朱楊帆，何 江，黃歆怡，莫干輝，黃雪梅，陳豪軍，歐景莉，陳 燕，寧 琳，周俊岸，榮 濤

(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，南寧，530001)

楊桃AverrhoacarambolaL.又名洋桃、三穩(wěn)子、五斂子等，屬酢漿草科(Oxalidaceae)楊桃屬植物，原產(chǎn)于東南亞熱帶亞熱帶地區(qū)，主要分布在我國(guó)廣東、廣西、云南、福建、海南、臺(tái)灣等地區(qū)，是一種久負(fù)盛名的嶺南佳果[1-2]。我國(guó)楊桃栽培歷史悠久，20世紀(jì)80年代以后，逐漸從馬來(lái)西亞、新加坡等地引進(jìn)大果甜楊桃[3]。楊桃新品種選育方面，主要是從實(shí)生苗和嫁接苗中選擇優(yōu)良單株，選育的楊桃新品種主要有臺(tái)農(nóng)1號(hào)[4]、臺(tái)農(nóng)4號(hào)[5]、大果甜楊桃3號(hào)[6]、大果甜楊桃4號(hào)[7]等,但遠(yuǎn)不能滿足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)需求，楊桃新品種選育對(duì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義?；ǚ刍盍y(cè)定是開(kāi)展育種工作的基礎(chǔ)，楊桃花粉活力測(cè)定方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。測(cè)定花粉活力主要有TTC染色法、醋酸洋紅染色法、I2—KI染色法、離體萌發(fā)法等。由于染色法測(cè)定花粉活力只能反映花粉內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量或代謝情況，且顏色判斷存在主觀因素導(dǎo)致誤差較大；離體萌發(fā)法被認(rèn)為是檢測(cè)花粉活力較為可靠的方法[8]。有關(guān)研究表明，蔗糖[9]、硼酸[10]、鈣離子[11]在花粉離體萌發(fā)中對(duì)萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用。因此，我們研究了不同濃度蔗糖、硼酸、氯化鈣條件對(duì)楊桃花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)的影響，旨在為楊桃科學(xué)授粉和育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以廣西亞熱帶作物研究所楊桃種質(zhì)資源圃的楊桃品種“香蜜”“夏威夷”為試材。

1.2 方法

在早晨花未完全開(kāi)放前用鑷子及時(shí)采摘當(dāng)日開(kāi)放花朵，放入硫酸袋中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行花粉培養(yǎng)。

以略微改動(dòng)的BK培養(yǎng)基[11]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用單因素試驗(yàn)篩選培養(yǎng)基各組分最佳濃度，蔗糖設(shè)5%、10%、15%、20%等4個(gè)濃度，硼酸設(shè)0.001%、0.01%、0.1%等3個(gè)濃度，氯化鈣設(shè)0.001%、0.01%、0.1%等3個(gè)濃度；探討不同因素對(duì)花粉萌發(fā)的影響時(shí)，待探討因素設(shè)置不同濃度梯度，以濃度0為對(duì)照，其余因素均以BK培養(yǎng)基(含10%蔗糖、0.01%硼酸、0.01%氯化鈣)為假設(shè)的最適宜濃度。

花粉培養(yǎng)采用液體培養(yǎng)法。在凹槽載玻片的凹面中間滴加培養(yǎng)液50 μL，用鑷子取發(fā)育良好的6朵花的所有花藥于培養(yǎng)液中，用鑷子輕輕點(diǎn)壓載玻片上的花藥，使花粉充分散落于培養(yǎng)液中。將載玻片放入鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，在30 ℃條件下保濕培養(yǎng)3 h。用光學(xué)顯微鏡觀察，每個(gè)載玻片選取3個(gè)不重復(fù)的視野，每個(gè)視野花粉數(shù)不少于20粒，以花粉管長(zhǎng)度大于花粉直徑視為萌發(fā)?；ǚ勖劝l(fā)率(%)=視野內(nèi)已萌發(fā)的花粉數(shù)/視野內(nèi)花粉總數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù)，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用PASW Statistics 18軟件進(jìn)行差異顯著性分析，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件測(cè)量花粉管長(zhǎng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖濃度的影響

