姚鑫鑫 吳春陽 李志明

摘要 [目的]探討奶牛陰道菌群的多樣性與奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎發(fā)病之間的關聯(lián)性。[方法]隨機采集30頭牛的陰道分泌物，對其分泌物進行16S rDNA測序，將測序的數(shù)據(jù)進行除雜等處理后，使用UPARSE軟件對不同樣本細菌的豐度及多樣性進行分析，記錄所采集的30個樣本產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病情況。[結果]4頭奶牛產(chǎn)后患有子宮內(nèi)膜炎，發(fā)病率為13.33%。不同樣本的陰道菌群差異顯著但在患病樣本中卻有一定的相似性。產(chǎn)前陰道菌群的OTU（operational taxonomic unit）個數(shù)均在100以上且豐度也較大，且菌群中多以短小芽孢桿菌（Bacillus_pumilus）為主的奶牛產(chǎn)后易患子宮內(nèi)膜炎。[結論]奶牛產(chǎn)前陰道菌群的多樣性變化可為產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病提供早期預警，對奶牛子宮內(nèi)膜炎的防治具有一定的參考價值。

關鍵詞 16S rDNA測序技術;子宮內(nèi)膜炎;奶牛;陰道菌群

Abstract [Objective]To investigate the correlation between the diversity of vaginal microflora and the incidence of postpartum endometritis in dairy cows. [Method]The vaginal secretions of 30 cattle were randomly collected， and 16S rDNA sequencing was made on the secretions. After impurity removal and other processing， UPARSE software was used to analyze the abundance and diversity of bacteria in different samples， and the incidence of postpartum endometritis in 30 samples collected was recorded.[Result]The incidence of endometritis postpartum was found in four cows，the incidence rate reached 13.33%. Although the difference of vaginal microflora in different samples was significant， but there were some similarities in the diseased samples.The amount of OTU （operational taxonomic unit） of prenatal vaginal flora was more than 100， and its abundance was also large.Moreover， most cows with Bacillus pumilus as their main species were prone to suffer from postpartum endometritis.[Conclusion]The diversified changes of prenatal vaginal microflora in dairy cows could provide early warning for the incidence of postpartum endometritis， which had certain reference values for the prevention and treatment of dairy cows endometritis.

Key words 16S rDNA sequencing technology;Endometritis;Dairy cow;Vaginal flora

子宮內(nèi)膜炎是奶牛產(chǎn)后經(jīng)常發(fā)生的一種群發(fā)普通病，主要以子宮內(nèi)膜發(fā)生炎癥、陰道流出污濁或黏性分泌物為特征，給養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失[1]。據(jù)報道，子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率約占英國不孕牛的95%[2]。許多奶牛發(fā)生不孕癥的原因大部分是由于患有子宮內(nèi)膜炎。據(jù)統(tǒng)計，我國奶牛與其他品種牛相比更容易發(fā)生與繁殖障礙相關的疾病，發(fā)病率為15%～20%。在患有不孕癥的牛中，子宮內(nèi)膜炎所引起的不孕癥占50.62%[3-4]。奶?；疾『螅∏檩^輕者與健康牛相比休情期明顯延長，影響繁殖與配種，進而影響泌乳量，病情較重者會造成繁殖能力喪失[5]。動物菌群與動物健康間的關系一直以來是科學家們廣泛關注的熱點和研究方向。近年來，有研究人員發(fā)現(xiàn)，奶牛陰道菌群失衡是導致其發(fā)病的根本因素。在生殖道內(nèi)的特定部位微生物種類繁多，這些微生物與環(huán)境和宿主間互相保持平衡并維持其生殖系統(tǒng)的正常生理功能，認清這三者之間的關系直接關系到各種疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，感染HR-HPV的女性陰道菌群結構與未感染的女性明顯不同。前者具有明顯增加的物種多樣性，主要表現(xiàn)為乳酸桿菌的減少和陰道加德納菌的增加[8]。 HSV-2陰道感染的雌性小鼠同樣表現(xiàn)出顯著的微生物變化[9]。宮頸樣品中的微生物群成為檢測子宮內(nèi)膜異位癥患病風險的指標[10]。奶牛子宮內(nèi)細菌感染是一個高度動態(tài)的過程，細菌種類遵循特定的進展模式[11]。然而，子宮菌群在子宮疾病發(fā)展中的潛在作用需要進一步的研究來闡明。筆者選用16S rDNA方法，對奶牛陰道菌群的組成及其多樣性進行了分析，并對其與產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎發(fā)病率之間的相關性進行研究，從陰道菌群的角度探究奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的早期預警，旨在為子宮內(nèi)膜炎的預防、診斷和治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料。

