趙伯杰，趙鼎，李瑞

遺傳性運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)病(hereditary motor and sensory neuropathies,HMSN)又稱腓骨肌萎縮癥(charcot-marie-tooth,CMT)，于1886年由法國Jean和Piere及英國醫(yī)生Howard率先報(bào)道，并命名為Charcot-Marie-Tooth病[1]，發(fā)病率為1/2500[2-3]。主要表現(xiàn)為進(jìn)行性對(duì)稱性遠(yuǎn)端感覺減退，肌無力、肌萎縮、腱反射減弱或消失，以及足部畸形等[4-5]。遺傳方式多為常染色體顯性遺傳，少部分是常染色體隱性遺傳、X-性連鎖顯性遺傳和X-性連鎖隱性遺傳[6]。常染色體顯性遺傳性CMT依據(jù)正中神經(jīng)傳導(dǎo)速度改變分為兩型，即脫髓鞘型(CMT1)，以神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢(正中神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度低于38 m/s)，神經(jīng)活檢示顯著的髓鞘異常(階段性脫髓鞘，雪旺細(xì)胞增生，呈“洋蔥頭”樣改變)為特征；以及軸索型(CMT2)以神經(jīng)傳導(dǎo)速度正?；蜉p度減慢(正中神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度大于38 m/s)，神經(jīng)活檢示慢性軸索變形和再生(軸索變形和有髓纖維減少，神經(jīng)再生簇形成)為特征[7-9]。迄今已發(fā)現(xiàn)的CMT2型致病基因有54個(gè)，根據(jù)致病基因不同，CMT2A2A被命名為相應(yīng)亞型。本研究中我們通過對(duì)一個(gè)典型的CMT2A2A型家系進(jìn)行臨床和基因突變檢測(cè)分析，旨在加強(qiáng)對(duì)該病的認(rèn)識(shí)，為家系遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

該CMT漢族家系來自于中國河南省鄭州市，3代共7人 (圖1)。先證者(Ⅲ代2)，男，6歲零10個(gè)月，3歲時(shí)發(fā)現(xiàn)走路不穩(wěn)，姿勢(shì)異常，前腳掌無法向上抬起，不會(huì)跳。查體示肢體上肢無異常，雙下肢遠(yuǎn)端對(duì)稱性肌肉無力、肌肉萎縮和感覺障礙，伴跟腱反射消失，出現(xiàn)鶴形腿、高弓足。先證者母親(Ⅱ代2)查體示雙下肢遠(yuǎn)端對(duì)稱性肌無力，大腿下1/3肌肉萎縮，呈倒立酒瓶狀、末梢型感覺減退、跨閾步態(tài)、腱反射消失，并進(jìn)行過腳部畸形矯正手術(shù)。其父親、姐姐及其他家系成員無相關(guān)癥狀。先證者簽署知情同意書后行全外顯子組基因測(cè)序檢測(cè)，并對(duì)先證者父母、姐姐進(jìn)行驗(yàn)證。

圖1 CMT患者系譜圖:先證者，○:女性患者，□：男性患者。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)電生理檢查

對(duì)先證者進(jìn)行周圍神經(jīng)傳導(dǎo)和同芯圓針極肌電圖(EMG)檢測(cè)， 采用丹迪Keypoint肌電誘發(fā)電位儀檢查。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)及腓腸神經(jīng)感覺傳導(dǎo)檢測(cè)采用盤狀電極記錄，鞍形電極刺激，其它感覺傳導(dǎo)檢測(cè)刺激用環(huán)狀電極(陰陽極間距離應(yīng)≥2 cm)，記錄用鞍形電極。帶通2～10 kHz，刺激時(shí)限0.2 ms，室溫21～25 ℃，皮膚溫度≥32 ℃。受檢患兒安靜，手足關(guān)節(jié)保持放松狀態(tài)，尺神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)檢測(cè)時(shí)肘關(guān)節(jié)屈曲20°左右。進(jìn)行同芯圓針極電極EMG檢查時(shí)，選擇至少3個(gè)肢體不同神經(jīng)支配的4塊以上肌肉，同芯圓針電極插入肌肉測(cè)定EMG，首先，在肌肉靜息狀態(tài)時(shí)，進(jìn)行多部位探測(cè)，觀察屏幕上的波形，并監(jiān)聽聲音，觀察是否有纖顫電位及正銳波等自發(fā)電位；然后進(jìn)行肌肉輕收縮檢查，觀察并采集屏幕上運(yùn)動(dòng)單位電位的波形，測(cè)定其平均時(shí)限。運(yùn)動(dòng)單位電位平均時(shí)限與正常值[10]比較，凡時(shí)限>20%為時(shí)限增寬。

