史艷彬,蔣樹艷,邵小光

(大連市婦女兒童醫(yī)療中心 生殖與遺傳醫(yī)學(xué)中心，大連 116000)

輔助生殖技術(shù)治療男性因素不育或常規(guī)體外受精失敗時(shí)所使用的卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技術(shù)最理想的情況是選擇支持高受精率和胚胎良好發(fā)育的精子細(xì)胞，即成熟、有活力、高DNA完整性和結(jié)構(gòu)健全[1]。在ICSI中，常規(guī)的精子選擇是基于低倍鏡(光學(xué)放大倍率為200～400倍)下的運(yùn)動性和大體形態(tài)[2]。2002年，Bartoov等[3]提出的運(yùn)動精子細(xì)胞器形態(tài)學(xué)檢查(motile sperm organelle morphology examination，MSOME)是一種無創(chuàng)性的檢測活動精子的方法，其使用大于6000倍的微分干涉對比(differential interference contrast，DIC)光學(xué)系統(tǒng)，可獲得更好的精子頭部三維視圖，進(jìn)而行胞漿內(nèi)形態(tài)選擇精子注射(intracytoplasmic morphologically selected sperm injection,IMSI)[4]，其選擇標(biāo)準(zhǔn)包括精子的頂體、染色體后板、頸部、線粒體、尾部和細(xì)胞核等六種亞細(xì)胞器。通過分析精子微小形態(tài)學(xué)指標(biāo)對精子進(jìn)行選擇是輔助生殖技術(shù)的又一個(gè)挑戰(zhàn)。有研究認(rèn)為，IMSI是一種新的技術(shù)，增加了治療成本，且沒有任何有效的證據(jù)證明其有效性和安全性[5]。因此，鑒別個(gè)體化精子亞細(xì)胞形態(tài)是否必要，精子形態(tài)與染色體完整性的關(guān)系一直是業(yè)界研究的熱點(diǎn)問題。本研究在染色體水平研究精子形態(tài)對胚胎發(fā)育的影響，進(jìn)而探討IMSI在輔助生殖領(lǐng)域的有效性和安全性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2016年5月至2017年5月于大連市婦女兒童醫(yī)療中心生殖門診就診并接受植入前遺傳學(xué)檢測的83個(gè)周期患者，按其受精方式隨機(jī)分為IMSI組(n=48)和ICSI組(n=35)，IMSI組、ICSI組分別成功活檢囊胚144個(gè)和98個(gè)。入組條件：年齡≥38歲；雙方染色體無異常；僅男性因素不孕或合并輸卵管因素；至少2個(gè)四級囊胚(4CC除外)；移植日子宮內(nèi)膜≥7mm；患者充分知情同意。排除條件：合并子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、子宮腺肌癥、宮腔粘連、子宮內(nèi)膜息肉、卵巢早衰、子宮畸形、生殖道感染、不明原因不孕等疾病的患者；女方內(nèi)分泌檢查異常，如甲狀腺功能異常、黃體功能異常、多囊卵巢綜合征(polycystics ovary syndrome，PCOS)、高泌乳素血癥(prolactinemia，PRL)、糖尿病等；女方全身性疾病，如TORCH陽性、嚴(yán)重感染高熱疾病、慢性消耗性疾病、重度貧血或心力衰竭、肝腎疾病、高血壓疾病等；女方免疫學(xué)檢查異常；女方吸煙、酗酒、吸毒。

1.2 超促排卵方案及取卵 患者采用長方案或拮抗劑方案。長方案：患者于月經(jīng)第3天開始口服炔雌醇環(huán)丙孕酮片，1片/d，共21d(拜耳醫(yī)藥)。口服炔雌醇環(huán)丙孕酮片第16天加用短效曲普瑞林(德國輝凌)0.1mg/d，達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)：子宮內(nèi)膜厚度<5mm；卵泡生成激素(FSH)<5IU/L、黃體生成激素(LH)<5IU/L、雌二醇(E2)<30ng/L。卵泡直徑4～7mm后開始用重組人促卵泡激素(默克Serono公司)啟動。拮抗劑方案：月經(jīng)第3天用重組人促卵泡激素(默克Serono公司)啟動，主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)12mm時(shí)加用思則凱(默克Serono公司)0.25mg/d至HCG日。通過超聲技術(shù)和外周血雌二醇水平監(jiān)測卵泡生長情況，至少有2個(gè)以上主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)18mm時(shí)注射人絨毛膜促性腺激素(HCG，中國麗珠)刺激卵泡最終成熟，36h后經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下取卵。卵冠丘復(fù)合物孵育4～6h后剝除顆粒細(xì)胞，待行IMSI或ICSI。

