姚鑫鑫 吳春陽(yáng) 李志明

摘要 [目的]探討奶牛陰道菌群的多樣性與奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎發(fā)病之間的關(guān)聯(lián)性。[方法]隨機(jī)采集30頭牛的陰道分泌物，對(duì)其分泌物進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，將測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行除雜等處理后，使用UPARSE軟件對(duì)不同樣本細(xì)菌的豐度及多樣性進(jìn)行分析，記錄所采集的30個(gè)樣本產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病情況。[結(jié)果]4頭奶牛產(chǎn)后患有子宮內(nèi)膜炎，發(fā)病率為13.33%。不同樣本的陰道菌群差異顯著但在患病樣本中卻有一定的相似性。產(chǎn)前陰道菌群的OTU（operational taxonomic unit）個(gè)數(shù)均在100以上且豐度也較大，且菌群中多以短小芽孢桿菌（Bacillus_pumilus）為主的奶牛產(chǎn)后易患子宮內(nèi)膜炎。[結(jié)論]奶牛產(chǎn)前陰道菌群的多樣性變化可為產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病提供早期預(yù)警，對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎的防治具有一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞 16S rDNA測(cè)序技術(shù);子宮內(nèi)膜炎;奶牛;陰道菌群

Abstract [Objective]To investigate the correlation between the diversity of vaginal microflora and the incidence of postpartum endometritis in dairy cows. [Method]The vaginal secretions of 30 cattle were randomly collected， and 16S rDNA sequencing was made on the secretions. After impurity removal and other processing， UPARSE software was used to analyze the abundance and diversity of bacteria in different samples， and the incidence of postpartum endometritis in 30 samples collected was recorded.[Result]The incidence of endometritis postpartum was found in four cows，the incidence rate reached 13.33%. Although the difference of vaginal microflora in different samples was significant， but there were some similarities in the diseased samples.The amount of OTU （operational taxonomic unit） of prenatal vaginal flora was more than 100， and its abundance was also large.Moreover， most cows with Bacillus pumilus as their main species were prone to suffer from postpartum endometritis.[Conclusion]The diversified changes of prenatal vaginal microflora in dairy cows could provide early warning for the incidence of postpartum endometritis， which had certain reference values for the prevention and treatment of dairy cows endometritis.

Key words 16S rDNA sequencing technology;Endometritis;Dairy cow;Vaginal flora

子宮內(nèi)膜炎是奶牛產(chǎn)后經(jīng)常發(fā)生的一種群發(fā)普通病，主要以子宮內(nèi)膜發(fā)生炎癥、陰道流出污濁或黏性分泌物為特征，給養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。據(jù)報(bào)道，子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率約占英國(guó)不孕牛的95%[2]。許多奶牛發(fā)生不孕癥的原因大部分是由于患有子宮內(nèi)膜炎。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)奶牛與其他品種牛相比更容易發(fā)生與繁殖障礙相關(guān)的疾病，發(fā)病率為15%～20%。在患有不孕癥的牛中，子宮內(nèi)膜炎所引起的不孕癥占50.62%[3-4]。奶?；疾『螅∏檩^輕者與健康牛相比休情期明顯延長(zhǎng)，影響繁殖與配種，進(jìn)而影響泌乳量，病情較重者會(huì)造成繁殖能力喪失[5]。動(dòng)物菌群與動(dòng)物健康間的關(guān)系一直以來(lái)是科學(xué)家們廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)和研究方向。近年來(lái)，有研究人員發(fā)現(xiàn)，奶牛陰道菌群失衡是導(dǎo)致其發(fā)病的根本因素。在生殖道內(nèi)的特定部位微生物種類繁多，這些微生物與環(huán)境和宿主間互相保持平衡并維持其生殖系統(tǒng)的正常生理功能，認(rèn)清這三者之間的關(guān)系直接關(guān)系到各種疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，感染HR-HPV的女性陰道菌群結(jié)構(gòu)與未感染的女性明顯不同。前者具有明顯增加的物種多樣性，主要表現(xiàn)為乳酸桿菌的減少和陰道加德納菌的增加[8]。 HSV-2陰道感染的雌性小鼠同樣表現(xiàn)出顯著的微生物變化[9]。宮頸樣品中的微生物群成為檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥患病風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)[10]。奶牛子宮內(nèi)細(xì)菌感染是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的過(guò)程，細(xì)菌種類遵循特定的進(jìn)展模式[11]。然而，子宮菌群在子宮疾病發(fā)展中的潛在作用需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明。筆者選用16S rDNA方法，對(duì)奶牛陰道菌群的組成及其多樣性進(jìn)行了分析，并對(duì)其與產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎發(fā)病率之間的相關(guān)性進(jìn)行研究，從陰道菌群的角度探究奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的早期預(yù)警，旨在為子宮內(nèi)膜炎的預(yù)防、診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料。