從北京市平谷區(qū)順陽光農(nóng)場采集了30頭荷斯坦牛的陰道分泌物，同時跟蹤記錄其人工輸精、妊娠、分娩以及產(chǎn)后患子宮內(nèi)膜炎情況。

1.1.2 主要試劑。

CTAB（自配）、HiFi Hot Start Ready Mix（Kapa，KK2501）、Qubit dsDNA Assay Kit（Life Technologies，Q328520）。

1.1.3 儀器與耗材。

PCR擴增儀（Bio-rad，580BR10905）、超凈工作臺、水平電泳儀（Tanon，HE-120）、微量移液器（Eppendorf）、Bioanalyzer（Aglient，2100）、離心管（Axygen）、高速離心機（Eppendorf，Centrifuge 5418）、凝膠成像分析儀（Tanon 2500）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取。

試驗采用DNA試劑盒，根據(jù)說明書步驟提取樣本的基因組DNA，將提取的DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。取提取的樣品適量置于離心管中，將其稀釋至濃度1 ng/μL，備用。

1.2.2 PCR擴增。

以稀釋后的樣品為模板，根據(jù)選擇的對應測序區(qū)域，引物選用帶Barcode的特異引物，酶選擇KAPA公司的高保真酶（HiFi Hot Start Ready Mix），點樣混勻后進行PCR擴增。鑒定細菌多樣性對應區(qū)域為16S V3～V4 區(qū)（引物為343F和798R，如表1所示），若為其他區(qū)域請將區(qū)域及引物進行替換。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化。

采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR產(chǎn)物，然后使用磁珠純化，繼續(xù)進行二輪PCR擴增。接著重復上述純化步驟，將最后的PCR產(chǎn)物Qubit定量后上機測序。

1.2.4 菌群的多樣性分析。

使用Trimmomatic軟件對原始雙端測序數(shù)據(jù)進行去雜，目的是去掉模糊堿基和低質量堿基，進一步提高拼接率[12]。將去雜后的雙端數(shù)據(jù)進行拼接進行后續(xù)分析，拼接使用FLASH 1.2.11軟件[13]進行，并對拼接后的reads數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。隨后進一步進行去雜，將獲取的序列進行去嵌合體序列處理。進行一系列步驟后得到較優(yōu)質的序列，以便進行下游分析。

使用Uparse[14]軟件進行OTU劃分，其相似度為97%。然后從各OTU中挑選豐度最大的序列作為代表。與Silva-16S數(shù)據(jù)庫[15]（默認使用Silva-16S數(shù)據(jù)庫[16]）進行比對，用最終得到的數(shù)據(jù)構建系統(tǒng)發(fā)育樹和OTU分類表格，然后進行α和β多樣性分析。

將以上OTUs聚類分析結果不同樣品之間共有和特有的OTUs進行分類及分析，繪制出花瓣圖。

挑選出各個OTUs的代表序列后，根據(jù)序列比對，使用pynast[17]軟件對挑選出的OTUs代表序列進行系統(tǒng)進化關系的構建，生成進化樹，最后統(tǒng)計出各個OTUs的豐度，挑選出reads最多的TOP100的OTUs，構建進化樹，對應OTUs在不同樣本中的豐度，分析不同物種之間的進化關系。根據(jù)分類的OTU結果以及各個OTUs的豐度（reads數(shù)目），進行OTU的Heatmap 繪制，Heatmap 中的顏色表示一個OTU或分類所包括的序列數(shù)目水平（reads），紅色表示高水平，藍色表示低水平，數(shù)字表示某個樣品中分類所包括的序列數(shù)目。

根據(jù)樣本中各個物種的比例繪制圖形，以柱狀圖和面積圖的形式表現(xiàn)。柱狀圖以及面積圖中面積較大的物種為較優(yōu)勢物種。

多樣性分析以PCoA（principal co-ordinates analysis）和NMDS（nonmetric multidimensional scaling）進行。將PCoA中的特征向量和特征值進行排序，以便于觀察個體、群體間的差異。 NMDS可以展示比對樣本組之間的差異。

最后，采用隨機重復抽樣算法對UPGMA的可靠性進行分析。Jackknifed重復抽樣UPGMA 樹狀圖可用來與整個數(shù)據(jù)集分析生成的UPGMA圖進行對比，最終得到一個支持結果及樹狀圖，用以觀察樣本的相似性。