1.2.2 全外顯子組基因測(cè)序

抽取患兒(先證者)、其姐姐及父母外周靜脈血樣各2 mL,采用QIAampDNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)提取基因組DNA。然后嚴(yán)格按照Ion-AmpliSeq Exome Kit試劑盒(美國Life公司)擴(kuò)增目的片段，經(jīng)過酶切、連接接頭序列、純化再擴(kuò)增獲得基因文庫，針對(duì)全外顯子組基因?qū)ο茸C者及其家系進(jìn)行全外顯子組基因測(cè)序。

1.2.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證

應(yīng)用軟件Primer Premier 5.0對(duì)可疑突變位點(diǎn)的外顯子編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物,應(yīng)用2×PCR MasterMix聚合酶(上海生工生化科技有限公司),進(jìn)行PCR擴(kuò)增(ABI-Veriti96孔梯度PCR儀MFN2上游引物序列為5’-GCTGCCAAGTTGTTTCTGGA-3’,下游引物序列為5’-GGCAGCTCTCTC CACCTATC-3’。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，25 ℃保存。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向直接測(cè)序(ABI 3730XL測(cè)序儀)，結(jié)果與參考序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.3 突變位點(diǎn)的生物信息學(xué)分析

將突變位點(diǎn)在NCBI、HGMD、EXAC、ESP 6 500及千人基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(duì)分析，以排除該突變位點(diǎn)為已知多態(tài)性位點(diǎn)。應(yīng)用PolyPhen-2和Mutation Taster軟件預(yù)測(cè)突變的有害性及突變位點(diǎn)在物種間的保守性。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)電生理檢查結(jié)果

神經(jīng)傳導(dǎo)檢查提示先證者感覺和運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)檢測(cè)均存在動(dòng)作電位波幅下降和傳導(dǎo)速度減慢，其中脛神經(jīng)(左)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度(MCV)為36.2 m/s(正常參考值>42.36 m/s)，復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(CMAP)波幅為0.12 mV(正常參考值>16.21 mV)[11]；脛神經(jīng)(右)MCV為33.7 m/s，CMAP波幅為1.55 mV(表1、2)。同芯圓針極EMG提示雙下肢及左上肢神經(jīng)及肌肉呈神經(jīng)原性損害(表3)。

表1 先證者的運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)測(cè)定結(jié)果比較

表2 先證者的感覺傳導(dǎo)測(cè)定結(jié)果比較

表3 先證者的同芯圓針極EMG結(jié)果比較

2.2 全外顯子組基因測(cè)序結(jié)果

高通量測(cè)序顯示,先證者1號(hào)染色體上的MFN2基因存在第11外顯子c.1066A>G錯(cuò)義突變，轉(zhuǎn)錄本為NM_014874.4。

2.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

Sanger測(cè)序結(jié)果與MFN2參考序列(NM_014874.4)經(jīng)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)先證者及其母親均存在c.1066A>G(p.T356A)錯(cuò)義突變(圖2A、B見封二)，先證者的這個(gè)突變來自于母親,其父親與姐姐未攜帶這個(gè)突變位點(diǎn)(圖2C、D見封二)?；純焊赣H與姐姐未檢測(cè)到該突變。

2.4 突變位點(diǎn)的生物信息學(xué)分析結(jié)果

利用生物信息分析軟件PolyPhen-2和Mutation Taster對(duì)c.1066A>G(p.T356A)突變進(jìn)行預(yù)測(cè)，提示其為致病性(圖3A、B見封二)，MFN2蛋白第356位氨基酸在不同物種間的保守性分析顯示突變區(qū)域序列在不同物種間高度保守(圖3C見封二)。

3 討論

CMT2A2A型是一種軸突周圍神經(jīng)病變疾病，屬于CMT2的一種亞型。該亞型臨床表現(xiàn)為四肢遠(yuǎn)端進(jìn)行性肌無力及肌肉萎縮，形成“鶴形腿”；足部骨骼畸形，出現(xiàn)高弓足、槌狀趾；手部骨間肌出現(xiàn)萎縮，形成爪形手；腱反射減弱或消失；四肢遠(yuǎn)端感覺受損。少數(shù)患者出現(xiàn)脊柱側(cè)凸、視力、聽力減退等癥狀，神經(jīng)傳異速度正?；蚪咏?。CMT2與CMT1的臨床癥狀類似，但是前者沒有后者嚴(yán)重，表現(xiàn)為周圍神經(jīng)沒有增大或增厚。CMT是一種高度遺傳異質(zhì)性疾病，即許多不同基因的缺陷可引起相同表型。據(jù)國內(nèi)報(bào)道的病例總結(jié)，有遺傳家族史的占88%,散發(fā)病例占12%，與國外報(bào)道的相似[12]。CMT2的亞型臨床上都比較相似，僅僅分子遺傳學(xué)上不同。多個(gè)研究小組的研究結(jié)果表明，MFN2基因突變導(dǎo)致的CMT2A是最常見的CMT2基因型，約占CMT2總數(shù)的20%，其臨床表現(xiàn)可分為早發(fā)肌無力，肌萎縮癥狀嚴(yán)重和遲發(fā)肌無力，肌萎縮癥狀較輕兩種臨床表型。MFN2基因熱點(diǎn)突變R94Q常導(dǎo)致幼年發(fā)病，為重度肌萎縮的軸索型CMT，患者常伴有視神經(jīng)萎縮的伴隨癥狀[13]。本研究收集的家系有2例患者，均由MFN2基因突變所致，主要表現(xiàn)為緩慢進(jìn)展的雙下肢對(duì)稱性肌肉無力伴跟腱反射消失、足部畸形。本家系所涉及患者均有弓形足，形成原因不清，有學(xué)者推測(cè)可能與疾病早期內(nèi)側(cè)與小腿的肌肉不平衡萎縮有關(guān)[14]。家系譜特點(diǎn)為連續(xù)兩代出現(xiàn)同樣疾病受累，性別無明顯差異，此家系符合常染色體顯性遺傳模式，外顯率為100%。

