陳天瑩，胡 峻，李孟純，喬自林，李 鈾，2*

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730100；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心/甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030）

綿羊是世界上最早馴化的一批畜種。我國綿羊品種種類繁多。世界上不同生產(chǎn)方向的綿羊品種和類型有700多個(gè)，其中大部分是用來生產(chǎn)毛與肉[1]。就綿羊的分布而言，其在世界各地均有分布，并且不同國家地區(qū)通過雜交育種等方式培養(yǎng)了一系列新型品種，比如，法國國立農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院曾致力于培育新的基因型品種羅曼諾夫羊×白里松羊，新培育的基因型品種與純血統(tǒng)的母本品種相比，每只母羊產(chǎn)羔數(shù)增加了65%[2]。法國還利用“拉康”羊與東弗里生羊和沙爾金羊進(jìn)行多品種雜交，所培育的新品種繼承了東弗里生產(chǎn)奶量高，沙爾金羊易擠奶、對(duì)當(dāng)?shù)貤l件適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[2]。早在20世紀(jì)70年代，西德北威斯特伐利亞就引進(jìn)了蘭頭門羊并與代克塞、東弗里生和德國黑頭羊等品種進(jìn)行雜交，培育出的新品種具有產(chǎn)羔率高，早熟，肉品質(zhì)好的特點(diǎn)[2]。

我國綿羊品種種類繁多，結(jié)合各地區(qū)的氣溫以及地形等因素，可將我國綿羊分布劃分為多個(gè)區(qū)域，由沿海區(qū)的寒羊、湖羊，到云貴高原區(qū)的小尾寒羊，再到北疆區(qū)的哈薩克羊、當(dāng)巴什羊[3]。地域的差異造就了綿羊品種的不同，并且通過雜交培育出了藏系綿羊，它適應(yīng)高寒牧區(qū)惡劣的自然環(huán)境，耐粗放的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件，具有產(chǎn)肉性能良好、毛纖維長、光澤良好等優(yōu)點(diǎn)。

但由于長期進(jìn)行雜交，新的經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的品種不斷形成導(dǎo)致世界各國生產(chǎn)性能低的古老地方品種和培育品種，趨于減少，瀕于消失甚至泯滅，并引發(fā)世界性的畜禽品種資源危機(jī)[4]，綿羊資源的保護(hù)迫在眉睫。目前已出現(xiàn)利用地方品種來改造培育品種達(dá)到對(duì)該物種保護(hù)的目的，如在澳大利亞，有學(xué)者提出，由非洲國家引入無毛羊給澳洲美利奴羊?qū)胍淮窝?，在保留澳洲美利奴羊現(xiàn)有價(jià)值的特性不變情況下，提高其耐苦性和適應(yīng)性，使澳洲美利奴羊在干旱地區(qū)得到發(fā)展[5]。我國的洼地綿羊則采取了建立洼地綿羊純種保護(hù)區(qū)，育種核心群、凍精凍胚保種基因庫、純種繁育體系等方式[6]，對(duì)該物種進(jìn)行有效的保護(hù)。

在我國甘肅省分布有藏羊、大尾羊與小尾羊等品種。其中蘭州大尾羊（Lanzhou fat tailed sheep）是我國特有的綿羊地方品種，但同時(shí)也是一個(gè)瀕臨滅絕的畜種，研究結(jié)果表明，其滅絕頻率為0.77，為北方11個(gè)綿羊品種之首，品種貢獻(xiàn)率為10.52%，居于第三，保護(hù)潛力為0.141 9，居第1位。因此，保護(hù)蘭州大尾羊這一珍貴的地方綿羊品種迫在眉睫[7]。