由表1可以看出，蔗糖是楊桃花粉萌發(fā)的一個(gè)重要因素，當(dāng)培養(yǎng)基的蔗糖濃度為0時(shí)，“香蜜”“夏威夷”的花粉萌發(fā)率極低，分別為0.87%和0.92%。隨著蔗糖濃度升高，花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度均呈先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到10%時(shí)，“香蜜”“夏威夷”花粉的萌發(fā)率均達(dá)到峰值，分別為79.56%和79.77%，顯著地高于其他濃度處理；同時(shí)花粉管長(zhǎng)度也達(dá)到最大值，分別為295.07 μm和271.71 μm，也顯著地高于其他濃度處理。當(dāng)蔗糖濃度達(dá)15%時(shí)，兩個(gè)品種的花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度比10%蔗糖處理顯著地降低，“香蜜”花粉萌發(fā)率降至9.18%，而“夏威夷”花粉萌發(fā)率降低幅度較小，為51.43%。當(dāng)蔗糖濃度為20%時(shí)，“香蜜”“夏威夷”花粉的萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度均降至對(duì)照水平，花粉的萌發(fā)率分別為0.27%和4.31%，花粉管長(zhǎng)度分別為38.00 μm和42.54 μm。

表1 不同蔗糖濃度培養(yǎng)基對(duì)兩個(gè)品種楊桃花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)的影響

2.2 鈣離子濃度的影響

由表2可知，鈣離子濃度為0時(shí)，兩個(gè)品種的花粉都能夠萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)50%以上，花粉管長(zhǎng)度也都達(dá)到280 μm以上。鈣離子濃度為0.01%時(shí)，兩個(gè)品種花粉萌發(fā)率都達(dá)到79%以上，顯著高于對(duì)照，明顯促進(jìn)了花粉萌發(fā)；而鈣離子濃度0.1%時(shí)，兩個(gè)品種的花粉萌發(fā)率均顯著低于對(duì)照，“香蜜”“夏威夷”萌發(fā)率分別降低至11.17%和53.96%，過(guò)高的鈣離子濃度抑制花粉萌發(fā)，但對(duì)“夏威夷”花粉萌發(fā)的抑制作用較弱。

2.3 硼酸濃度的影響

從表3可知，硼酸對(duì)楊桃花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的影響和鈣相似。硼酸濃度為0時(shí)，兩個(gè)品種的花粉都能夠萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)64%以上，花粉管長(zhǎng)度也都達(dá)到275 μm以上。當(dāng)硼酸濃度為0.01%時(shí)，兩個(gè)品種楊桃的萌發(fā)率均最高，分別為79.56%和79.77%，“香蜜”花粉萌發(fā)率顯著高于對(duì)照，“夏威夷”花粉萌發(fā)率與對(duì)照無(wú)顯著性差異。而硼酸濃度0.1%時(shí)，“香蜜”“夏威夷”花粉的萌發(fā)率分別降低至2.84%和2.24%，顯著的低于其他處理，花粉管長(zhǎng)度也顯著降低，分別降低至111.69 μm和110.17 μm。過(guò)高硼酸濃度對(duì)楊桃花粉的萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)起到較強(qiáng)烈的抑制作用。

表2 不同鈣離子濃度培養(yǎng)基對(duì)兩個(gè)品種楊桃花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)的影響

表3 不同硼酸濃度培養(yǎng)基對(duì)兩個(gè)品種楊桃花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