1.3 精液優(yōu)化 患者丈夫禁欲2～5天，取自慰后的新鮮精液樣本，收集于無菌容器，37℃培養(yǎng)箱液化30min。精液液化后經(jīng)非連續(xù)密度梯度離心法(美國SAGE，ART-2024)300g力離心12～15min，上游處理優(yōu)化精液，待用。

1.4 精子形態(tài)分析及挑選 應(yīng)用LeicaDIC顯微鏡(AM6000)，使用浸鏡油在100×物鏡下實(shí)時(shí)對活動精子進(jìn)行形態(tài)分析。正常形態(tài)精子表現(xiàn)為細(xì)胞光滑、對稱、橢圓形，并具有正常的頂體、精子頭部、頸部、尾部及線粒體，同時(shí)精子頭部無明顯細(xì)胞質(zhì)液滴或細(xì)胞漿存在。對頭部有空泡的精子拍照并測量空泡直徑。A級精子：不含空泡；B級精子：含有1～2個(gè)小空泡(空泡直徑<1μm)；C級精子：含有2個(gè)以上小空泡；D級精子：含有1個(gè)及以上的大空泡(空泡直徑≥1μm)(圖1)。選取A和B級，且尾部中段形態(tài)均正常的精子按常規(guī)ICSI流程進(jìn)行注射。所有精子分析由同一操作人員完成。

圖1 精子頭部形態(tài)(Leica 100×油鏡，DIC，NA 1.30)

1.5 囊胚培養(yǎng)、活檢及細(xì)胞二代測序 正常受精卵放至G1-PLUS和G2-PLUS培養(yǎng)液(瑞典，Vitrolif)中培養(yǎng)至四級囊胚(4CC除外)，激光活檢5～10個(gè)囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞，利用植入前胚胎染色體非整倍體檢測試劑盒(北京貝瑞何康生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增后進(jìn)行二代測序?；顧z后的囊胚冷凍。

1.6 胚胎移植及妊娠結(jié)局 第一周期依據(jù)胚胎形態(tài)學(xué)解凍一枚囊胚進(jìn)行移植，并揭盲患者PGT-A結(jié)果；此后移植周期依據(jù)PGT-A結(jié)果。移植后第14天測定血清β-HCG濃度監(jiān)測妊娠，移植后4～6周陰道B超下出現(xiàn)孕囊和胎心確定臨床妊娠。妊娠12周行無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(noninvasive prenatal testing，NIPT),妊娠17周行羊水胎兒脫落細(xì)胞核型分析。

2 結(jié) 果

2.1 一般臨床資料 IMSI組和ICSI組患者的年齡、不孕年限、不孕類型、ART次數(shù)、基礎(chǔ)內(nèi)分泌、竇卵泡數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 IMSI組和ICSI組患者的一般臨床資料比較

2.2 實(shí)驗(yàn)室情況比較 IMSI組和ICSI組患者的精液參數(shù)(平均精液體積、精子密度、精子活率、MSOME法評估的A+B級精子細(xì)胞比例)、平均獲卵數(shù)、MII卵數(shù)、2PN數(shù)、受精率、卵裂率及囊胚形成率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IMSI組的優(yōu)胚率顯著高于ICSI組(P<0.05)(表2)。

表2 IMSI組和ICSI組患者實(shí)驗(yàn)室情況比較

2.3 PGT-A結(jié)果與妊娠結(jié)局比較 IMSI組的胚胎非整倍體率低于ICSI組，臨床妊娠率高于ICSI組，妊娠組非整倍體率低于ICSI組，早期流產(chǎn)率低于ICSI組，活產(chǎn)率低于ICSI組，新生兒體重高于ICSI組，男嬰率低于ICSI組，出生后1min Apgar評分高于ICSI組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 IMSI組和ICSI組患者PGT-A結(jié)果與妊娠結(jié)局比較