線粒體DNA（mtDNA）是動(dòng)物體內(nèi)唯一長期、穩(wěn)定存在的核外基因組，其在世代間沒有基因重組，呈現(xiàn)嚴(yán)格母系遺傳，mtDNA在細(xì)胞內(nèi)以多拷貝形式存在，平均可達(dá)數(shù)百個(gè)拷貝，肝臟細(xì)胞可達(dá)數(shù)千個(gè)拷貝。因此，動(dòng)物線粒體基因影響廣泛，同時(shí)具有高突變率等特點(diǎn)，其突變速率為單拷貝核DNA的5～10倍，被廣泛用于動(dòng)物起源進(jìn)化、物種鑒定、疾病診斷、衰老及動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀的核外基因效應(yīng)研究[8]。目前我國的蘇蕊、楊鐘[9]等已有對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊線粒體基因組序列測定以用來的起源、進(jìn)化、不同類群的分化以及特定遺傳特性形成機(jī)制。陳曉勇等則對(duì)小尾寒羊線粒體基因組遺傳變異分析進(jìn)行了探索與研究并為mtDNA多態(tài)性與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)分析及核外遺傳效應(yīng)研究提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)[8]。故可通過對(duì)這一類DNA變異的研究來探討群體間的親緣關(guān)系。而一般觀點(diǎn)認(rèn)為家綿羊可能的祖先是亞洲和歐洲的摩弗倫羊（Ovismusimon）羱羊（Capraibex）阿卡爾羊（Ovisorientalis）等幾個(gè)野生綿羊種[10]。張麗娟[11]等的研究認(rèn)為綿羊最初的馴化地只可能在亞洲，并且中國綿羊至少具有兩種不同的母系起源。

本研究對(duì)甘肅地區(qū)的大尾羊綿羊品種的線粒體Cytb基因（Cytochrome b gene）進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的擴(kuò)增序列與在GenBank上下載的國內(nèi)外其他綿羊品種的Cytb基因的擴(kuò)增序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，探討種群之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，對(duì)研究甘肅地區(qū)的綿羊品種起源以及對(duì)綿羊品種的保護(hù)和利用有著一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

甘肅永靖某羊場采集大尾羊耳緣肌肉組織樣本（n=6，DL1-DL6）。樣本置于1∶1配比的100%乙醇與生理鹽水組織保存液中待后續(xù)使用。

1.2 基因組擴(kuò)增

使用Gentra Puregene extraction kit（Gentra Systems Inc.）從動(dòng)物組織中提取高純度、高分子量的基因組DNA。并參照已發(fā)表的綿羊cytb基因序列設(shè)計(jì)引物，由寶生物工程（大連）公司合成。引物序列、退火溫度及產(chǎn)物大小見表1。

取上、下游引物各0.5 ul，濃度為（10 mM）；DNA樣品（50 ng/ul）2 ul，并添加PremixTaq（Takara）的量為12.5 ul，濃度為5U/ul；最后補(bǔ)加9.5 ul的無菌水，得到最終的25 ul的反應(yīng)體系。

表1 引物信息

將制備的反應(yīng)體系置于PCR儀器中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72℃延伸10 min，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.4%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像儀上檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理及進(jìn)化樹的建立

將大尾羊的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至天啟基因生物科技有限公司（甘肅蘭州）進(jìn)行測序，使用Geneious11.0.4處理測序所得原始AB1文件，人工校對(duì)后得到樣品序列，并從GenBank上下載國內(nèi)外綿羊品種的cytb基因序列見表2（n=22），使用Geneious11.0.4比對(duì)并處理序列。

使用MEGA-X建立進(jìn)化樹前先進(jìn)行遺傳距離算法模型分析，在MODEL中使用Find Best DNA/Protein Models（ML）來選擇在建立ML樹時(shí)應(yīng)選擇的遺傳距離算法模型。

建立進(jìn)化樹時(shí)，選擇盤羊Ovisammon作為外群。使用MEGA-X中的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構(gòu)建ML樹；鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建NJ樹。ML樹參數(shù)為1 000次Bootstrap重復(fù)，模型分析中所得最佳的方法計(jì)算遺傳距離；NJ樹參數(shù)為1 000次Bootstrap重復(fù)，p-distance法計(jì)算遺傳距離。

表2 從GenBank上下載的國內(nèi)外綿羊品種的cytb基因序列

圖1 遺傳距離算法模型計(jì)算結(jié)果

2 結(jié)果

將實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果交由公司測序，各個(gè)樣品最終序列大小均在900～1 020 bp之間，經(jīng)Geneious11.0.4人工校對(duì)并與國內(nèi)外cytb基因序列比對(duì)處理后大小為964 bp。

在遺傳距離算法模型分析中，具有最低BIC分?jǐn)?shù)（貝葉斯信息標(biāo)準(zhǔn)）的模型被認(rèn)為是描述替換模式的最佳模型。對(duì)于每個(gè)模型，還給出了AICC值（Akaike信息準(zhǔn)則，修正）最大似然值（LNL）和參數(shù)數(shù)量（包括分支長度）。