從北京市平谷區(qū)順陽(yáng)光農(nóng)場(chǎng)采集了30頭荷斯坦牛的陰道分泌物，同時(shí)跟蹤記錄其人工輸精、妊娠、分娩以及產(chǎn)后患子宮內(nèi)膜炎情況。

1.1.2 主要試劑。

CTAB（自配）、HiFi Hot Start Ready Mix（Kapa，KK2501）、Qubit dsDNA Assay Kit（Life Technologies，Q328520）。

1.1.3 儀器與耗材。

PCR擴(kuò)增儀（Bio-rad，580BR10905）、超凈工作臺(tái)、水平電泳儀（Tanon，HE-120）、微量移液器（Eppendorf）、Bioanalyzer（Aglient，2100）、離心管（Axygen）、高速離心機(jī)（Eppendorf，Centrifuge 5418）、凝膠成像分析儀（Tanon 2500）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取。

試驗(yàn)采用DNA試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟提取樣本的基因組DNA，將提取的DNA通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度。取提取的樣品適量置于離心管中，將其稀釋至濃度1 ng/μL，備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增。

以稀釋后的樣品為模板，根據(jù)選擇的對(duì)應(yīng)測(cè)序區(qū)域，引物選用帶Barcode的特異引物，酶選擇KAPA公司的高保真酶（HiFi Hot Start Ready Mix），點(diǎn)樣混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。鑒定細(xì)菌多樣性對(duì)應(yīng)區(qū)域?yàn)?6S V3～V4 區(qū)（引物為343F和798R，如表1所示），若為其他區(qū)域請(qǐng)將區(qū)域及引物進(jìn)行替換。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化。

采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)PCR產(chǎn)物，然后使用磁珠純化，繼續(xù)進(jìn)行二輪PCR擴(kuò)增。接著重復(fù)上述純化步驟，將最后的PCR產(chǎn)物Qubit定量后上機(jī)測(cè)序。

1.2.4 菌群的多樣性分析。

使用Trimmomatic軟件對(duì)原始雙端測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行去雜，目的是去掉模糊堿基和低質(zhì)量堿基，進(jìn)一步提高拼接率[12]。將去雜后的雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接進(jìn)行后續(xù)分析，拼接使用FLASH 1.2.11軟件[13]進(jìn)行，并對(duì)拼接后的reads數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。隨后進(jìn)一步進(jìn)行去雜，將獲取的序列進(jìn)行去嵌合體序列處理。進(jìn)行一系列步驟后得到較優(yōu)質(zhì)的序列，以便進(jìn)行下游分析。

使用Uparse[14]軟件進(jìn)行OTU劃分，其相似度為97%。然后從各OTU中挑選豐度最大的序列作為代表。與Silva-16S數(shù)據(jù)庫(kù)[15]（默認(rèn)使用Silva-16S數(shù)據(jù)庫(kù)[16]）進(jìn)行比對(duì)，用最終得到的數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和OTU分類表格，然后進(jìn)行α和β多樣性分析。

將以上OTUs聚類分析結(jié)果不同樣品之間共有和特有的OTUs進(jìn)行分類及分析，繪制出花瓣圖。

挑選出各個(gè)OTUs的代表序列后，根據(jù)序列比對(duì)，使用pynast[17]軟件對(duì)挑選出的OTUs代表序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的構(gòu)建，生成進(jìn)化樹(shù)，最后統(tǒng)計(jì)出各個(gè)OTUs的豐度，挑選出reads最多的TOP100的OTUs，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，對(duì)應(yīng)OTUs在不同樣本中的豐度，分析不同物種之間的進(jìn)化關(guān)系。根據(jù)分類的OTU結(jié)果以及各個(gè)OTUs的豐度（reads數(shù)目），進(jìn)行OTU的Heatmap 繪制，Heatmap 中的顏色表示一個(gè)OTU或分類所包括的序列數(shù)目水平（reads），紅色表示高水平，藍(lán)色表示低水平，數(shù)字表示某個(gè)樣品中分類所包括的序列數(shù)目。

根據(jù)樣本中各個(gè)物種的比例繪制圖形，以柱狀圖和面積圖的形式表現(xiàn)。柱狀圖以及面積圖中面積較大的物種為較優(yōu)勢(shì)物種。

多樣性分析以PCoA（principal co-ordinates analysis）和NMDS（nonmetric multidimensional scaling）進(jìn)行。將PCoA中的特征向量和特征值進(jìn)行排序，以便于觀察個(gè)體、群體間的差異。 NMDS可以展示比對(duì)樣本組之間的差異。