3 討 論

ICSI時(shí)評估單條精子的形態(tài)與受精、胚胎質(zhì)量、妊娠結(jié)局有很好的相關(guān)性[6]。IMSI技術(shù)可對活動精子進(jìn)行實(shí)時(shí)的亞細(xì)胞水平的形態(tài)分析，檢測到胚胎學(xué)家認(rèn)為形態(tài)“正常”的活動精子中的小細(xì)胞器畸形，既彌補(bǔ)了常規(guī)ICSI在精子形態(tài)學(xué)篩選中的不足，也避免了一些傳統(tǒng)精子質(zhì)量評估方法無法與ICSI同時(shí)進(jìn)行的問題[7]。有研究結(jié)果提示，在IMSI中，正常細(xì)胞比例越低，妊娠率越高。這一明顯矛盾的一個(gè)解釋是，MSOME中正常細(xì)胞百分比較低的患者需在超放大鏡下進(jìn)行更廣泛的搜索，以找到最高質(zhì)量的精子細(xì)胞；而正常細(xì)胞比例較高的患者因有足夠的正常精子受精，因此他們不能從廣泛的研究中獲益[8]。本研究通過比較男性因素不孕患者IMSI和ICSI來源胚胎的實(shí)驗(yàn)室和臨床結(jié)局，以探討IMSI技術(shù)是否有益。

IMSI中選擇無空泡精子能否提高受精率、卵裂率及囊胚形成率，尚無定論[9-11]。多項(xiàng)研究表明，精子頭部空泡與精子DNA的異常染色質(zhì)包裝密切相關(guān)[12]。與無空泡精子相比，有空泡精子的精子DNA和染色體的完整性受到損害[13]。在ICSI中使用攜帶空泡的異常精子時(shí)，胚胎的非整倍體或精子中的DNA損傷會導(dǎo)致胚胎發(fā)育的延遲[14]。因此，在理論上，使用IMSI可使男性不育和胚胎發(fā)育不良的不育夫婦獲得遺傳正常胚胎發(fā)育和臨床結(jié)果的幾率更高。本研究中IMSI組的優(yōu)胚率顯著高于ICSI組，提示有空泡的精子對胚胎的早期發(fā)育有一定影響；兩組的2PN受精率、卵裂率及囊胚形成率無顯著差異(P>0.05)。原因可能是本研究樣本量較小，且兩組MSOME法評估的A+B級精子差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究結(jié)果顯示，IMSI組胚胎的非整倍體率低于ICSI組，臨床妊娠率高于ICSI組，早期流產(chǎn)率低于ICSI組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？赡苁且騃CSI組患者的精子細(xì)胞空泡數(shù)量和面積較小，這部分精子的染色體或DNA損傷較小，胚胎有能力對其進(jìn)行修復(fù)。本研究為回顧性設(shè)計(jì)，樣本量過小，本研究結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證，精子頭部空泡的實(shí)質(zhì)及其對妊娠結(jié)局的影響有待進(jìn)一步研究。

目前，沒有證據(jù)表明IMSI會增加先天性畸形[15-18]。本研究結(jié)果顯示，IMSI與ICSI的活產(chǎn)率無顯著差異?？赡茉?yàn)?，與ICSI相比，IMSI技術(shù)更耗時(shí)，可能由于暴露時(shí)間增加而激發(fā)了配子中的氧化應(yīng)激機(jī)制[19-20]。后續(xù)研究中應(yīng)不斷優(yōu)化IMSI技術(shù)，并將配子的氧化應(yīng)激源降至最低。本研究ICSI組中，揭盲前移植了1枚PGT-A非整倍體胚胎(chr16:1-903547531)，但NIPT和羊水胎兒脫落細(xì)胞核型檢查結(jié)果提示均正常，最后正常活產(chǎn)，推測這枚胚胎可能是嵌合體胚胎，且嵌合細(xì)胞數(shù)比例較小。

綜上所述，精子形態(tài)評價(jià)在輔助生殖領(lǐng)域的重要性日益受到重視。在顯微受精技術(shù)中，選擇高質(zhì)量的活動精子對提高胚胎質(zhì)量至關(guān)重要，但使用哪種技術(shù)進(jìn)行最佳精子選擇，目前仍有爭議。本結(jié)果未提示IMSI可改善助孕結(jié)局。IMSI技術(shù)的優(yōu)化及受益人群的選擇可能是未來研究的一個(gè)方向。