為了估計(jì)ML值，自動(dòng)計(jì)算了樹形拓?fù)?。這項(xiàng)分析涉及31個(gè)核苷酸序列，數(shù)據(jù)集中共有964個(gè)職位，最終由所得圖1中可以得出，最低BIC分?jǐn)?shù)的模型為HKY模型。

利用ML法及NJ法，經(jīng)過Bootstrap自舉檢驗(yàn)1 000次可得如圖2、圖3兩個(gè)進(jìn)化樹，其中盤羊是選取的外群，這兩種建樹方法能夠較好地區(qū)分外群，并且兩種建樹方法所得ML樹與NJ樹的結(jié)構(gòu)基本相似。

圖2 基于線粒體Cytb基因構(gòu)建的NJ樹

如圖2所示，從構(gòu)建的NJ樹中可以看出樣本DL4、DL5距離近，與烏拉藏羊、烏拉黑羊、吐魯番黑羊、葉城羊、察庫爾干羊等10個(gè)品種聚為一支，它們的親緣關(guān)系較為密切；樣本DL1、DL2距離近，與薩赫勒羊、賈倫克羊、普拉門卡羊、庫伊布斯科夫羊、烏德穆爾提安羊等10個(gè)品種親緣關(guān)系較為密切，聚為一支；樣品DL3和DL6在同一分支，但兩者之間仍具有一定的親緣距離，并且相較于樣本DL1、DL2、DL4、DL5及其他近緣種羊的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；盤羊?qū)儆谕馊?，與前幾者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 基于線粒體Cytb基因構(gòu)建的ML樹

如圖3所示，從構(gòu)建的ML樹中可以看出樣本DL1、DL2距離近，與圖申羊、卡拉迪羊、奧帕里諾羊、漢中羊、賈倫克羊等10個(gè)品種聚為一支，其親緣關(guān)系較為密切；可以看出樣本DL4、DL5距離近，與烏拉黑羊、烏拉藏羊、哈姆達(dá)尼羊、巴什貝羊、巴音布魯克羊等10個(gè)品種親緣關(guān)系較為密切，聚為一支，且樣本DL1、DL2、DL4、DL5之間親緣關(guān)系較近并與其他近緣種羊有著較為密切的關(guān)系；樣品DL3和DL6在同一分支，但兩者之間仍具有一定的親緣距離，且與其他樣本的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；盤羊仍是明顯的外群，與前幾者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

根據(jù)本文構(gòu)建的進(jìn)化樹可以分析得出，樣本DL1、DL2與同支上的10種羊親緣關(guān)系密切，可能是因?yàn)檫@兩個(gè)樣本羊與這12種羊存在基因流；DL4、DL5與同支的10種羊親緣接近也可能是類似的原因。同時(shí)，本研究中使用的樣本與文獻(xiàn)中已發(fā)表的大尾羊樣本（序列號(hào)KF938335.1）并未聚在一支，表明現(xiàn)存大尾羊可能存在較為嚴(yán)重的雜交情況，為大尾羊的純種保護(hù)提出了挑戰(zhàn)。

值得注意的是，樣品DL3和DL6在130bp、251bp、316bp、319bp、399bp、736bp、862bp這幾個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)了單核苷酸變異，導(dǎo)致其與其他大尾羊樣本遺傳差異較大。除此以外樣本DL3在619bp、658bp這兩處位點(diǎn)也出現(xiàn)了單核苷酸變異而樣品DL6則沒有，且兩者在736bp、399bp、316bp、251bp的單核苷酸變異程度并不一致，從而導(dǎo)致這兩個(gè)樣本之間產(chǎn)生差距。樣品DL3和DL6于cytb基因上發(fā)現(xiàn)的單核苷酸變異，在本研究使用的其他樣本中并未出現(xiàn)。這些變異出現(xiàn)的原因，以及其是否與本土其他綿羊品種存在雜交情況，仍需進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)甘肅地區(qū)的大尾羊綿羊品種的線粒體基因cytb進(jìn)行擴(kuò)增測序并對(duì)其基因組成進(jìn)行分析，初步構(gòu)建了與其他國內(nèi)外羊的系統(tǒng)進(jìn)化樹，研究就基于cytb線粒體基因?qū)⒏拭C地區(qū)的主要地方綿羊品種蘭州大尾羊與國內(nèi)外部分綿羊品種進(jìn)行了比較，來探討種群之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，這對(duì)蘭州大尾羊品種起源提供了理論依據(jù)，并對(duì)研究甘肅地區(qū)的綿羊品種起源以及綿羊品種的保護(hù)和利用有著一定的意義。