適宜濃度的蔗糖對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)起到顯著的促進(jìn)作用。蔗糖不僅作為一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)提供能量，同時(shí)作為滲透物質(zhì)為花粉萌發(fā)提供所需的滲透壓[12]。蔗糖濃度適宜，能夠維持花粉和培養(yǎng)基之間的滲透壓平衡。蔗糖濃度過(guò)高，會(huì)造成花粉原生質(zhì)脫水，導(dǎo)致花粉質(zhì)壁分離；蔗糖濃度過(guò)低，花粉吸水，易造成花粉壁破裂，這兩種情況都會(huì)抑制花粉的萌發(fā)。因此，蔗糖濃度必須在適宜范圍內(nèi)才能促進(jìn)花粉萌發(fā)。不同植物花粉萌發(fā)所需培養(yǎng)基的蔗糖濃度有差異，應(yīng)該與品種遺傳差異和花粉所需滲透壓不同有關(guān)。有關(guān)研究表明，薄殼山核桃花粉萌發(fā)適宜的蔗糖濃度是20%～30%[13]；當(dāng)蔗糖200 g/L時(shí)甘蔗花粉的萌發(fā)率達(dá)到最高值[14]；促進(jìn)火龍果花粉萌發(fā)的蔗糖最佳濃度為25%[15]。本試驗(yàn)中，當(dāng)蔗糖濃度為0時(shí)，可使楊桃花粉萌發(fā)，但萌發(fā)率極低，可能由于楊桃花粉本身蘊(yùn)含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使花粉少量萌發(fā)。當(dāng)蔗糖濃度為10%時(shí)，兩個(gè)品種的花粉萌發(fā)率都達(dá)到最高，可能此時(shí)的蔗糖濃度最接近于楊桃花粉萌發(fā)所需的滲透壓條件，故萌發(fā)率較高。當(dāng)蔗糖濃度為15%時(shí)，兩個(gè)品種花粉的萌發(fā)率比10%蔗糖處理顯著降低；當(dāng)蔗糖濃度為20%時(shí)，“香蜜”“夏威夷”花粉的萌發(fā)率分別降低為0.27%和4.31%，在蔗糖濃度過(guò)高的條件下，“夏威夷”花粉萌發(fā)率比“香蜜”高，可能是“夏威夷”花粉在不利生長(zhǎng)的滲透壓條件下抗逆性更強(qiáng)，有關(guān)原理還需進(jìn)一步研究。

鈣離子在花粉管的極性生長(zhǎng)中起重要作用，鈣離子在花粉管的尖端聚集，向內(nèi)流十分活躍，鈣離子的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)花粉的萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)有重要影響[16]。相關(guān)研究中，“保羅蘭”睡蓮的花粉在氯化鈣20 mg/L時(shí)最適宜萌發(fā)[17]，氯化鈣5 mg/L適宜竹葉蘭花粉萌發(fā)[18]。本研究中，鈣離子濃度為0時(shí)，楊桃花粉有較高的萌發(fā)率，花粉管生長(zhǎng)較好，可能是楊桃花粉自身所含的鈣離子就能滿足花粉生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)外源鈣離子表現(xiàn)為非必需組分。鈣離子濃度為0.01%時(shí)，兩個(gè)品種的花粉萌發(fā)率均較高，顯著高于對(duì)照。因此，一定濃度的外源鈣離子能在一定程度上提高花粉萌發(fā)率。而鈣離子濃度為0.1%時(shí)，“香蜜”“夏威夷”花粉的萌發(fā)率降低，分別為11.17%和53.96%，均低于對(duì)照，過(guò)高濃度的鈣離子對(duì)花粉萌發(fā)起抑制作用。此時(shí)，“夏威夷”花粉萌發(fā)率高于“香蜜”，可能是“夏威夷”花粉在不利生長(zhǎng)的鈣離子濃度條件下抗逆性更強(qiáng)。

硼酸是促進(jìn)花粉萌發(fā)的另一重要組分，適宜的硼酸濃度可顯著提高花粉萌發(fā)率。硼酸對(duì)花粉管膜中的果膠合成有重要作用，參與花粉管頂端細(xì)胞壁的形成。此外，硼可與蔗糖形成絡(luò)合物，增加花粉糖含量，加強(qiáng)糖的代謝活動(dòng)[19]。相關(guān)研究表明，日本海棠花粉萌發(fā)的適宜硼酸濃度為0.02%[20]，香水蓮花花粉萌發(fā)最適硼酸濃度為0.001%[21]。本研究中，硼酸濃度為0時(shí)，楊桃花粉也有較高的萌發(fā)率，花粉管生長(zhǎng)也較好，可能是花粉本身所含的成分能夠滿足花粉萌發(fā)，對(duì)外源硼也表現(xiàn)為非必需組分。低濃度的硼酸能小幅度促進(jìn)花粉萌發(fā)率，但硼酸濃度為0.1%時(shí)，則會(huì)顯著抑制花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)。因此，在栽培管理中應(yīng)注意硼肥濃度，從成本角度考慮建議不用單施硼肥。

綜合來(lái)看，楊桃花粉萌發(fā)最適宜的培養(yǎng)條件為10%蔗糖+0.01%硼酸+0.01%氯化鈣，萌發(fā)率79%以上，花粉管長(zhǎng)度達(dá)270 μm以上。此外，蔗糖或鈣濃度過(guò)高時(shí)，“夏威夷”花粉萌發(fā)的抗逆性比“香蜜”更強(qiáng)，這對(duì)今后其雜交育種父本品種篩選等方面的研究具有參考價(jià)值。