2 結果與分析

2.1 宮內(nèi)膜炎發(fā)病情況

由表2可知，采集于北京平谷地區(qū)順陽光農(nóng)場的30頭奶牛中，序號S3、S13、S14、S20的奶牛人工輸精后產(chǎn)后患有子宮內(nèi)膜炎，發(fā)病率為13.33%。

2.2 不同樣本陰道菌群的OTU分析

從圖1可以看出，產(chǎn)后患子宮內(nèi)膜炎的S3樣本中特有的OTUs個數(shù)為422個，S13特有的OTUs個數(shù)為849個，S14特有的OTUs個數(shù)為193個，S20特有的OUTs個數(shù)為100個。產(chǎn)后未患子宮內(nèi)膜炎的樣本牛中特有的OTUs個數(shù)普遍低于100個，個別樣本特有的OTUs個數(shù)大于100個，但遠低于S3和S13中的特有的OTUs個數(shù)。

通過觀察基于OTU繪制的系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，S3和S13樣本中感染細菌的豐度顯著高于其他樣本，其他樣本的細菌豐度差異不大（圖2）。

從基于豐度繪制的樣本細菌種群結構分布可以看出，S3樣本中以短小芽孢桿菌（Bacillus_pumilus）、蔬菜芽孢桿菌（Bacillus_oleronius）和鏈霉菌（Streptomyces_sp._KP17）為主。S13樣本中以短小芽孢桿菌（Bacillus_pumilus）和乳酸鏈球菌（Lactococcus_lactis）為主。S14主要以環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus_circulans）和短小芽孢桿菌（Bacillus_pumilus）為主。S20主要以多動物鏈球菌（Streptomyces_pluranimalium）、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus_circulans）和短小芽孢桿菌（Bacillus_pumilus）為主（圖3）。

根據(jù)分類的OTU結果以及各個OTUs的豐度，進行OTU的Heatmap繪制，結果如圖4所示，北京市平谷區(qū)順陽光農(nóng)場奶牛陰道菌群中主要以芽孢桿菌為主，其中以蠟樣芽孢桿菌（Bacillus_cereus）為主的奶牛產(chǎn)后普遍沒有患子宮內(nèi)膜炎，而以短小芽孢桿菌為主的奶?；甲訉m內(nèi)膜炎的概率大大增加，也不排除其他條件性致病菌在特殊情況下引起的奶牛子宮內(nèi)膜炎。

2.3 β多樣性分析結果

通過多樣性分析結果可以發(fā)現(xiàn)各個樣本的菌落組成差異比較顯著。

采取隨機重復抽樣算法對UPGMA的可靠性進行分析。Jackknifed重復抽樣UPGMA樹狀圖可用來與整個數(shù)據(jù)集分析生成的UPGMA圖進行對比，最終得到一個支持結果以及樹狀圖。結果顯示，S3和S13以及S14樣本具有一定的菌落相似性，S20樣本完全獨立于另外3個患產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的樣本（圖5）。

3 討論

奶牛陰道正常菌群的形成是機體和環(huán)境相互適應的結果，菌群、動物機體和環(huán)境三者之間存在一種動態(tài)平衡關系，由于各種因素均可輕易破壞奶牛陰道菌群，因此奶牛陰道菌群的研究是一個亟待解決的問題[18-19]。但隨著各項技術的發(fā)展及深入，基因檢測技術的出現(xiàn)加快了奶牛陰道菌群研究的進展。其中，Illumina MiSeq高通量測序技術是目前用于研究奶牛陰道微生物多樣性的重要手段及先進技術[20]。