最后，采用隨機(jī)重復(fù)抽樣算法對(duì)UPGMA的可靠性進(jìn)行分析。Jackknifed重復(fù)抽樣UPGMA 樹(shù)狀圖可用來(lái)與整個(gè)數(shù)據(jù)集分析生成的UPGMA圖進(jìn)行對(duì)比，最終得到一個(gè)支持結(jié)果及樹(shù)狀圖，用以觀察樣本的相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 宮內(nèi)膜炎發(fā)病情況

由表2可知，采集于北京平谷地區(qū)順陽(yáng)光農(nóng)場(chǎng)的30頭奶牛中，序號(hào)S3、S13、S14、S20的奶牛人工輸精后產(chǎn)后患有子宮內(nèi)膜炎，發(fā)病率為13.33%。

2.2 不同樣本陰道菌群的OTU分析

從圖1可以看出，產(chǎn)后患子宮內(nèi)膜炎的S3樣本中特有的OTUs個(gè)數(shù)為422個(gè)，S13特有的OTUs個(gè)數(shù)為849個(gè)，S14特有的OTUs個(gè)數(shù)為193個(gè)，S20特有的OUTs個(gè)數(shù)為100個(gè)。產(chǎn)后未患子宮內(nèi)膜炎的樣本牛中特有的OTUs個(gè)數(shù)普遍低于100個(gè)，個(gè)別樣本特有的OTUs個(gè)數(shù)大于100個(gè)，但遠(yuǎn)低于S3和S13中的特有的OTUs個(gè)數(shù)。

通過(guò)觀察基于OTU繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，S3和S13樣本中感染細(xì)菌的豐度顯著高于其他樣本，其他樣本的細(xì)菌豐度差異不大（圖2）。

從基于豐度繪制的樣本細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)分布可以看出，S3樣本中以短小芽孢桿菌（Bacillus_pumilus）、蔬菜芽孢桿菌（Bacillus_oleronius）和鏈霉菌（Streptomyces_sp._KP17）為主。S13樣本中以短小芽孢桿菌（Bacillus_pumilus）和乳酸鏈球菌（Lactococcus_lactis）為主。S14主要以環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus_circulans）和短小芽孢桿菌（Bacillus_pumilus）為主。S20主要以多動(dòng)物鏈球菌（Streptomyces_pluranimalium）、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus_circulans）和短小芽孢桿菌（Bacillus_pumilus）為主（圖3）。

根據(jù)分類的OTU結(jié)果以及各個(gè)OTUs的豐度，進(jìn)行OTU的Heatmap繪制，結(jié)果如圖4所示，北京市平谷區(qū)順陽(yáng)光農(nóng)場(chǎng)奶牛陰道菌群中主要以芽孢桿菌為主，其中以蠟樣芽孢桿菌（Bacillus_cereus）為主的奶牛產(chǎn)后普遍沒(méi)有患子宮內(nèi)膜炎，而以短小芽孢桿菌為主的奶?；甲訉m內(nèi)膜炎的概率大大增加，也不排除其他條件性致病菌在特殊情況下引起的奶牛子宮內(nèi)膜炎。

2.3 β多樣性分析結(jié)果

通過(guò)多樣性分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)各個(gè)樣本的菌落組成差異比較顯著。

采取隨機(jī)重復(fù)抽樣算法對(duì)UPGMA的可靠性進(jìn)行分析。Jackknifed重復(fù)抽樣UPGMA樹(shù)狀圖可用來(lái)與整個(gè)數(shù)據(jù)集分析生成的UPGMA圖進(jìn)行對(duì)比，最終得到一個(gè)支持結(jié)果以及樹(shù)狀圖。結(jié)果顯示，S3和S13以及S14樣本具有一定的菌落相似性，S20樣本完全獨(dú)立于另外3個(gè)患產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的樣本（圖5）。

3 討論

奶牛陰道正常菌群的形成是機(jī)體和環(huán)境相互適應(yīng)的結(jié)果，菌群、動(dòng)物機(jī)體和環(huán)境三者之間存在一種動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，由于各種因素均可輕易破壞奶牛陰道菌群，因此奶牛陰道菌群的研究是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題[18-19]。但隨著各項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展及深入，基因檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)加快了奶牛陰道菌群研究的進(jìn)展。其中，Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)是目前用于研究奶牛陰道微生物多樣性的重要手段及先進(jìn)技術(shù)[20]。

