步將進(jìn)行基因組的測(cè)序，明晰茶皂素如何影響并破壞紅色毛癬菌結(jié)構(gòu)變化，提供更有力的證據(jù)表明茶皂素抑制紅色毛癬菌生長(zhǎng)作用。該研究可為天然抗菌劑開發(fā)提供理論參考，同時(shí)為茶皂素綜合利用開發(fā)提供指導(dǎo)。

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