Illumina MiSeq技術試驗結果數(shù)據(jù)量大、準確率相對較高，得到并鑒定的細菌類型多，有利于奶牛陰道內(nèi)許多低豐度菌屬和未知細菌的發(fā)現(xiàn)，因此被廣泛用來進行各種微生物致病菌的分離和鑒定[21]。相關研究人員用16Sr DNA測序的方法，發(fā)現(xiàn)健康牛子宮細菌以Firmicutes和Bacteroidetes為主[22]。彭宇[23]將分娩后10、20、30、40 d的奶牛樣本分別進行基因提取、擴增和測序，將V6～V8為目標片段區(qū)域進行DGGE分析并進行測序，結果表明分娩后10 d的未患病奶牛陰道內(nèi)的主要細菌為Bacteroides和Porphyromonas;40 d健康奶牛陰道內(nèi)的主要細菌為Tenericutes。Santos等[24]將患有子宮炎的奶牛樣品進行對比，利用PCR-DGGE方法，結果發(fā)現(xiàn)未患病奶牛陰道的優(yōu)勢菌為Gammaproteobacteria和Tenericutes。該研究對陰道微生物測序時亦采用16S rDNA測序法，將V3～V4區(qū)作為靶目標測序片段，運用Illumina MiSeq技術將30頭奶牛陰道標本進行檢測菌群分析。結果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前陰道菌群的OTU（operational taxonomic unit）個數(shù)較多且均在100以上且豐度也較大，菌群中多以短小芽孢桿菌（Bacillus_pumilus）為主的奶牛產(chǎn)后易患子宮內(nèi)膜炎。通過不同樣本的OTU分析發(fā)現(xiàn)，未患病奶牛陰道菌群與患病奶牛陰道菌群對比，前者OTU個數(shù)較少，而后者OTU個數(shù)相對較多，患病樣本S3和S13的細菌豐度最顯著，但S14和S20樣本的細菌豐度與其他未患病樣本差異不大。研究表明，在產(chǎn)后第7天患子宮內(nèi)膜炎母牛的擬桿菌含量較高。在產(chǎn)后發(fā)熱的奶牛、初產(chǎn)奶牛、有輔助分娩的奶牛和生雙胞胎的奶牛中，富集細菌和擬桿菌的負荷也更高。微生物群組成和總細菌載量與子宮疾病和生殖衰竭的已知圍產(chǎn)期危險因素有關[25]。人因子宮良性疾病（如子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎等），除外生殖道感染后需行手術治療患者，從患者陰道、宮頸管及直腸子宮陷凹等處收集抽吸液，進行16S rDNA 測序，結果顯示患者生殖道的微生物菌群隨著定植部位的改變而變化，下生殖道仍以乳酸桿菌為絕對優(yōu)勢菌群，隨著生殖道的上行宮腔、輸卵管、道格拉斯腔液，乳酸桿菌在各部位的豐度逐漸下降，相反地，假單胞菌（Pseudomonas）和鮑氏不動桿菌（Acinetobacte）豐度逐漸增加[26]。宮腔菌群的改變引起了子宮內(nèi)膜炎癥反應機制的改變，釋放多種炎性物質，促進慢性子宮內(nèi)膜炎等疾病的發(fā)生和發(fā)展及惡變的危險因素[27]。研究顯示，健康Gttingen 迷你豬陰道菌群的優(yōu)勢菌門主要富集厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門和梭桿菌門5個門?；加凶訉m內(nèi)膜炎的母豬，變形菌門占比顯著增加，該門包含有大量的大腸桿菌和志賀氏桿菌等致病菌[28]。除變形菌門以外，其余4個健康組的優(yōu)勢菌門在患病后相對豐度均呈現(xiàn)相應降低[29]。

北京市平谷區(qū)順陽光農(nóng)場30頭牛中僅有4頭牛產(chǎn)后患有子宮內(nèi)膜炎，整體發(fā)病率為13.33%。這30頭奶牛陰道菌群的組成無論產(chǎn)后是否患子宮內(nèi)膜炎，其菌落組成差異均顯著，說明菌落組成與產(chǎn)后患子宮內(nèi)膜炎沒有必然的聯(lián)系。然而，通過比較各個樣本的相似性發(fā)現(xiàn)S3、S14、S13樣本相似性較大，說明該相似樣本患產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的風險較大。但S20樣本卻完全獨立于另外3個患病樣本。因此，不能忽視其他組樣本菌落的組成差異，同樣有患子宮內(nèi)膜炎的風險。

總而言之，奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎患病因素很多，陰道菌群組成復雜，陰道菌群間組成差異與產(chǎn)后奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病之間沒有必然聯(lián)系，僅具有一定的指示作用，要綜合考慮各個方面因素，才能有效防治奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生。

參考文獻

[1]王治方，施巧婷，馮亞杰，等.牛繁殖障礙性疾病的發(fā)生原因與控制策略[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2013（6）：80-81.

[2]尹召華，朱建明，謝夏陽.縮宮素配合乳酸環(huán)丙沙星治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的臨床觀察[J].動物科學與動物醫(yī)學，2002，19（1）：27-29.

[3]劉瓊霞，李秀山，譚運華，等.奶牛繁殖障礙綜合征的病因及綜合防治[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2004，25（1）：25-28.

[4]閆寶琪，董書偉，王東升，等.奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎診斷技術研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2016，43（3）：683-688.

[5]王芳，胡松華.奶牛子宮內(nèi)膜炎研究進展[J].中國奶牛，2004（5）：39-41.

[6]陶方明.人體的微生態(tài)平衡[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2007，4（3）：204-205.