本例家系先證者神經(jīng)電生理檢查顯示感覺及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)均出現(xiàn)了傳導(dǎo)速度減慢，波幅降低，以CMAP波幅降低為著，多條神經(jīng)不能引出波形，為脫髓鞘和軸索混合性改變。臨床上通常將神經(jīng)傳導(dǎo)速度作為鑒別腓骨肌萎縮癥脫髓鞘型(CMT1)與軸索型(CMT2)的重要依據(jù)之一。本研究中先證者出現(xiàn)CMAP波幅下降伴神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯減慢。由于CMT是一種遺傳性慢性進(jìn)行性疾病，隨著病程延長、周圍神經(jīng)損害加重，無論是周圍神經(jīng)脫髓鞘還是軸索變性，均可能出現(xiàn)神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著減慢伴CMAP波幅下降甚至不能引出波形，故此時(shí)僅依據(jù)神經(jīng)電生理參數(shù)難以鑒別原發(fā)病變是脫髓鞘性還是軸索性損害。因此，明確CMT的分型仍需依靠基因診斷。

CMT2型主要遺傳方式為常染色體顯性遺傳，占CMT的20%～40%左右，其中最常見類型為MFN2基因突變導(dǎo)致的CMT2A2A型，約占8%～33.3%。MFN2基因定位于人類染色體1p36.2區(qū)，全長33kb，包含17個(gè)外顯子，由757個(gè)氨基酸殘基組成，位于線粒體外膜上并且兩次跨線粒體外膜。編碼的線粒體融合蛋白2廣泛表達(dá)于心肌、骨骼肌等處，此蛋白可調(diào)節(jié)線粒體的融合，維持其融合與裂解動(dòng)態(tài)平衡，在線粒體代謝過程中維持其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。最常見致病機(jī)理為點(diǎn)突變。MFN2基因突變引起的過度表達(dá)或過少表達(dá)均可導(dǎo)致線粒體能量代謝的動(dòng)態(tài)平衡紊亂，從而影響神經(jīng)元營養(yǎng)物質(zhì)和結(jié)構(gòu)蛋白向軸突的運(yùn)輸，導(dǎo)致軸突發(fā)生變性而引起CMT2A2A。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)患病家系中所有患者的MFN2基因均發(fā)生第11外顯子c.1066A>G的雜合錯(cuò)義突變。經(jīng)檢索c.1066A>G突變?yōu)橐褕?bào)道的致病性突變。p.T356A突變利用生物信息分析軟件PolyPhen-2和MutationTaster預(yù)測(cè)蛋白功能及物種保守性，其預(yù)測(cè)結(jié)果為致病性,物種保守性分析顯示,MFN2蛋白第356位氨基酸在不同的物種間幾乎完全相同,表明在進(jìn)化上高度保守。

綜上所述,本家系具有顯性遺傳2A2A型CMT的臨床特點(diǎn)，MFN2基因c.1066A>G(p.T356A)突變?yōu)槠渲虏⌒酝蛔?。目前尚無有效的治療手段，主要是對(duì)癥和支持療法，可采用理療、按摩及肢體功能訓(xùn)練等康復(fù)醫(yī)療措施。由于本病病情進(jìn)展緩慢，預(yù)后相對(duì)良好，及時(shí)診斷和治療可延緩疾病的發(fā)展，注意避免使用對(duì)神經(jīng)有害的藥物以提高患者的生活品質(zhì)。另外，認(rèn)識(shí)該病特點(diǎn)、神經(jīng)電生理表現(xiàn)和基因檢測(cè)有助于早期確診、早期治療，為遺傳咨詢提供依據(jù)。