Illumina MiSeq技術(shù)試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)量大、準(zhǔn)確率相對(duì)較高，得到并鑒定的細(xì)菌類型多，有利于奶牛陰道內(nèi)許多低豐度菌屬和未知細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)，因此被廣泛用來(lái)進(jìn)行各種微生物致病菌的分離和鑒定[21]。相關(guān)研究人員用16Sr DNA測(cè)序的方法，發(fā)現(xiàn)健康牛子宮細(xì)菌以Firmicutes和Bacteroidetes為主[22]。彭宇[23]將分娩后10、20、30、40 d的奶牛樣本分別進(jìn)行基因提取、擴(kuò)增和測(cè)序，將V6～V8為目標(biāo)片段區(qū)域進(jìn)行DGGE分析并進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明分娩后10 d的未患病奶牛陰道內(nèi)的主要細(xì)菌為Bacteroides和Porphyromonas;40 d健康奶牛陰道內(nèi)的主要細(xì)菌為T(mén)enericutes。Santos等[24]將患有子宮炎的奶牛樣品進(jìn)行對(duì)比，利用PCR-DGGE方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未患病奶牛陰道的優(yōu)勢(shì)菌為Gammaproteobacteria和Tenericutes。該研究對(duì)陰道微生物測(cè)序時(shí)亦采用16S rDNA測(cè)序法，將V3～V4區(qū)作為靶目標(biāo)測(cè)序片段，運(yùn)用Illumina MiSeq技術(shù)將30頭奶牛陰道標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)菌群分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前陰道菌群的OTU（operational taxonomic unit）個(gè)數(shù)較多且均在100以上且豐度也較大，菌群中多以短小芽孢桿菌（Bacillus_pumilus）為主的奶牛產(chǎn)后易患子宮內(nèi)膜炎。通過(guò)不同樣本的OTU分析發(fā)現(xiàn)，未患病奶牛陰道菌群與患病奶牛陰道菌群對(duì)比，前者OTU個(gè)數(shù)較少，而后者OTU個(gè)數(shù)相對(duì)較多，患病樣本S3和S13的細(xì)菌豐度最顯著，但S14和S20樣本的細(xì)菌豐度與其他未患病樣本差異不大。研究表明，在產(chǎn)后第7天患子宮內(nèi)膜炎母牛的擬桿菌含量較高。在產(chǎn)后發(fā)熱的奶牛、初產(chǎn)奶牛、有輔助分娩的奶牛和生雙胞胎的奶牛中，富集細(xì)菌和擬桿菌的負(fù)荷也更高。微生物群組成和總細(xì)菌載量與子宮疾病和生殖衰竭的已知圍產(chǎn)期危險(xiǎn)因素有關(guān)[25]。人因子宮良性疾病（如子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎等），除外生殖道感染后需行手術(shù)治療患者，從患者陰道、宮頸管及直腸子宮陷凹等處收集抽吸液，進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序，結(jié)果顯示患者生殖道的微生物菌群隨著定植部位的改變而變化，下生殖道仍以乳酸桿菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，隨著生殖道的上行宮腔、輸卵管、道格拉斯腔液，乳酸桿菌在各部位的豐度逐漸下降，相反地，假單胞菌（Pseudomonas）和鮑氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacte）豐度逐漸增加[26]。宮腔菌群的改變引起了子宮內(nèi)膜炎癥反應(yīng)機(jī)制的改變，釋放多種炎性物質(zhì)，促進(jìn)慢性子宮內(nèi)膜炎等疾病的發(fā)生和發(fā)展及惡變的危險(xiǎn)因素[27]。研究顯示，健康Gttingen 迷你豬陰道菌群的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)主要富集厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和梭桿菌門(mén)5個(gè)門(mén)。患有子宮內(nèi)膜炎的母豬，變形菌門(mén)占比顯著增加，該門(mén)包含有大量的大腸桿菌和志賀氏桿菌等致病菌[28]。除變形菌門(mén)以外，其余4個(gè)健康組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)在患病后相對(duì)豐度均呈現(xiàn)相應(yīng)降低[29]。

北京市平谷區(qū)順陽(yáng)光農(nóng)場(chǎng)30頭牛中僅有4頭牛產(chǎn)后患有子宮內(nèi)膜炎，整體發(fā)病率為13.33%。這30頭奶牛陰道菌群的組成無(wú)論產(chǎn)后是否患子宮內(nèi)膜炎，其菌落組成差異均顯著，說(shuō)明菌落組成與產(chǎn)后患子宮內(nèi)膜炎沒(méi)有必然的聯(lián)系。然而，通過(guò)比較各個(gè)樣本的相似性發(fā)現(xiàn)S3、S14、S13樣本相似性較大，說(shuō)明該相似樣本患產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的風(fēng)險(xiǎn)較大。但S20樣本卻完全獨(dú)立于另外3個(gè)患病樣本。因此，不能忽視其他組樣本菌落的組成差異，同樣有患子宮內(nèi)膜炎的風(fēng)險(xiǎn)。

總而言之，奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎患病因素很多，陰道菌群組成復(fù)雜，陰道菌群間組成差異與產(chǎn)后奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病之間沒(méi)有必然聯(lián)系，僅具有一定的指示作用，要綜合考慮各個(gè)方面因素，才能有效防治奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生。

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