[7]陳晴，樊尚榮.非培養(yǎng)法檢測陰道微生態(tài)的進展[J].醫(yī)學綜述，2012，18（15）：2467-2470.

[8]CHENG W Y，XU F，GAO L L，et al.The correlation between the determination of vaginal micro-ecological composition and the outcome of HPV infection by high-throughput metagene sequencing information technology on the Illumina platform[J].Journal of infection and public health，2020，13（12）：1961-1966.

[9]GUERRERO-BELTRN C，GARCIA-HEREDIA I，CEA-DIEZ R，et al.Cationic dendrimer G2-S16 inhibits herpes simplex type 2 infection and protects mice vaginal microbiome[J].Pharmaceutics，2020，12（6）：1-14.

[10]WEI W X，ZHANG X W，TANG H R，et al.Microbiota composition and distribution along the female reproductive tract of women with endometriosis[J].Annals of clinical microbiology and antimicrobials，2020，19（1）：1-8.

[11]WAGENER K，PRUNNER I，POTHMANN H，et al.Diversity and health status specific fluctuations of intrauterine microbial communities in postpartum dairy cows[J].Veterinary microbiology，2015，175（2/3/4）：286-293.

[12]BOLGER A M，LOHSE M，USADEL B.Trimmomatic：A flexible trimmer for Illumina sequence data[J].Bioinformatics，2014，30（15）：2114-2120.

[13]REYON D，TSAI S Q，KHAYTER C，et al.FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing[J].Nature biotechnology，2012，30（5）：460-465.

[14]EDGAR R C.UPARSE：Highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J].Nature methods，2013，10（10）：996-998.

[15]QUAST C，PRUESSE E，YILMAZ P，et al.The SILVA ribosomal RNA gene database project：Improved data processing and web-based tools[J].Nucleic acids research，2013，41：D590-D596.

[16]DESANTIS T Z，HUGENHOLTZ P，LARSEN N，et al.Greengenes，a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB[J].Applied & environmental microbiology，2006，72（7）：5069-5072.

[17]CAPORASO J G，BITTINGER K，BUSHMAN F D，et al.PyNAST：A flexible tool for aligning sequences to a template alignment[J].Bioinformatics，2010，26（2）：266-267.

[18]蔣微，張坤琳，王靜，等.奶牛生殖道微生態(tài)學的研究進展[J].飼料廣角，2013（8）：36-37.

[19]陳晴，樊尚榮.非培養(yǎng)法檢測陰道微生態(tài)的進展[J].醫(yī)學綜述，2012，18（15）：2467-2470.

[20]劉勛.基于高通量測序的健康與子宮內(nèi)膜炎奶牛陰道菌群差異性研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學，2015.

[21]李紅梅，白林，姜冬梅，等.基于16SrDNA高通量測序方法檢測豬舍空氣微生物多樣性[J].中國畜牧雜志，2015，51（3）：81-84.

[22]劉超遜.健康與患子宮內(nèi)膜炎水牛子宮內(nèi)細菌組的比較分析[D].南寧：廣西大學，2013.

[23]彭宇.體外培養(yǎng)和分子生物學技術研究奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)菌群的動態(tài)變化[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2011.

[24]SANTOS T M A，GILBERT R O，BICALHO R C.Metagenomic analysis of the uterine bacterial microbiota in healthy and metritic postpartum dairy cows[J].Journal of dairy science，2011，94（1）：291-302.

[25]BICALHO M L S，SANTIN T，RODRIGUES M X，et al.Dynamics of the microbiota found in the vaginas of dairy cows during the transition period：Associations with uterine diseases and reproductive outcome[J].Journal of dairy science，2017，100（4）：3043-3058.

[26]冉曉霞，蔡蕾，馬芳，等.宮腔菌群與常見子宮內(nèi)膜疾病及妊娠研究進展[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2019，28（2）：149-150.

[27]KUBYSHKIN A V，ALIEV L L，F(xiàn)OMOCHKINA I I，et al.Endometrial hyperplasia-related inflammation：Its role in the development and progression of endometrial hyperplasia[J].Inflammation research，2016，65（10）：785-794.

[28]CHEN L M，XU Y S，CHEN X Y，et al.The maturing development of gut microbiota in commercial piglets during the weaning transition[J/OL].Frontiers microbiology，2017，8[2020-03-26].https：∥doi.org/10.3389/fmicb.2017.01688.

[29]黃安妮，閆鶴.患子宮內(nèi)膜炎母豬陰道菌群變化與發(fā)病關系研究[J].中國獸醫(yī)雜志，2019，55（2）：19-22.